Erkrankungen des Herz-Kreislauf-Systems stellen die mit Abstand häufigste Todesursache weltweit dar und unter den zahlreichen Erkrankungen spielt u.a. die Herzinsuffizienz eine wichtige Rolle. Eine der Hauptursachen für die Entstehung einer Herzinsuffizienz ist die dilatative Kardiomyopathie (DCM), die als Herzmuskelerkrankung durch eine Erweiterung der Herzkammern und eine systolische Funktionsstörung charakterisiert ist. Aufgrund der Vielzahl an Genen und Genvarianten, die mittlerweile als DCM-assoziiert identifiziert werden konnten, ist es interessant die Wechselwirkung verschiedener Gene genauer zu untersuchen. In dieser Arbeit wird die Rolle von NEXN genauer betrachtet und in Zusammenhang mit der Expression von unterschiedlichen Genen des Kalziumhaushaltes gesetzt. NEXN wurde erstmals 2009 von der Arbeitsgruppe um Hassel und anderen in einen Zusammenhang mit der DCM gebracht. Später wurde die Rolle von Nexilin mittels eines konventionellen Knock-outs im Mausmodell genauer untersucht, führte aber zu einer sehr frühen Sterblichkeit der Mäuse. Um dem humanen Krankheitsbild näher zu kommen, wurden in dieser Arbeit Mäuse untersucht, in denen der konditionelle Cre-loxP Knock-out von NEXN spezifisch nur in den Kardiomyozyten erfolgt war. Zunächst wurde die verringerte Expression von Nexilin in diesen Mäusen im Vergleich zum Wildtyp mittels Western Blot nachgewiesen. Dann wurde mittels verschiedener Färbungen von Herzschnitten die Entwicklung einer DCM mit fortschreitendem Alter durch den Vergleich von 12 und 56 Wochen alten Mäusen betrachtet. Es ist bekannt, dass bei Herzmuskelerkrankungen wie der DCM die Regulation des Kalziumhaushaltes eine wichtige Rolle spielt. Aus diesem Grund wurden Expressionsanalysen von Proteinen des Kalziumhaushaltes auf mRNA-Ebene durchgeführt. Dabei konnte festgestellt werden, dass der konditionelle Knock-out von Nexilin im Allgemeinen eine geringe Hochregulierung der Expression dieser Proteine bedingt. Ferner wurde beobachtet, dass sich das Expressionsverhalten mit fortschreitendem Alter ändert und sich bei Proteinen für die Regulation des Kalziumeinstroms von denen zur Regulation des Kalziumausstroms unterscheidet. Die Ergebnisse konnten leider nicht auf Proteinebene bestätigt werden, weil es in der gegebenen Zeit nicht gelungen war den Western Blot für die vorliegende Fragestellung zu optimieren. Die erhobenen Daten sind daher präliminiert und werden in der Arbeitsgruppe weiter validiert.
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1.1. Dilatative Kardiomyopathie
1.2. Nexilin
1.3. Cre-loxP Gen-Knockdown
1.4. Die Rolle von Kalzium bei der Muskelkontraktion
1.5. Proteine des Kalziumhaushaltes
1.6. Zielsetzung der Arbeit
2. Material
2.1. Biologisches Material
2.2. Chemisches Material
2.3. Technisches Material
3. Methoden
3.1. Hämotoxylin-Eosin-Färbung
3.2. Kollagen-Trichrom-Färbung
3.3. RNA-Isolation aus Geweben
3.4. Reverse Transkription
3.5. Polymerase Kettenreaktion (PCR) & Quantitative real-time PCR (qPCR)
3.6. Agarose-Gelelektrophorese
3.7. Proteinisolation aus Geweben
3.8. Proteinbestimmung nach Lowry
3.9. Western Blot
3.10. Coomassie Färbung
3.11. Ponceau-Färbung
4. Ergebnisse
4.1. Übersicht des gewählten Probensets
4.2. Nachweis eines reduzierten Nexilin Proteinlevels
4.3. Färbungen
4.4. Quantitative real-time PCR
4.5. Western Blot
5. Diskussion
6. Fazit und Ausblick
Zielsetzung & Themen
Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung der Expression ausgewählter Gene des Kalziumhaushaltes in einem konditionellen Nexilin-Knock-out Mausmodell, um mögliche Zusammenhänge zwischen Nexilin-Defekten, dilatativer Kardiomyopathie und veränderter Kalziumregulation zu identifizieren.
- Untersuchung des Genexpressionsmusters im konditionellen Nexilin Cre-loxP Knock-out Mausmodell
- Vergleich der Herzstruktur bei Mäusen im Alter von 12 und 56 Wochen mittels histologischer Färbungen
- Expressionsanalyse von Genen des Kalziumhaushaltes mittels real-time PCR (qPCR)
- Versuch der Bestätigung der Expressionsänderungen auf Proteinebene mittels Western Blot
Auszug aus dem Buch
1.1. Dilatative Kardiomyopathie
Herz-Kreislauf-Erkrankungen haben weltweit eine große Bedeutung und stellen die mit Abstand häufigste Todesursache dar. Sie sind z.B. in den USA für einen aus drei Todesfällen verantwortlich, spielen aber auch in Entwicklungsländern eine immer größer werdende Rolle. Unter Herz-Kreislauf-Erkrankungen versteht man eine ganze Reihe von Erkrankungen, die mit Störungen des Herz- und Gefäßsystems zusammenhängen. Die bekanntesten sind Schlaganfall, koronare Herzerkrankungen und Herzinsuffizienz (World Health Organization; Mozaffarian, et al., 2016).
Einer der Hauptauslöser für Herzinsuffizienz sind die Kardiomyopathien. Kardiomyopathien bezeichnen allgemein Erkrankungen des Myokards, welche durch einen strukturell und funktionell veränderten Herzmuskel charakterisiert sind und dessen Ursache nicht in anderen Erkrankungen liegen, die die beobachteten Veränderungen des Myokards verursachen könnten. Dabei unterscheidet man zwischen vier Untergruppen der Kardiomyopathien: die restriktive, die arrhythmogene rechtsventrikuläre, die hypertrophe und die dilatative Kardiomyopathie (engl. dilated cardiomyopathy; DCM) (Favalli, Serio, Grasso, & Arbustini, 2016).
Die dilatative Kardiomyopathie ist die am häufigsten vorkommende Form der Kardiomyopathie und wird charakterisiert durch eine Erweiterung des Herzens durch Dilatation des linken Ventrikels (LV) und oft auch der anderen Herzkammern, wie in Abbildung 1 dargestellt. Dabei wird die Funktion des LV erheblich beeinträchtigt, ebenso wie die systolische Herzfunktion. Bisher lagen Schätzungen für die Prävalenz der DCM in den USA bei 1 in 2500-3000. Es wird jedoch erwartet, dass die Zahl der diagnostizierten Erkrankungen durch neue Analyseverfahren in Zukunft steigen wird und es somit mehr Krankheitsfälle gibt als bisher geschätzt. Des Weiteren ist die Prävalenz der DCM abhängig von Geschlecht, Alter und ethnischer Zugehörigkeit. Sie liegt für Männer höher und nimmt mit zunehmendem Alter zu (Maron, et al., 2006).
Zusammenfassung der Kapitel
1. Einleitung: Einführung in die Thematik der dilatativen Kardiomyopathie, die Rolle von Nexilin, das Cre-loxP System sowie die Bedeutung der Kalzium-Homöostase für die Herzmuskelfunktion.
2. Material: Auflistung der verwendeten biologischen Materialien, Enzyme, Oligonukleotide, Chemikalien, Puffer und technischen Geräte.
3. Methoden: Detaillierte Beschreibung der experimentellen Verfahren wie histologische Färbungen, RNA-Isolation, Reverse Transkription, qPCR, Gelelektrophorese und Western Blot.
4. Ergebnisse: Darstellung der Versuchsdaten, einschließlich der Charakterisierung des Probensets, der histologischen Untersuchung der Herzschnitte und der Expressionsanalyse der Zielgene mittels qPCR.
5. Diskussion: Interpretation der Ergebnisse im Kontext der DCM-Entwicklung und Analyse der methodischen Herausforderungen bei der Validierung auf Proteinebene.
6. Fazit und Ausblick: Zusammenfassung der wichtigsten Erkenntnisse über Nexilin-induzierte DCM und Empfehlungen für weiterführende Studien.
Schlüsselwörter
Dilatative Kardiomyopathie, DCM, Nexilin, NEXN, Cre-loxP, Mausmodell, Kalziumhaushalt, Genexpression, qPCR, Western Blot, Kardiomyozyten, Herzinsuffizienz, Sarkomer, RyR2, Cav1.2
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Bachelorarbeit grundsätzlich?
Die Arbeit untersucht den Einfluss einer Nexilin-bedingten dilatativen Kardiomyopathie auf die Expression von Genen des Kalziumhaushaltes im Mausmodell.
Was sind die zentralen Themenfelder der Studie?
Die zentralen Themen umfassen die kardiovaskuläre Forschung, die molekulare Genetik (speziell Gen-Knockout-Methoden), die Herzphysiologie und die Regulation des Kalziumstoffwechsels in Kardiomyozyten.
Was ist das primäre Ziel oder die Forschungsfrage?
Es soll geklärt werden, ob ein herzspezifischer Nexilin-Knock-out bei Mäusen das Expressionsmuster von Kalzium-regulierenden Proteinen verändert und ob dies mit der Entwicklung einer dilatativen Kardiomyopathie korreliert.
Welche wissenschaftliche Methode wurde zur Analyse verwendet?
Die Hauptmethode war die quantitative real-time PCR (qPCR) zur Bestimmung der mRNA-Expression. Ergänzend wurden histologische Färbungen und Western-Blot-Analysen durchgeführt.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Der Hauptteil gliedert sich in eine ausführliche Einleitung zu den theoretischen Grundlagen, eine detaillierte Beschreibung der verwendeten Materialien und Methoden sowie die Präsentation und kritische Diskussion der erzielten Ergebnisse.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Die Arbeit ist durch Begriffe wie Dilatative Kardiomyopathie, Nexilin, Cre-loxP, Kalziumhaushalt, qPCR und Kardiomyozyten definiert.
Warum konnte die Western-Blot-Analyse die mRNA-Ergebnisse nicht bestätigen?
Methodische Schwierigkeiten bei der Detektion der Zielproteine und der Haushaltsgene sowie eine unklare Probenqualität führten dazu, dass trotz umfangreicher Optimierungsversuche keine aussagekräftigen Daten auf Proteinebene erhoben werden konnten.
Deuten die Ergebnisse auf eine altersabhängige Entwicklung der Krankheit hin?
Ja, die Studie beobachtete insbesondere bei den Genen RyR2 und Cav1.2 eine Zunahme der Hochregulierung ab einem Alter von 24 Wochen, was mit dem Fortschreiten der DCM korreliert.
- Arbeit zitieren
- Alexandra Hilfer (Autor:in), 2016, Expressionsanalyse von Genen des Kalziumhaushaltes in einem konditionellen Nexilin Knock-out Mausmodell, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/490061
