Expressionsanalyse von Genen des Kalziumhaushaltes in einem konditionellen Nexilin Knock-out Mausmodell

Inhalt

Zusammenfassung

Abstract

1. Einleitung
1.1. Dilatative Kardiomyopathie
1.2. Nexilin
1.3. Cre-loxP Gen-Knockdown
1.4. Die Rolle von Kalzium bei der Muskelkontraktion
1.5. Proteine des Kalziumhaushaltes
1.6. Zielsetzung der Arbeit

2. Material
2.1. Biologisches Material
2.2. Chemisches Material
2.3. Technisches Material

3. Methoden
3.1. Hämotoxylin-Eosin-Färbung
3.2. Kollagen-Trichrom-Färbung
3.3. RNA-Isolation aus Geweben
3.4. Reverse Transkription
3.5. Polymerase Kettenreaktion (PCR) & Quantitative real-time PCR (qPCR)
3.6. Agarose-Gelelektrophorese
3.7. Proteinisolation aus Geweben
3.8. Proteinbestimmung nach Lowry
3.9. Western Blot
3.10. Coomassie Färbung
3.11. Ponceau-Färbung

4. Ergebnisse
4.1. Übersicht des gewählten Probensets
4.2. Nachweis eines reduzierten Nexilin Proteinlevels
4.3. Färbungen
4.4. Quantitative real-time PCR
4.5. Western Blot

5. Diskussion

6. Fazit und Ausblick

7. Abkürzungsverzeichnis

8. Abbildungsverzeichnis

9. Tabellenverzeichnis

10. Quellenverzeichnis
10.1. Literaturverzeichnis
10.2. Internetquellen

11. Anhang

Zusammenfassung

Erkrankungen des Herz-Kreislauf-Systems stellen die mit Abstand häufigste Todesursache weltweit dar und unter den zahlreichen Erkrankungen spielt u.a. die Herzinsuffizienz eine wichtige Rolle. Eine der Hauptursachen für die Entstehung einer Herzinsuffizienz ist die dilatative Kardiomyopathie (DCM), die als Herzmuskelerkrankung durch eine Erweiterung der Herzkammern und eine systolische Funktionsstörung charakterisiert ist. Aufgrund der Vielzahl an Genen und Genvarianten, die mittlerweile als DCM-assoziiert identifiziert werden konnten, ist es interessant die Wechselwirkung verschiedener Gene genauer zu untersuchen. In dieser Arbeit wird die Rolle von NEXN genauer betrachtet und in Zusammenhang mit der Expression von unterschiedlichen Genen des Kalziumhaushaltes gesetzt. NEXN wurde erstmals 2009 von der Arbeitsgruppe um Hassel und anderen in einen Zusammenhang mit der DCM gebracht. Später wurde die Rolle von Nexilin mittels eines konventionellen Knock-outs im Mausmodell genauer untersucht, führte aber zu einer sehr frühen Sterblichkeit der Mäuse. Um dem humanen Krankheitsbild näher zu kommen, wurden in dieser Arbeit Mäuse untersucht, in denen der konditionelle Cre-loxP Knock-out von NEXN spezifisch nur in den Kardiomyozyten erfolgt war. Zunächst wurde die verringerte Expression von Nexilin in diesen Mäusen im Vergleich zum Wildtyp mittels Western Blot nachgewiesen. Dann wurde mittels verschiedener Färbungen von Herzschnitten die Entwicklung einer DCM mit fortschreitendem Alter durch den Vergleich von 12 und 56 Wochen alten Mäusen betrachtet. Es ist bekannt, dass bei Herzmuskelerkrankungen wie der DCM die Regulation des Kalziumhaushaltes eine wichtige Rolle spielt. Aus diesem Grund wurden Expressionsanalysen von Proteinen des Kalziumhaushaltes auf mRNA-Ebene durch Anwendung der real-time PCR durchgeführt. Dabei konnte festgestellt werden, dass der konditionelle Knock-out von Nexilin im Allgemeinen eine geringe Hochregulierung der Expression dieser Proteine bedingt. Ferner wurde beobachtet, dass sich das Expressionsverhalten mit fortschreitendem Alter ändert und sich bei Proteinen für die Regulation des Kalziumeinstroms von denen zur Regulation des Kalziumausstroms unterscheidet. Besondere Aufmerksamkeit wurde dabei vor allem den Proteinen RyR2 und Cav1.2 zugeteilt. Die Ergebnisse konnten leider nicht auf Proteinebene bestätigt werden, weil es in der gegebenen Zeit nicht gelungen war den Western Blot für die vorliegende Fragestellung zu optimieren. Insgesamt konnten in dieser Arbeit mit Hilfe eines guten Mausmodells erste Hinweise auf eine Änderung der Kalziumregulation durch eine Nexilin bedingte, dilatative Kardiomyopathie gezeigt werden. Die erhobenen Daten sind jedoch präliminiert und werden in der Arbeitsgruppe weiter validiert.

Abstract

Cardiovascular diseases are the most common causes of death around the world. Among these diseases heart failure plays an important role and one of its main cause is dilated cardiomyopathy (DCM). DCM affects the heart muscle leading to dilated ventricles and a systolic dysfunction. One characteristic of DCM is its multifactorial aetiology with more and more genes getting identified to be associated with the disease. Thus, there is a growing interest in further investigating the interaction of different genes. In this study the role of NEXN is examined in more detail, linking it to the expression of different genes of the calcium homeostasis. In 2009 the working group of Hassel and others was the first one to relate mutations in NEXN to DCM. Later the role of nexilin was further analyzed using a conventional knock-out mouse model. Unfortunately, knocking out of Nexilin led to an early mortality of the mice. In order to approach a better model regarding the human DCM disease, mice with conditional Cre-loxP NEXN knock-out in cardiomyocytes were used for this study. Western blot analysis was used to confirm that the expression of nexilin in these mice is actually lower than in the wild type mice. To check whether DCM evolves only later in life, heart structures of KO mice were compared to those of wildtyp mice at the age of 12 and 56 weeks. Findings indicate an existing DCM in older mice. Since it is well known that regulation of the calcium homeostasis plays an important role regarding diseases of the heart muscle such as DCM, expression of proteins of the calcium homeostasis were analyzed using real-time PCR. It was found that conditional knock-out of nexilin generally results in a slightly upregulated expression of these proteins. Furthermore, it was observed that the expression behavior changes with advanced age and differs for proteins regulating the calcium influx compared to those regulating the calcium efflux. In this respect one should especially pay greater attention to RyR2 and Cav1.2. Unfortunately, these findings could not be confirmed on protein level since it was not possible to optimize Western Blot analysis for the issue described within the given timeframe. All in all, this study revealed first evidences for an altered calcium regulation in nexilin-induced dilated cardiomyopathy by using a conditional knock-out mouse model. However, these results are preliminary and are going to be further confirmed by our working group.

1. Einleitung

1.1. Dilatative Kardiomyopathie

Herz-Kreislauf-Erkrankungen haben weltweit eine große Bedeutung und stellen die mit Abstand häufigste Todesursache dar. Sie sind z.B. in den USA für einen aus drei Todesfällen verantwortlich, spielen aber auch in Entwicklungsländern eine immer größer werdende Rolle. Unter Herz-Kreislauf-Erkrankungen versteht man eine ganze Reihe von Erkrankungen, die mit Störungen des Herz- und Gefäßsystems zusammenhängen. Die bekanntesten sind Schlaganfall, koronare Herzerkrankungen und Herzinsuffizienz (World Health Organization; Mozaffarian, et al., 2016).

Einer der Hauptauslöser für Herzinsuffizienz sind die Kardiomyopathien. Kardiomyopathien bezeichnen allgemein Erkrankungen des Myokards, welche durch einen strukturell und funktionell veränderten Herzmuskel charakterisiert sind und dessen Ursache nicht in anderen Erkrankungen liegen, die die beobachteten Veränderungen des Myokards verursachen könnten. Dabei unterscheidet man zwischen vier Untergruppen der Kardiomyopathien: die restriktive, die arrhythmogene rechtsventrikuläre, die hypertrophe und die dilatative Kardiomyopathie (engl. dilated cardiomyopathy; DCM) (Favalli, Serio, Grasso, & Arbustini, 2016).

Die dilatative Kardiomyopathie ist die am häufigsten vorkommende Form der Kardiomyopathie und wird charakterisiert durch eine Erweiterung des Herzens durch Dilatation des linken Ventrikels (LV) und oft auch der anderen Herzkammern, wie in Abbildung 1 dargestellt. Dabei wird die Funktion des LV erheblich beeinträchtigt, ebenso wie die systolische Herzfunktion. Bisher lagen Schätzungen für die Prävalenz der DCM in den USA bei 1 in 2500-3000. Es wird jedoch erwartet, dass die Zahl der diagnostizierten Erkrankungen durch neue Analyseverfahren in Zukunft steigen wird und es somit mehr Krankheitsfälle gibt als bisher geschätzt. Des Weiteren ist die Prävalenz der DCM abhängig von Geschlecht, Alter und ethnischer Zugehörigkeit. Sie liegt für Männer höher und nimmt mit zunehmendem Alter zu (Maron, et al., 2006).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1: Vergleich der Herzstruktur in Hinblick auf die Größe des rechten und linken Ventrikels beim gesunden Herzen (A), bei einer DCM (B) und bei einer hypertrophen Kardiomyopathie/HCM (C) (McNally, Golbus, & Puckelwartz, 2013)

Bei der Diagnose der DCM bedarf es der Betrachtung der multifaktoriellen Ätiologie dieser Krankheit. Als eine der Hauptursachen zählt die Myokardischämie, also die Unterversorgung des Herzmuskels mit Blut, welche etwa die Hälfte aller Krankheitsfälle begründet. Andere Ursachen sind Hypertonie und Herzklappenerkrankungen. Alle übrigen Fälle, welche nicht von den eben genannten Erkrankungen abhängen, bezeichnet man als idiopathische DCM. Hier können die Auslöser toxischer, metabolischer und immunologischer Natur sein, bei 20%-50% der Fälle kann die Ursache dagegen auf Vererbung innerhalb der Familie zurückgeführt werden. Dabei spielt vor allem die autosomal dominante Vererbung eine wichtige Rolle, aber auch andere Vererbungsmuster konnten in seltenen Fällen beobachtet werden. Somit stellen genetische Veränderungen ein wichtiges Feld bei der Untersuchung der DCM dar (Dellefave & McNally, 2010; McNally, Golbus, & Puckelwartz, 2013; Maron, et al., 2006; Luk, et al., 2009).

Zur Identifikation der vererbbaren Veränderungen des Erbguts, welche mit DCM in Zusammenhang stehen, wurden Familienstudien und genomweite Assoziationsstudien mit DCM-Patienten durchgeführt. Mittlerweile konnten mindestens 50 Gene identifiziert werden, die mit der DCM verknüpft sind. Meist führen dabei mehrere einzelne und oft auch innerhalb einer Familie sehr individuelle Mutationen in verschiedenen Genen zur Ausprägung des DCM-Phänotyps, was die Diagnostik mittels genetischen Tests erschwert (McNally, Golbus, & Puckelwartz, 2013). Trotz der Vielzahl an mit DCM in Zusammenhang stehenden Genen, lassen sich viele von ihnen in wenige Gruppen einteilen, je nach Funktion des entsprechenden Genproduktes. Eine Gruppe umfasst z.B. die Proteine der Kernhülle, wie Lamin A und Lamin C. Des Weiteren spielen die Proteine des Zytoskeletts, wie Dystrophin oder Sarkoglykane eine wichtige Rolle. Die dritte große Gruppe bilden die Proteine des Sarkomers als Grundbaustein der Muskelkontraktion. Hier ist z.B. ß-Myosin heavy chain (kodiert von MYH7) ein bekannter Vertreter. Als wichtige Untergruppe sind die Z-Scheibe Proteine zu nennen. Die Z-Scheiben bilden die lateralen Grenzen der Sarkomere und stellen eine Verankerungsstelle für Aktinfilamente und Titin dar. Sie sind durch den Kontakt zu den Myofilamenten wichtige Knotenpunkte der Kraftübertragung und regulieren damit direkt die Kontraktion und die korrekte Funktion des Herzmuskels (Frey & Kaktus, 2008; Dellefave & McNally, 2010). Unter anderem konnte das Protein Nexilin (kodiert von NEXN) als Z-Scheibe Protein identifiziert werden und es ließen sich Zusammenhänge zwischen Mutationen in NEXN und dem Auftreten von DCM feststellen (Hassel, et al., 2009), was später noch genauer erläutert werden soll.

Nicht alle mit DCM in Zusammenhang stehende Gene lassen sich in die drei genannten Gruppen einordnen. So kann sich die DCM auch aufgrund von Störungen verschiedenster Regulatorproteine, wie Kofaktoren der Transkription oder RNA-bindenden Proteinen, entwickeln. Hierbei sei aber vor allem die Rolle der Kalziumhaushalt regulierenden Proteine bzw. Ionenkanäle herauszustellen, deren Dysfunktion ebenfalls zur Entstehung einer DCM beitragen kann (Pieske, et al., 1995; Margossian, et al., 1999)

Die bedeutende Rolle der dilatativen Kardiomyopathie als eine der Hauptursachen für Herzinsuffizienz und kardiovaskuläre Sterblichkeit und die bis dato wenig erforschten Zusammenhänge in der Entstehung der Erkrankung aufgrund von verschiedenen Gendefekten, auch unter Betrachtung der Abhängigkeit von Umweltfaktoren, sprechen für den Bedarf an weiteren Untersuchungen der Ätiologie der DCM. Dabei stellt das gezielte Ausschalten von einzelnen Genen im Tiermodell, stellvertretend für den Säuger insbesondere im Mausmodell, eine gute Möglichkeit dar um den Einfluss des betreffenden Gens auf die Herzphysiologie und damit auch auf die Ausprägung des DCM Phänotyps ergründen zu können.

1.2. Nexilin

Nexilin ist ein durch das NEXN -Gen kodiertes Protein, welches zuerst als F-Aktin-bindendes Protein an Zell-Matrix Adhärenzverbindungen (engl.: adherens junctions) in Rattengehirn und -fibroblasten isoliert werden konnte. Dabei konnten zwei Isoformen identifiziert werden, welche als s- und b-Nexilin bezeichnet werden. Die kleinere Isoform s-Nexilin weist nur eine F-Aktin-Bindungsdomäne auf, während das größere b-Nexilin zwei solcher Domänen aufweist, was in einer cross-linking Aktivität dieser Form resultiert. Es wurde zudem gezeigt, dass die Fähigkeit zur F‑Aktin-Bindung durch Zugabe großer Mengen Myosin S1 verringert wird (Ohtsuka, et al., 1998).

Diese Interaktion von Nexilin mit Aktin und Myosin impliziert bereits ein gehäuftes Vorkommen des Proteins im Muskel. Dabei gelten besonders die Z-Scheiben als Verankerungsstelle für Myofilamente und damit als mechanische Integrationsstelle sowohl im Herz- als auch im Skelettmuskel (Luther, 2009). Bei Nexilin handelt es sich um eines der Schlüsselmoleküle, die den Widerstand der Z-Scheiben gegen extreme mechanische Beanspruchung bei der Kraftübertragung im Muskel ermöglichen (Hassel, et al., 2009). Untersuchungen im Zebrafisch Danio rerio haben gezeigt, dass das gezielte Ausschalten von NEXN Herzfehler verursacht, wobei die Symptomatik mit geweiteten Ventrikeln und einer reduzierten systolischen Funktion der einer dilatativen Kardiomyopathie ähnelt. Dabei beeinflusst das Fehlen von Nexilin nicht die Herz-Morphogenese oder die Assemblierung sarkomerer Strukturen. Es stört vielmehr die Erhaltung der hoch-organisierten Strukturen in den Z-Scheiben im Laufe der Zeit. Diese Veränderungen der Z-Scheiben treten dabei nur bei Muskelgewebe mit großer Arbeitsleistung auf, welche im Herzen permanent gegeben ist, in der Skelettmuskulatur dagegen nur stimuliert werden kann. Auch bei einigen an dilatativer Kardiomyopathie erkrankten Menschen konnte die Krankheitsursache auf NEXN -Mutationen zurückgeführt werden. Die drei von Hassel und anderen identifizierten Mutationen G650del, Y652C und P611T treten alle in der konservierten, C-terminalen IgCAM-Domäne des 675 Aminosäuren langen Proteins auf (Hassel, et al., 2009). Später konnten unter Nutzung von Next Generation Sequencing an DCM Patienten zehn weitere Mutationen in NEXN identifiziert werden. Diese Mutationen sind p.E110Q, p.G157V, p.G245R, p.E332A, p.T363R, p.R392*, p.E468del, p.E470Q, p.E485K und p.T666A und befinden sich alle in der kodierenden Region des Gens (Haas, et al., 2015). Bei der Durchführung eines NEXN Knock-outs im Säuger am Beispiel der Maus waren postnatal ebenfalls die DCM typischen Pathologien des Herzens, sowie eine frühe Sterblichkeit zu beobachten. Im Gegensatz zum Zebrafischmodell konnte dies jedoch nicht auf eine veränderte Z-Scheiben-Struktur zurückgeführt werden. Es zeigte sich vielmehr eine endomyokardiale Fibroelastose (EFE) durch stark erhöhte Kollagen- und Elastineinlagerungen im Endokard. Dies bildet einen Hinweis auf die Rolle von Nexilin an der Regulation der Expression anderer Proteine wie Elastin (Aherrahrou, Z. et al., 2015).

Die Beteiligung von Nexilin an der Entstehung von Kardiomyopathien führte auch zur Untersuchung des Zusammenhangs von Nexilin und hypertropher Kardiomyopathie (HCM). In diesem Fall finden sich die Veränderungen in der ersten der beiden N-terminalen Aktinbindungsdomänen oder der coiled-coil Domäne, was ebenfalls mittels Gen-Screenings an Patienten festgestellt werden konnte. Durch Funktionsverlust der Aktinbindungsdomäne ändert sich die Bindungsaffinität von Nexilin zu α‑Aktin und gleichzeitig auch die Verteilung des Proteins innerhalb der Zelle. So beobachtet man bei Mutationsträgern eine lokale Akkumulierung im Zytoplasma, anstatt der natürlichen Aggregation im Nukleus entlang des F-Aktins. Dies deutet auf eine zelluläre Funktion des Nexilins und anderer Z-Scheibe Proteine hin, die über die reine Verteilung mechanischer Kräfte entlang des Sarkomers hinausreicht. Vielmehr könnten sie auch als Anheftungspunkte für Enzyme, Ca[2]+-Signalproteine und Transkriptionsfaktoren dienen u.a. durch die Kontrolle ihrer Translokation zwischen Nukleus und Zytoplasma (Wang, et al., 2010).

Tatsächlich konnte die Rolle von Nexilin schon an einigen Signalwegen beobachtet werden. So scheint Nexilin z.B. spezifisch im Skelettmuskel als negativer Regulator der IRS1-induzierten Glukoseaufnahme durch GLUT-4-Translokation zu wirken. Entscheidend bei dieser Rolle ist die coiled-coil Domäne von Nexilin, welche für die IRS1-Bindung nötig ist. Dabei zeigte sich, dass die Reorganisation des Aktinnetzwerkes während dieses Prozesses essentiell ist, da ansonsten eine effektive Dissoziation des Nexilin/IRS1 Komplexes und damit einhergehend die Aktivierung des IRS1/PI3K/Akt Signalosoms nicht stattfinden kann (Lee, Hakuno, Northcott, Pessin, & Rozakis Adcock, 2013). Des Weiteren wird auch die Expression von Nexilin selbst durch bestimmte Zellfaktoren, wie dem Hepathozyten-Wachstumsfaktor (HGF) beeinflusst. So steigt bei einer Behandlung von Kardiomyozyten mit HGF das Nexilin Protein- und mRNA- Level in den Zellen. Interessant ist, dass diese Hochregulierung nur mit einem intakten JNK-Reaktionsweg stattfinden kann (Wang, et al., 2014).

Somit lässt sich feststellen, dass die Rolle von Nexilin über das ursprüngliche Aktin‑vernetzende Protein hinausgeht, obwohl die Interaktionen im Aktin-Myosin-Netzwerk klar die Rolle von Nexilin bei der Muskelkontraktion und vor allem beim Erhalt der sarkomeren Integrität bei starker mechanischer Beanspruchung herausstellt (Hassel, et al., 2009). Dennoch scheinen die Funktionen von Nexilin vielmehr auch eine wichtige Bedeutung bei der Signalweiterleitung und zellregulatorischen Prozessen zu erlangen (Wang et al., 2010; Lee, Hakuno, Northcott, Pessin, & Rozakis Adcock, 2013).

Zur Untersuchung der Rolle von Nexilin in der dilatativen Kardiomyopathie wurde bereits ein konstitutives NEXN Knock-out (KO) Mausmodell entwickelt, indem heterozygote Mäuse zur Produktion von Wildtyp-, heterozygoten und homozygoten KO Mäusen gekreuzt wurden. Die KO Mäuse zeigten dabei schon wenige Tage nach der Geburt klare phänotypische Merkmale einer DCM und zusätzlich auch Merkmale einer EFE. Dementsprechend zeigte sich eine frühe Sterblichkeit der jungen Mäuse, die nicht älter wurden als acht Tage (Aherrahrou, Z. et al., 2015). Somit konnte das Fortschreiten der Erkrankung mit dem Alter unter dem NEXN Knock-out nicht untersucht werden konnte, obwohl dies in Hinblick der beobachteten erhöhten Prävalenz bei älteren Menschen von besonderer Bedeutung ist. Um die Lebenserwartung der Mäuse zu erhöhen, empfiehlt es sich für weitere Untersuchungen den konditionellen, herzspezifischen NEXN Knock-out dem kompletten Fehlen des Proteins vorzuziehen. In dieser Arbeit wurde mit Herzen aus NEXN Cre-loxP Knock-out Mäusen gearbeitet.

1.3. Cre-loxP Gen-Knockdown

Es gibt verschiedene Möglichkeiten um Genmanipulationen bzw. das gezielte Ausschalten eines Gens bei Mäusen im frühen Embryonalstadium durchzuführen. Im Allgemeinen unterscheidet man zwischen transgenen Mäusen, bei denen ein Gen an einer bestimmten Stelle im Genom eingefügt wurde und den Knock-out/in Mäusen, bei denen ein Gen an seiner ursprünglichen Position im Genom verbleibt und künstlich verändert wird. Werden nun jeweils eine nach diesen beiden Methoden erzeugten Mäuse miteinander verpaart, erhält man als Kombination so genannte „Compound-Transgene“, bei denen die Expression der veränderten Gene gezielt regulierbar ist (Wink, 2011).

Eine spezielle Art eines solchen Rekombinationssystems, mit großer Bedeutung für die Erzeugung gewebespezifischer Knock-out Mäuse, stellt das Cre/lox-P Rekombinationssystem dar. In diesem System erfolgt der Austausch zwischen zwei loxP-Erkennungssequenzen durch eine Cre-Rekombinase. Dies bedeutet, dass eine spezifische DNA-Sequenz im Mausgenom, die von zwei gleichgerichteten loxP-Sequenzen flankiert ist, im Falle einer gezielten Deletion durch Cre aus dem Genom entfernt wird. Die durch diese intramolekulare Exzision entfernte Sequenz enthält, wie in Abbildung 2 dargestellt, eine der beiden ursprünglichen loxP-Sequenzen, liegt zirkulär vor und steht zum Abbau in der Zelle bereit (Lukowski, Weber, Weinmeister, Feil, & Feil, 2005).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2: Allgemeines Prinzip des Cre /loxP Rekombinationssystems zum Entfernen bzw. Einbau eines spezifischen DNA-Abschnittes.

Die angegebene Sequenz beschreibt die vollständige loxP-Sequenz, wobei das Rekombinationsereignis nur innerhalb des hervorgehobenen Bereiches, mit Schnittstellen bei den Pfeilen, erfolgt (Lukowski, et al., 2005).

Die Rekombinase Cre stammt ursprünglich aus der Bakteriophage P1 und stellt eine sequenz-spezifische Integrase dar. Das 38 kD große Protein erkennt dabei zwei 34 bp lange Konsensussequenzen. Die loxP-Stellen bestehen aus einer Kernsequenz mit 8 bp Länge (in Abbildung 2 grau gekennzeichnet), welche die Orientierung der loxP-Stelle definiert. Die Kernsequenz wird von zwei 13 bp langen palindromischen Sequenzen flankiert. An jede dieser Sequenzen bindet während des Rekombinationsereignisses jeweils ein Rekombinase-Molekül, sodass sich für die Reaktion ein Rekombinase-Tetramer bildet (Nagy, 2000).

Um Mäuse mit dem Cre/loxP-Rekombinationssystem zu generieren, muss wie oben beschrieben eine Kreuzung zweier unterschiedlich genetisch veränderter Mauslinien erfolgen. Wie in Abbildung 3 dargestellt, enthält eine dieser Linien den ausgewählten, von loxP-Sequenzen flankierten Sequenzabschnitt, wobei dieser Abschnitt an seinem ursprünglichen Genort durch homologe Rekombination modifziert wurde. Die Flanken werden dabei so ins Genom eingebaut, dass sie im Bereich der Introns liegen und sich somit der Phänotyp der modifizierten Maus nicht vom Wildtyp unterscheidet. Die zweite Mauslinie wurde durch die an zufälliger Stelle im Genom stattfindenden Integration eines Cre Transgens modifiziert. Dennoch wird durch die Auswahl des Promotors, unter dem Cre exprimiert wird, eine genaue Gewebe- und/oder Zeitspezifität für die Expression der Rekombinase festgelegt. Der große Vorteil dieser konditionalen Methode ist, dass bei den Nachkommen beider Linien der Knock-out der spezifischen DNA-Sequenz nur in jenen Zellen bzw. Geweben stattfinden kann, in denen die Cre-Rekombinase unter einem entsprechenden, spezifischen Promotor exprimiert wird. Zusätzlich zu dieser Gewebespezifität kann durch die Wahl Liganden-gesteuerter Promotoren auch eine Zeitabhängigkeit der Cre-Aktivität erreicht werden. Damit ergeben sich im Vergleich zur konventionellen, konstitutiven Knock-out Methode vielfach neue Möglichkeiten. Bei letzterer wird der ausgewählte Genabschnitt nämlich dauerhaft und im gesamten Organismus inaktiviert (Lukowski, et al., 2005).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 3: Allgemeines Schema zur Generierung einer konditionellen Gen Deletion in einer Cre-loxP-Knock-Out Maus durch die Kreuzung zweier Elternmäuse mit unterschiedlichen Mutationen. Die linke Maus trägt das Cre-Transgen mit einem gewebespezifischen Promotor X. Die rechte Maus trägt Gen Y, welches ausgeschaltet werden soll und im gesamten Organismus durch loxP-Sequenzen flankiert vorliegt. Der Nachkomme trägt beide Mutationen, sodass hier der konditionelle, X-gewebespezi-fische Knock-Out von Gen Y stattfinden kann.

(Rosenthal & Brown, 2007)

1.4. Die Rolle der Kalzium-Homöostase bei der Muskelkontraktion

Bei allen in dieser Arbeit untersuchten Proteinen handelt es sich um Kalzium-Ionenkanäle bzw. ihre Bestandteile oder Regulatoren, die alle zur Ca[2]+-Homöostase beitragen. Die Betrachtung von Proteinen, welche die Kalziumkonzentration bzw. den Kalzium-Transport in einer Muskelzelle regulieren, erscheint aufgrund der sehr bedeutenden Rolle von Ca[2]+ als Regulator des molekularen Kontraktionsprozesses im Herz- und Skelettmuskel als sehr interessant, insbesondere bei Untersuchung einer Herzmuskelerkrankung wie der dilatativen Kardiomyopathie (Solaro, 1999).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 4: Wechselwirkung zwischen Aktin und Myosin während der Muskelkontraktion mit allen daran beteiligten Faktoren, Z-Disk- und Zytoskelettbestandteilen. Hervorzuheben sei hier vor allem die Funktion von Ca2+ als Regulator des Querbrücken-zyklus durch die Interaktion mit Tropomyosin und dem Troponin-Komplex.

(Mudd & Kass, 2008)

Eine gesunde Herzmuskelfunktion kann auf molekularer Ebene nur unter einem korrekten Querbrückenzyklus ablaufen. Unter einer Querbrücke versteht man die Anlagerung eines Myosinkopfes an ein benachbartes Aktinfilament während des Kontraktionsprozesses. Das periodische Anheften und wieder Loslassen der Querbrücken an Aktin bezeichnet man als Querbrückenzyklus. Dabei kann die Bewegung der Querbrücken und die damit verbundene Kraftentwicklung im Muskel nur in Abhängigkeit von der Hydrolyse von Adenosintriphosphat (ATP) erfolgen. Die Bindung von ATP an den Myosinkopf führt zu seiner Loslösung von Aktin. Nach der ATP-Spaltung erfolgt die Ausrichtung des Myosinkopfes und die Vorbereitung zur erneuten Anlagerung an Aktin, welche nach der Abspaltung von Phosphat abgeschlossen ist. Nun kann der Kraftschlag des Myosinkopfes erfolgen, welche zu einer Bewegung der Aktinfilamente und zur Kraftentwicklung führt. Nach Abspaltung von Adenosindiphosphat (ADP) ist der Ausgangzustand erreicht. Diese Interaktion von Aktin und Myosin wird, wie in Abbildung 4 zu sehen, Kalzium-abhängig reguliert. Bei niedrigen Kalziumkonzentrationen liegt eine Hemmung der Querbrückenaktivität durch Troponin und Tropomyosin vor, indem sie die feste Anlagerung von Myosin an Aktin verhindern. Wird die zytosolische Ca[2]+‑Konzentration um das 10 bis 100-fache erhöht, bindet Ca[2]+ an den Troponin-Komplex und bewirkt dort intramolekulare Umlagerungen, was schließlich auch Konformationsänderungen des gebundenen Tropomyosins bewirkt. Der Tropomyosinstrang wird am Aktin verschoben, sodass die Bindungsstelle für Myosin zugänglich wird und der Muskel aktiv werden kann. Eine Senkung des Kalziumspiegels bewirkt die reversiblen Prozesse (Schmidt, Lang, & Heckmann, 2010). Die Regulation des Kalziumspiegels in der Muskelzelle ist somit essentiell für eine korrekte Muskelfunktion mit Wechsel aus Kontraktion und Relaxation. Diese Regulation wird durch eine Reihe unterschiedlicher Proteine erreicht, die im folgenden Kapitel genauer beschrieben werden. Ebenfalls beschrieben werden konkrete Erkenntnisse über die Zusammenhänge zwischen diesen Proteinen und der DCM.

Die Beschreibung einer korrekten bzw. gestörten Muskelfunktion spielt wie in Abschnitt 1.2. erwähnt auch bei der Untersuchung der Funktion von Nexilin eine wichtige Rolle, da bereits mehrere Zusammenhänge zwischen dem Fehlen von Nexilin und dem Auftreten von Kardiomyopathien gezeigt werden konnten (Aherrahrou et al., 2015; Hassel et al., 2009). Jedoch wurde bisher nicht analysiert, ob der Knock-out des NEXN -Genes im Mäuse-Herzen die Muskelfunktion und andere regulatorische Zellfunktionen durch die Beeinflussung des Kalziumhaushaltes verändern könnte.

1.5. Proteine des Kalziumhaushaltes

Im Folgenden erfolgt die Beschreibung der für diese Arbeit ausgewählten Proteine des Kalziumhaushaltes, deren RNA- und Proteinexpression in dieser Arbeit analysiert wird. Abbildung 5 zeigt eine Übersicht eine Herzmuskelzelle mit einigen an der Ca[2]+-Homöostase beteiligten Kanälen und Proteinen.

Abbildung 5: Übersicht mit einer Auswahl der an der Regulation des Kalziumhaushaltes in der Herzmuskelzelle beteiligten Proteine.

(H. Hinghofer-Szalkay auf http://physiologie.cc/VI.6.htm)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Ryanodinrezeptoren

Der Ryanodinrezeptor (RyR) ist ein wichtiger Akteur in der elektromechanischen Kopplung im Muskel. Darunter versteht man den Prozess, der die Erregung der Zellmembran durch das Aktionspotential über die Freisetzung von Ca[2]+ aus dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR) mit der Kontraktion der Muskelzelle koppelt. Im Herzmuskel funktioniert dies über die Ca[2]+-induzierte-Ca[2]+-Freisetzung. Mit der Plateauphase des Aktionspotentials kommt es zur Öffnung von spannungsabhängigen L-Typ Ca[2]+-Kanälen (siehe unten) in der T‑Tubulus-Membran der Kardiomyozyten, wodurch ein initialer Ca[2]+-Einstrom ins Zellinnere ausgelöst wird. Die einströmenden Ca[2]+-Ionen diffundieren bis zum Ryanodinrezeptor in der Membran des SR und bewirken die Öffnung dieses intrazellulären Ca[2]+-Kanalproteins. Durch den Ausstrom von Ca[2]+ aus dem SR steigt die zytosolische Kalziumkonzentration von ursprünglich 10-[7] mol/L im Ruhezustand auf bis zu 10-[5] mol/L im erregten Zustand an. Das nun im Zytosol befindliche Ca[2]+ bindet an Troponin C an den Myofibrillen, was zum Start der Querbrückenaktivität und damit zur Kontraktion der Myofibrillen im Herzen während der Systole führt (Schmidt, Lang, & Heckmann, 2010).

RyR zählt als einer der Hauptkanäle zur Ca[2]+-Freisetzung aus dem SR. Im Säuger existieren die drei Isoformen RyR1‑3 des Rezeptors. Die prädominante Form im Herzen ist RyR2. Die RyR werden durch Phosphorylierung, Redoxmodifikationen und einer Vielzahl von kleinen Ionen und Molekülen reguliert. Die Ursachen einer großen Zahl menschlicher Erkrankungen konnte schon durch Mutationen in RyR1 und RyR2 erklärt werden. Dabei verursachen Veränderungen an RyR2 eine gestörte Ca[2]+-Homöostase und damit Herzerkrankungen wie die katecholaminerge polymorphe ventrikuläre Tachykardie (CPVT) oder die arrhythmogene rechtsventrikuläre Dysplasie 2 (ARVD2) (Lanner, Georgiou, Joshi, & Hamilton, 2010). Obwohl die Überfunktion von RyR2 deutlich im Zusammenhang mit Herzerkrankungen steht, scheint die Expression von RyR2 selbst unverändert zu bleiben. Vielmehr soll die übermäßige Funktion auf eine falsche Regulation des Kanals, vor allem durch übermäßige Phosphorylierung beruhen (Walsh, 2005; Dobrev & Wehrens, 2014). Aufgrund der großen Bedeutung für eine korrekte Herzfunktion wurde RyR2 für die Untersuchungen in dieser Arbeit ausgewählt.

Spannungsabhängige Kalziumkanäle

Genau wie der oben beschriebene RyR sind die spannungsabhängigen Kalziumkanäle die zweiten Hauptakteure in der elektromechanischen Kopplung. Sie sind dabei die Vermittler zwischen dem initialen, elektrischen Impuls des Aktionspotentials und der darauffolgenden Ausschüttung des chemischen, sekundären Botenstoffes in Form von Ca[2]+-Ionen aus dem Extrazellulärraum. Damit kann erst ausgelöst durch die spannungsgesteuerten Kanäle die Ca[2]+-induzierte-Ca[2]+-Freisetzung aus dem SR durch den Ryanodinrezeptor erfolgen, was die funktionelle Abhängigkeit dieser beiden Proteine aufzeigt.

Aufgrund der Beteiligung des sekundären Botenstoffes Ca[2]+ an einer Vielzahl von Signalwegen, wobei besonders die Protein-Phosphorylierungs-Kaskaden genannt werden sollten, steuern Kalziumkanäle neben der Muskelkontraktion auch viele andere Prozesse. Die Cav1-Familie leitet L-Typ Ca[2]+-Ströme und reguliert damit die Muskelkontraktion, endokrine Sekretion und Gentranskription. Dagegen interagieren die N-, P/Q- und R-Typ Ca[2]+-Kanäle der Cav2-Familie mit G-Proteinen und SNARE-Proteinen und steuern dadurch die synaptische Transmission. Die Cav3-Familie bildet T-Typ Kalziumkanäle, die sehr viel schneller und bei niedrigeren Membranpotentialen (in‑) aktiviert werden als die anderen Kanäle. Die Einteilung in diese drei Familien erfolgt nach der α1-Untereinheit des Proteinkomplexes, welche die Pore des Ionenkanals bildet (Catterall, 2000). In einer Arbeit von Hasse und anderen konnte eine Hochregulierung von L-Typ Ca[2]+-Kanälen bei Patienten mit hypertrophisch obstruktiver Kardiomyopathie festgestellt werden (Hasse, et al., 1996). Als Vertreter des L-Typ Kalziumkanals soll in dieser Arbeit die Expression des Proteins Cav1.2 untersucht werden. Auch für die ebenfalls im Herzen vorkommenden T-Typ Kanäle konnte eine erhöhte Aktivität bei Patienten mit Herzerkrankungen wie Hypertrophie gezeigt werden (Ono & Iijima, 2010). Stellvertretend für diese Gruppe wird in dieser Arbeit Cav3.2 untersucht.

Sarkoplasmatische Retikulum-Ca[2]+‑ATPasen

Die sarkoendoplasmatische Retikulum-Ca[2]+-ATPasen (SERCA) hydrolisieren ATP und nutzen die dabei freiwerdende Energie, um Kalzium aus dem Zytosol ins Lumen des SR zu transportieren. Damit trägt dieses Protein zur Sequestrierung von Kalzium im SR der Muskelzellen bei und steuert damit die Kontraktion bzw. die Relaxation des Muskels (NCBI Gene, 2016).

Der in Abschnitt 1.4. beschriebene Prozess der elektromechanischen Kopplung bzw. der Kontraktionsaktivität der Myofibrillen nach Kalziumbindung muss nach einiger Zeit gestoppt bzw. rückgängig gemacht werden, um die Entspannung des Herzmuskels während der Diastole zu ermöglichen. In dieser Relaxationsphase muss Ca[2]+ wieder aus dem Zytosol entfernt werden, um die Bindung von Ca[2]+ an das Regulatorprotein Troponin C zu beenden und dadurch die Querbrückenaktivität anzuhalten. Für das Absenken der Kalziumkonzentration gibt es zwei Wege. Zum einen erfolgt der Rücktransport in den Extrazellulärraum, was hauptsächlich durch die Na+/Ca[2]+-Pumpe und die Ca[2]+-ATPase in der Plasmamembran (PMCA) bewerkstelligt wird. Zusätzlich müssen auch die intrazellulären Kalziumspeicher wieder aufgefüllt werden, indem Ca[2]+ ins sarkoplasmatische Retikulum zurückgepumpt wird. Diese Rückführung erfolgt durch die ATP-getriebene Kalzium-Pumpe SERCA. Diese Ca[2]+-Pumpe findet sich in einer hohen Dichte in der Membran des SR (Schmidt, Lang, & Heckmann, 2010). Im Menschen sind elf SERCA Isoformen bekannt, welche von den drei Genen ATP2A1, ATP2A2 und ATP2A3 kodiert werden. Es konnten bereits Hinweise darauf erlangt werden, dass sich das Expressionsmuster von SERCA2-Isoformen bei Patienten mit Kardiomyopathien von dem bei Patienten ohne Herzfehler unterscheidet. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Expression sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene je nach Isoform entweder verringert oder erhöht war (Dally, et al., 2006). Für die Untersuchungen in dieser Arbeit wurde das Gen ATP2A3 gewählt, welches für die Isoformen SERCA3a-f beim Menschen bzw. für SERCA3a-c in der Maus kodiert.

Natrium-Kalzium-Austauscher (NCX)

Wie bereits oben für die SERCA Ca[2]+‑ATPasen beschrieben, muss das während der Systole durch spannungsgesteuerte Kalziumkanäle und Ryanodinrezeptoren freigesetzte Ca[2]+ zur Relaxation des Herzmuskels während der Diastole wieder aus dem Zytoplasma entfernt werden. Dies wird u.a. durch den Natrium-Kalzium-Austauscher in der Plasmamembran erreicht. Die Energie für den Kalzium-Export ergibt sich dabei aus dem thermodynamischen Gleichgewicht durch den zu Kalzium umgekehrten Konzentrations- und Ladungsgradienten für Natrium. Dabei werden für jedes Molekül Ca[2]+, das aus der Zelle hinaustransportiert wird, drei Moleküle Na+ hineintransportiert. Durch die unterschiedlichen Ladungen der beiden Ionen ergibt sich ein elektrogener Transport, der abhängig vom Membranpotential ist. Ein weniger negatives, depolarisiertes Membranpotential fördert den Kalziumeinstrom, das stärker negative, hyperpolarisierte Potential dagegen den Auswärtsstrom. Damit wechselt die Funktion des Austauschers beim Übergang von der Systole zur Diastole. Dieser Funktionswechsel hängt wiederum von der intrazellulären Natrium-Konzentration ab, welche durch schnelle Natriumkanäle, die Natrium-Kalium-ATPase, sowie den Natrium-Protonen-Austauscher reguliert wird (Ganten & Ruckpaul, 1998). Aufgrund der großen Bedeutung des NCX für die Ca[2]+-Homöostase, können schon geringe Störungen zur Ausbildung von Herzfehlern führen. So konnte gezeigt werden, dass transgene Mäuse mit einer Überexpression an NCX Hypertrophie und Herzfehler entwickelten (Roos, et al., 2007).

Ca[2]+-ATPase in der Plasmamembran (PMCA)

Die Kalzium-ATPase in der Plasmamembran (PMCA) ist neben dem Natrium-Kalzium-Austauscher für den Ca[2]+-Export aus dem Zytosol in den Extrazellulärraum zuständig. Während der NCX eine niedrige Ca[2]+- Affinität, aber eine hohe Kapazität für den Ca[2]+-Transport aufweist, verhält es sich bei der PMCA mit einer hohen Ca[2]+- Affinität, aber einer geringen Kapazität für den Ca[2]+-Transport genau umgekehrt. Daher bezeichnet man PMCA auch als „Feinregler“ für die zytosolische Kalziumkonzentration. Die PMCA gehört zu den P-Typ ATPasen und nutzt die bei der Hydrolyse von ATP gewonnene Energie um Ca[2]+ entgegen eines starken Konzentrationsgefälles aus der Zelle zu transportieren. In Säugern gibt es vier Gene (ATP2B1-4), die für vier verschiedene Isoformen (PMCA1-4) kodieren. Während PMCA1 und PMCA4 in fast allen Geweben exprimiert werden, ist die Expression von PMCA2 und PMCA3 stark auf spezifische Gewebe beschränkt. Zusätzlich weist jede Isoform noch mehrere Splice-Varianten auf (Brini & Carafoli, 2011). Für die Untersuchungen in dieser Arbeit wurde die Isoform PMCA4 ausgewählt. Mohamed und andere konnten bereits im Mausmodell zeigen, dass das systemische Ausschalten von PMCA4 die Lebenserwartung bei Mäusen, die durch erhöhten Herzdruck eine Hypertrophie entwickelten, steigen ließ. Dies weist auf eine Rolle von PMCA4 bei der Ausbildung von Hypertrophie im Herzen hin (Mohamed, et al., 2016). Außerdem konnte eine hochregulierte Genexpression von mehreren PMCA-Isoformen (PMCA1c, PMCA4a+b) in Patienten mit Kardiomyopathien festgestellt werden (Dally, et al., 2006).

NFATC-Transkriptionsfaktoren (Nuclear factor of activated T-cells)

NFATC ist kein klassisches Protein des Kalziumhaushaltes, sondern wurde zuerst als Kernfaktor in aktivierten T-Zellen identifiziert, der den Interleukin-2 Promotor bindet. Später stellte sich heraus, dass sich die Expression dieses Faktors nicht nur auf T-Zellen beschränkt, sondern NFATC regulatorische Aufgaben in fast allen Zelltypen übernimmt. Von NFATC sind fünf Isoformen bekannt (NFATC1-5). Alle außer NFATC5 werden durch den Kalzium-Signalweg reguliert. Bei einer Erhöhung des intrazellulären Ca[2]+-Spiegels steigt auch die Bindung von Ca[2]+ an Calmodulin, welches wiederum die Calmodulin-abhängige Phosphatase Calcineurin aktiviert. Die Transkriptionsfaktoren NFATC werden daraufhin von Calcineurin dephosphoryliert, was deren Translokation in den Nukleus und der Induktion der Expression der durch sie regulierten Gene bewirkt (Macian, 2005). Dabei konnte bereits im Tiermodell festgestellt werden, dass eine Überexpression der Faktoren des Calcineurin/NFATC-Signalweges die Ausbildung einer Hypertrophie des Myokards mit Weiterentwicklung zu schweren Herzfehlern fördert (Molkentin et al., 1998). In einer weiteren Studie mit humanen Herzbiopsien aus acht Patienten mit und acht Patienten ohne DCM konnte gezeigt werden, dass die Calcineurin-Expression und ‑Aktivität bei DCM-Patienten signifikant erhöht war. Des Weiteren konnte eine erhöhte Expression von NFATC3 in Kernextrakten bei einem gleichzeitig niedrigeren Expressionslevel im Gesamtzellextrakt von DCM-Patienten festgestellt werden, was deutlich auf eine vermehrte Translokation des Transkriptionsfaktors in den Nukleus spricht (Diedrichs, Chia, Boelcka, Mehlhormb, & Schwingera, 2004). In dieser Arbeit soll die Expression von NFATC1 untersucht werden.

1.6. Zielsetzung der Arbeit

Das Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung der Expression von ausgewählten Genen des Kalziumhaushaltes im Mausmodell. Dabei soll eine Gegenüberstellung des Genexpressionsmusters in Mäusen mit und ohne herzspezifischen Nexilin Cre-loxP Knock-out erfolgen. In früheren Arbeiten, in denen durch den konstitutiven Knock-out von Nexilin im gesamten Organismus die Entwicklung einer EFE und eine sehr frühe Sterblichkeit der Mäuse beobachtet worden war, konnte Nexilin bereits als Auslöser für dilatative Kardiomyopathie identifiziert werden (Aherrahrou et al., 2015). Es soll zunächst geprüft werden, ob sich dieses Krankheitsbild auch bei dem hier untersuchten, Kardiomyozyten-spezifischen Knock-out abbildet. Um auf die bei dilatativer Kardiomyopathie veränderte Herzstruktur zu prüfen, werden Herzschnitte von Wildtyp und Knock-out Mäusen, jeweils im Alter von 12 und 56 Wochen, mit zwei unterschiedlichen Methoden angefärbt und verglichen. Zusätzlich wird eine real-time PCR durchgeführt, um auf das vermehrte Vorliegen von Myh7-mRNA als bekannter Marker für diese Erkrankung zu prüfen.

Ferner soll der Hauptaspekt der Arbeit darin bestehen, zu untersuchen ob die Initiation und Entwicklung der dilatativen Kardiomyopathie in Mäusen mit konditionellem Nexilin Knock-out die Veränderung des Expressionsmusters für Proteine des Kalziumhaushaltes bedingt. Diese Untersuchungen sollen zunächst auf mRNA-Ebene mittels real-time PCR erfolgen, wofür eine größere repräsentative Gruppe von sieben Genen, welche für Proteine des Kalziumhaushaltes kodieren, gewählt wird. Im zweiten Schritt soll die Genexpression für eine kleinere repräsentative Gruppe auch auf Proteinebene untersucht werden, wozu man sich der Methode des Western Blots unter Nutzung spezifischer Primärantikörper bedient.

2. Material

2.1. Biologisches Material

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 1: Liste der verwendeten Antikörper

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Tabelle 2: Liste der verwendeten Enzyme

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 3: Liste der verwendeten Oligonukleotide

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