In dieser Arbeit wurde der Einfluss der Zellmembran und der Zellwand auf die Fraktionierung stabiler Kohlenstoffisotope beim Abbau von Tetrachlorethylen (PCE) und Trichlorethylen (TCE) durch Rohextrakte untersucht. Die dabei erhaltenen Fraktionierungsfaktoren wurden mit vorhandenen Ergebnissen oder Resultaten verglichen, um etwaige Rückschlüsse auf den Reaktionsmechanismus des Abbaus sowie seiner Kinetik zu ziehen. Es wurden weiterhin verschiedenen Elektronenakzeptoren während des Wachstums bezüglich ihres Einflusses auf die Isotopenfraktionierung durch Rohextrakte verglichen.
Die zum Vergleich herangezogenen Mikroorganismen waren die Gram-negativen Spirillen Sulfurospirillum multivorans (ehem. Dehalospirillum multivorans) und Sulfurospirillum halorespirans. Die Rohextrakte der beiden Verwandten fraktionierten die Kohlenstoffisotope bei der PCE-Dehalogenierung in ähnlicher Weise. Der Fraktionierungsfaktor αC für S. multivorans lag nach Wachstum mit TCE als Elektronenakzeptor bei 1,0014 mit Fumarat als zusätzlichem Elektronenakzeptor bei 1,0015. Der Isotopeneffekt für die TCE-Dechlorierung war 1,0162 nach Wachstum mit TCE bzw. 1,0159 bei zusätzlicher Fumaratatmung. Für Rohextrakte von S. halorespirans wurden die Auswirkung der Wachstumssubstrate PCE und TCE auf die Isotopenfraktionierung derselben ermittelt. Im Falle des vorherigen Wachstums mit PCE war αC für PCE 1,0024 und für TCE 1,0229. Die Inkubation mit TCE als Atmungssubstrat ergab einen Fraktionierungsfaktor für PCE von 1,0032, für TCE lag er bei 1,0187.
Außerdem wurde an Anreicherungskulturen aus einem kontaminierten Probenbrunnen in Bitterfeld die Fähigkeit zum PCE- und TCE-Abbau studiert. Dabei kamen Butyrat und Lactat als Kohlenstoff- und Energiequellen zum Einsatz. Während die vollständige TCE-Dehalogenierung bis zum Ethen innerhalb von 10 Tagen gelang, war der Abbau von PCE durch auf Lactat wachsende Kulturen auch nach 80 Tagen noch nicht vollständig. Ein Abbau von PCE durch Butyrat-verwertende Kulturen konnte nach zehn Monaten nicht beobachtet werden. In einer funktionellen genetischen Analyse wurden mögliche Gene für bekannte Dehalogenasen identifiziert und der Gattung Dehalococcoides zugeordnet.
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
2. Material und Methoden
2.1. Verwendete Chemikalien
2.2. Kulturen
2.3. Kultivierung der Mikroorganismen
2.3.1. Zusammensetzung der verwendeten Kulturmedien
2.3.2. Kultivierung von Sulfurospirillum spp.
2.3.3. Kultivierung der Anreicherungskulturen aus Bitterfeld
2.4. Herstellung des Rohextrakts
2.4.1. Kultivierung und Zellyse
2.4.2. Bestimmung der Aktivität des Rohextrakts
2.5. Experimente zur Isotopenfraktionierung
2.5.1. Versuchsaufbau Isotopenfraktionierung durch Rohextrakte
2.6. Bestimmung des Fraktionierungsfaktors αC
2.6.1. Analyse des Isotopenverhältnisses
2.6.2. Bestimmung der Konzentration der chlorierten Ethene
2.6.3. Berechnung des Fraktionierungsfaktors αC
2.7. Untersuchung der Anreicherungskulturen aus Bitterfeld
2.7.1. Extraktion der Gesamt-DNS aus den Anreicherungskulturen
2.7.2. PCR mit RDase-Primern für Dehalococcoides spp.
2.7.3. Anfertigung einer Klonbank, Kolonie-PCR und Restriktonsanalyse
2.7.4. Sequenzierung
3. Ergebnisse
3.1. Fraktionierungsexperimente mit Rohextrakten von Sulfurospirillum spp.
3.1.1. Rohextrakte von S. multivorans mit TCE im Medium
3.1.2. Rohextrakte von S. multivorans mit TCE und Fumarat im Medium
3.1.3. Rohextrakte von S. multivorans mit Fumarat im Medium
3.1.4. Rohextrakte von S. halorespirans mit PCE im Medium
3.1.5. Rohextrakte von S. halorespirans mit TCE im Medium
3.2. Untersuchung der Anreicherungskulturen aus Bitterfeld
3.2.1. Beobachtung der Dechlorierung und Kohlenteilstoffbilanz
3.2.2. Kolonie-PCR und Restriktionsanalyse der putativen Dehalogenasen
3.2.3. Sequenzierung ausgewählter Inserts
3.2.4. Mikroskopisch-morphologische Beobachtung
4. Diskussion
4.1. Ursachen der Isotopenfraktionierung
4.1.1. Isotopenfraktionierung durch Rohextrakte von S. multivorans
4.1.2. Isotopenfraktionierung durch Rohextrakte von S. halorespirans
4.1.3. Kinetische Hemmung durch die Zellbarrieren und ihr Einfluß auf den Isotopeneffekt
4.1.4. Reaktionsmechanismus – Einfluß auf die Isotopendiskriminierung
4.2. Anreicherung von dechlorierenden Mikroorganismen aus Bitterfeld
Zielsetzung & Themen
Die Arbeit untersucht den Einfluss der bakteriellen Zellstruktur (Membran und Zellwand) auf die Fraktionierung stabiler Kohlenstoffisotope beim anaeroben Abbau von Tetrachlorethylen (PCE) und Trichlorethylen (TCE) durch Rohextrakte der Spezies Sulfurospirillum multivorans und S. halorespirans. Ziel ist es, die Rolle von Transportprozessen und zellulären Barrieren im Vergleich zu enzymspezifischen Reaktionsmechanismen zu identifizieren und gleichzeitig dehalogenierende Mikroorganismen aus kontaminierten Proben in Bitterfeld anzureichern.
- Kinetische Isotopenfraktionierung bei der reduktiven Dehalogenierung.
- Einfluss von Zellmembranen und Barrieren auf die Isotopendiskriminierung.
- Vergleich der Reaktionsmechanismen bei PCE und TCE unter Verwendung von Rohextrakten.
- Anreicherung und genetische Charakterisierung dehalogenierender Mikroorganismen aus dem Standort Bitterfeld.
Auszug aus dem Buch
Einfluß der Zellbarrieren auf die Isotopenfraktionierung
In Abbildung 2 ist ein allgemeines Schema einer enzymatischen Reaktion mit den reversiblen Schritten k1/k2 bis k5/k6 dargestellt. Gemäß dieser vereinfachten Darstellung ist es möglich, daß ein anderer Schritt, als die eigentliche chemische Transformation im Übergangszustand geschwindigkeitsbestimmend ist. Eine kinetische Hemmung in einem Schritt vor dem Übergangszustand hätte zur Folge, daß die Reaktion vom Enzymsubstrat zum Produkt weniger isotopenselektiv bezüglich der Bindungsstärke zwischen zwei Atomen wäre, wodurch sich der Isotopeneffekt der Gesamtreaktion verringern würde. So kann beispielsweise die Bindung des Substrats an das Enzym (k1/k2) durch die Aufnahme in die Zelle geschwindigkeitsbestimmend sein. Dies kann durch aktiven oder passiven Transport sowie durch Diffusion geschehen.
Im Fall einer Diffusion könnte eine Rückdiffusion vom Enzym in die extrazelluläre Matrix gehemmt sein (k1 >> k2) und somit einen Effekt auf die kinetische Isotopenfraktionierung haben. Ein aktiver Transport dagegen könnte den Isotopeneffekt verstärken wenn er durch die Formierung oder Spaltung chemischer Bindungen mit dem Substrat verbunden wäre, was sich in einer Verringerung des Fraktionierungsfaktors bei zerstörter Zellintegrität bemerkbar machen würde. Ohne eine solche direkte chemische Reaktion mit dem Substrat würde ein aktiver Transport ebenfalls die Rückdiffusion hemmen, mit den entsprechenden Konsequenzen für das isotopische Gleichgewicht. Rohextrakte sollten in diesem Fall ihr Substrat stärker fraktionieren.
Zusammenfassung der Kapitel
1. Einleitung: Beschreibt die Zielsetzung der Untersuchung des Einflusses bakterieller Zellstrukturen auf die Kohlenstoffisotopenfraktionierung beim Abbau von PCE und TCE.
2. Material und Methoden: Detaillierte Darstellung der chemischen Ausgangsstoffe, der Kultivierungsmethoden der verwendeten Bakterienstämme sowie der experimentellen Aufbauten zur Messung von Aktivität und Fraktionierungsfaktoren.
3. Ergebnisse: Präsentation der experimentellen Daten zu den Fraktionierungsexperimenten mit Rohextrakten sowie Ergebnisse der mikrobiellen Anreicherung aus dem kontaminierten Bitterfelder Standort.
4. Diskussion: Interpretation der Ergebnisse hinsichtlich der Reaktionsmechanismen, des Einflusses der Zellbarrieren und der genetischen Identifikation potenzieller dehalogenierender Enzyme.
Schlüsselwörter
Tetrachlorethylen, Trichlorethylen, Isotopenfraktionierung, Sulfurospirillum multivorans, Sulfurospirillum halorespirans, Rohextrakte, reduktive Dehalogenierung, Zellmembran, Kohlenstoffisotope, Dehalococcoides, Bitterfeld, Kinetik, Anreicherungskultur, Bioremediation, Isotopendiskriminierung
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?
Die Arbeit erforscht, wie bakterielle Zellstrukturen wie Membranen und Zellwände die Fraktionierung von stabilen Kohlenstoffisotopen während des enzymatischen Abbaus von chlorierten Ethenen beeinflussen.
Was sind die zentralen Themenfelder?
Die zentralen Felder umfassen die mikrobiologische Dehalogenierung, Isotopengeochemie, Membranbiologie sowie die funktionelle Analyse von Mikroorganismengemeinschaften aus kontaminierten Standorten.
Was ist das primäre Ziel oder die Forschungsfrage?
Die Forschungsfrage zielt darauf ab zu klären, ob die Unterschiede in der Isotopenfraktionierung bei PCE und TCE eher durch kinetische Barrieren an der Zellmembran oder durch enzymspezifische Mechanismen der reduktiven Dehalogenierung bedingt sind.
Welche wissenschaftliche Methode wird verwendet?
Es kommen unter anderem anaerobe Kultivierungsmethoden, Isotopenmassenspektrometrie (GC-C-IRMS), Proteinbestimmungen nach Bradford sowie molekularbiologische Verfahren wie PCR und Restriktionsanalysen zur Anwendung.
Was wird im Hauptteil behandelt?
Der Hauptteil gliedert sich in Fraktionierungsexperimente mit Rohextrakten, die den Einfluss von Wachstumssubstraten prüfen, sowie die mikrobielle Anreicherung und genetische Untersuchung von Kulturen aus dem Bitterfelder Grundwasser.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Die Arbeit wird durch Begriffe wie PCE, TCE, Isotopenfraktionierung, Sulfurospirillum, Dehalococcoides und reduktive Dehalogenierung charakterisiert.
Welche Rolle spielt die Zellwand bei der Isotopenfraktionierung?
Die Zellwand kann als kinetische Barriere fungieren, die den Transport zum Enzym einschränkt und so das isotopische Gleichgewicht beeinflussen oder vermindern kann.
Warum wurde Bitterfeld als Untersuchungsstandort gewählt?
Bitterfeld ist ein industriell kontaminierter Standort, dessen Grundwasser ein interessantes Spektrum an chlorierten Lösungsmitteln aufweist, die als Basis für die Anreicherung dehalogenierender Kulturen dienen.
Was unterscheidet Rohextrakte von intakten Zellen in dieser Untersuchung?
In Rohextrakten sind die Zellwände und Membranen zerstört, wodurch Transportvorgänge, die in intakten Zellen die Fraktionierung beeinflussen könnten, eliminiert werden und die enzymatische Reaktion isoliert betrachtet werden kann.
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- Michael Siegert (Author), 2006, Kohlenstoffisotopenfraktionierung beim PCE- und TCE-Abbau durch Rohextrakte von Sulfurospirillum spp. Untersuchungen an dehalogenierenden Anreicherungskulturen aus Bitterfeld, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/541195
