Antibakterielle Wirkung von ausgewählten Naturstoffen auf das Wachstum von Listeria monocytogenes

Inhaltsverzeichnis

INHALTSVERZEICHNIS

ABBILDUNGSVERZEICHNIS

TABELLENVERZEICHNIS

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG
1.1 LISTERIA MONOCYTOGENES
1.1.1 Historischer Hintergrund
1.1.2 Eigenschaften und Vorkommen
1.1.3 L. monocytogenes in Lebensmitteln, mit besonderem Augenmerk auf Räucherlachs
1.2 NATURSTOFFE
1.2.1 Oleuropein
1.2.2 Vanillin und Vanillinsäure
1.3 METHYLPARABEN
1.4 ZIEL DER ARBEIT

2 MATERIAL
2.1 MIKROORGANISMEN, VERWENDETES PRIMERPAAR UND SONSTIGES
2.1.1 Mikroorganismen
2.1.2 Verwendetes Primerpaar
2.1.3 Sonstiges
2.2 NÄHRMEDIEN
2.2.1 Für in vitro Versuche verwendete Nährmedien
2.2.2 Für in vivo Versuche verwendete Nährmedien
2.3 NATURSTOFFE
2.3.1 Oleuropeinhaltiger Olivenblätterextrakt
2.3.2 Vanillin
2.3.3 Vanillinsäure
2.4 METHYLPARABEN
2.5 DAS EINGESETZTE LEBENSMITTEL
2.6 PUFFER UND LÖSUNGEN
2.7 GERÄTE, CHEMIKALIEN UND SONSTIGE MATERIALIEN
2.7.1 Geräte
2.7.2 Chemikalien
2.7.3 Sonstige Materialien

3 METHODEN
3.1 IN VITRO VERSUCHE: KULTURELL-MIKROBIOLOGISCHE METHODEN
3.1.1 Stammhaltung von L. monocytogenes
3.1.2 Allgemeine Anzucht von L. monocytogenes
3.1.3 Spezielle Anzucht von L. monocytogenes : die Wirkung der ausgesuchten Naturstoffe in unterschiedlichen pH- und Temperaturbereichen als in vitro Versuch
3.1.3.1 Oleuropeinhaltiger Olivenblätterextrakt
3.1.3.2 Vanillin
3.1.3.3 Vanillinsäure
3.1.4 Spezielle Anzucht von L. monocytogenes : die Wirkung von Methylparaben als in vitro Versuch
3.1.5 Messung des bakteriellen Wachstums
3.2 IN VIVO VERSUCHE: KULTURELL-MIKROBIOLOGISCHE METHODEN
3.2.1 Probenentnahme
3.2.2 Kulturell-mikrobiologische Methoden zur Untersuchung des Keimstatus des Räucherlachses in Anlehnung an die LFGB § 64 Untersuchungsvorschriften ..
3.2.3 Versuchsaufbau zur Untersuchung der Wirkung von Vanillinsäure und Methylparaben, einzeln und in kombinierter Weise, auf das Wachstum von L. monocytogenes im Räucherlachs bei 7 und 30 °C als in vivo Modell
3.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN
3.3.1 DNA-Isolierung von L. monocytogenes aus Kultur und Räucherlachs
3.3.1.1 DNA-Isolierung von L. monocytogenes aus Kultur
3.3.1.2 DNA-Isolierung von L. monocytogenes aus Räucherlachs
3.3.2 Photometrische Reinheits- und Konzentrationsbestimmung isolierter DNA
3.3.3 Nachweis und Quantifizierung von L. monocytogenes-DNA mittels PCR
3.3.3.1 Quantitative Analyse mittels Real-Time PCR
3.3.3.1 Qualitative PCR-Analyse mit anschließender Agarose-Gelelektrophorese

4 ERGEBNISSE
4.1 IN VITRO VERSUCHE: WACHSTUMSKURVEN VON L. MONOCYTOGENES UNTER DEM EINFLUSS VERSCHIEDENER ZUSATZSTOFFE
4.1.1 Einfluss von oleuropeinhaltigem Olivenblätterextrakt auf das Wachstum von L. monocytogenes im Vollmedium
4.1.2 Einfluss von Vanillin auf das Wachstum von L. monocytogenes
4.1.2.1 Einfluss von Vanillin auf das Wachstumsverhalten von L. monocytogenes im Minimalmedium
4.1.2.2 Einfluss von Vanillin auf das Wachstumsverhalten von L. monocytogenes im Vollmedium
4.1.3 Einfluss von Vanillinsäure auf das Wachstum von L. monocytogenes
4.1.3.1 Einfluss von Vanillinsäure auf das Wachstumsverhalten von L. monocytogenes im Minimalmedium
4.1.3.2 Einfluss von Vanillinsäure auf das Wachstumsverhalten von L. monocytogenes im Vollmedium
4.1.4 Einfluss von Methylparaben auf das Wachstum von L. monocytogenes
4.1.4.1 Einfluss von Methylparaben auf das Wachstumsverhalten von L. monocytogenes im Minimalmedium
4.1.4.2 Einfluss von Methylparaben auf das Wachstumsverhalten von L. monocytogenes im Vollmedium
4.2 IN VIVO VERSUCHE: KULTURELL - MIKROBIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN
4.2.1 Bestimmung des Keimstatus des Räucherlachses mittels kulturell-mikro biologischer Methode
4.2.2 Einfluss von Vanillinsäure und Methylparaben auf das Wachstum von L. monocytogenes im Räucherlachs im 7 und 30 °C Lagerversuch
4.2.2.1 7 °C Räucherlachs Lagerversuch
4.2.2.2 30 °C Räucherlachs Lagerversuch
4.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN
4.3.1 DNA-Konzentrationen der in vitro Versuche
4.3.2 Vergleich der ermittelten DNA-Konzentration von L. monocytogenes mit der gemessenen OD600 im in vitro Versuch
4.3.3 DNA-Konzentrationen der in vivo Versuche
4.3.4 Vergleich der ermittelten DNA-Konzentration von L. monocytogenes mit der Keimzahl im in vivo Versuch
4.3.5 Überprüfung der Spezifität der PCR Produkte der Real-Time PCR
4.3.5.1 Analyse der Schmelzkurve und der Gelelektrophorese der PCR-Produkte der in vitro Proben
4.3.5.2 Analyse der Schmelzkurve und der Gelelektrophorese der PCR-Produkte der in vivo Proben

5 DISKUSSION
5.1 OLEUROPEIN
5.2 VANILLIN
5.3 VANILLINSÄURE
5.4 METHYLPARABEN
5.5 EINSATZ VON VANILLINSÄURE UND METHYLPARABEN IM RÄUCHERLACHS BEI 7 UND 30 °C
5.6 VERGLEICH DES KULTURELL-MIKROBIOLOGISCHEN NACHWEISES VON

L. MONOCYTOGENES MIT DER MOLEKULARBIOLOGISCHEN METHODE

6 ZUSAMMENFASSUNG

7 AUSBLICK

8 LITERATUR

DANKSAGUNG

Abbildungsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Strukturformel von Oleuropein

Abbildung 2: Strukturformel von Vanillin

Abbildung 3: Strukturformel von Vanillinsäure

Abbildung 4: Strukturformel von Methylparaben

Abbildung 5: Untersuchungsschema des Räucherlachses

Abbildung 6A-B: Einfluss von 500 und 1000 µg/ml Oleuropein auf das Wachstum von L. monocytogenes im Vollmedium, inkubiert bei 30 °C, bei pH 5 (A) o der bei pH 7 (B)

Abbildung 7: Einfluss von 11,5 und 23 mM Vanillin auf das Wachstum von L. monocytogenes, inkubiert bei 7 °C im Minimalmedium, eingestellt auf pH 5

Abbildung 8: Einfluss von 11,5 und 23 mM Vanillin auf das Wachstum von L. monocytogenes, inkubiert bei 30 °C im Minimalmedium, eingestellt auf pH 5

Abbildung 9: Einfluss von 13,5 und 27 mM Vanillin auf das Wachstum von L. monocytogenes, inkubiert bei 7 °C im Minimalmedium, eingestellt au f pH 7

Abbildung 10: Einfluss von 13,5 und 27 mM Vanillin auf das Wachstum von L. monocytogenes, inkubiert bei 30 °C im Minimalmedium, eingestellt auf pH 7

Abbildung 11: Einfluss von 11,5 und 23 mM Vanillin auf das Wachstum von L. monocytogenes, inkubiert bei 7 °C im Vollmedium, eingestellt auf pH 5

Abbildung 12: Einfluss von 11,5 und 23 mM Vanillin auf das Wachstum von L. monocytogenes, inkubiert bei 30 °C im Vollmedium, eingestellt au f pH 5

Abbildung 13: Einfluss von 13,5 und 27 mM Vanillin auf das Wachstum von L. monocytogenes, inkubiert bei 7 °C im Vollmedium, eingestellt auf pH 7

Abbildung 14: Einfluss von 13,5 und 27 mM Vanillin auf das Wachstum von L. monocytogenes, inkubiert bei 30 °C im Vollmedium, eingestellt au f pH 756 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 15: Einfluss von 5 und 10 mM Vanillinsäure auf das Wachstum von L. monocytogenes, inkubiert bei 7 °C, im Minimalmedium, eingestellt auf pH 5

Abbildung 16: Einfluss von 5 und 10 mM Vanillinsäure auf das Wachstum von L. monocytogenes, inkubiert bei 30 °C, im Minimalmedium, eingestell t auf pH 5

Abbildung 17: Einfluss von 50 und 110 mM Vanillinsäure auf das Wachstum von L. monocytogenes, inkubiert bei 7 °C im Minimalmedium, eingestellt auf pH 7

Abbildung 18: Einfluss von 50 und 110 mM Vanillinsäure auf das Wachstum von L. monocytogenes, inkubiert bei 30 °C im Minimalmedium, eingestellt auf pH 7

Abbildung 19: Einfluss von 5 und 10 mM Vanillinsäure auf das Wachstum von L. monocytogenes, inkubiert bei 7 °C im Vollmedium, eingestellt auf pH 5

Abbildung 20: Einfluss von 5 und 10 mM Vanillinsäure auf das Wachstum von L. monocytogenes, inkubiert bei 30 °C im Vollmedium, eingestellt au f pH 5

Abbildung 21: Einfluss von 23 mM Vanillinsäure auf das Wachstum von L. monocytogenes, inkubiert bei 7 °C im Vollmedium, eingestellt auf pH 6,2

Abbildung 22: Einfluss von 23 mM Vanillinsäure auf das Wachstum von L. monocytogenes, inkubiert bei 30 °C im Vollmedium, eingestellt au f pH 6,2

Abbildung 23: Einfluss von 50 und 110 mM Vanillinsäure auf das Wachstum von L. monocytogenes, inkubiert bei 7 °C im Vollmedium, eingestellt auf pH 7

Abbildung 24: Einfluss von 50 und 110 mM Vanillinsäure auf das Wachstum von L. monocytogenes, inkubiert bei 30 °C im Vollmedium, eingestellt au f pH 7

Abbildung 25: Einfluss von Methylparaben in einer Konzentration von 0,2 % [w/v] auf das Wachstum von L. monocytogenes, inkubiert bei 7 °C im Minimalmedium, eingestellt auf pH 5

Abbildung 26: Einfluss von Methylparaben in einer Konzentration von 0,2 % [w/v] auf das Wachstum von L. monocytogenes, inkubiert bei 30 °C im Minimalmedium, eingestellt auf pH 5

Abbildung 27: Einfluss von Methylparaben in einer Konzentration von 0,2 % [w/v] auf das Wachstum von L. monocytogenes, inkubiert bei 7 °C im Minimalmedium, eingestellt auf pH 7

Abbildung 28: Einfluss von Methylparaben in einer Konzentration von 0,2 % [w/v] auf das Wachstum von L. monocytogenes, inkubiert bei 30 °C im Minimalmedium, eingestellt auf pH 7

Abbildung 29: Einfluss von Methylparaben in einer Konzentration von 0,2 % [w/v] auf das Wachstum von L. monocytogenes, inkubiert bei 7 °C im Vollmedium, eingestellt auf pH 5

Abbildung 30: Einfluss von Methylparaben in einer Konzentration von 0,2 % [w/v] auf das Wachstum von L. monocytogenes, inkubiert bei 30 °C im Vollmedium, eingestellt auf pH 5

Abbildung 31: Einfluss von Methylparaben in einer Konzentration von 0,2 % [w/v] auf das Wachstum von L. monocytogenes, inkubiert bei 7 °C im Vollmedium, eingestellt auf pH 6,2

Abbildung 32: Einfluss von Methylparaben in einer Konzentration von 0,2 % [w/v] auf das Wachstum von L. monocytogenes, inkubiert bei 30 °C im Vollmedium, eingestellt auf pH 6,2

Abbildung 33: Einfluss von Methylparaben in einer Konzentration von 0,2 % [w/v] auf das Wachstum von L. monocytogenes, inkubiert bei 7 °C im Vollmedium, eingestellt auf pH 7

Abbildung 34: Einfluss von Methylparaben in einer Konzentration von 0,2 % [w/v] auf das Wachstum von L. monocytogenes, inkubiert bei 30 °C im Vollmedium, eingestellt auf pH 7

Abbildung 35: Einfluss von 23 mM Vanillinsäure und 0,2 % [w/v] Methylparaben, einzeln und in Kombination, auf das Wachstum von L. monocytogenes im Räucherlachs bei 7 °C Lagertemperatur

Abbildung 36: Einfluss von 23 mM Vanillinsäure und 0,2 % [w/v] Methylparaben, einzeln und in Kombination, auf das Wachstum von L. monocytogenes im Räucherlachs bei 30 °C Lagertemperatur

Abbildung 37: Ermittelte DNA-Konzentration der einzelnen Versuchsgruppen aus dem Vollmedium, eingestellt auf pH 6,2, inkubiert bei 7 C

Abbildung 38: Ermittelte DNA-Konzentration der einzelnen Versuchsgruppen aus dem Vollmedium, eingestellt auf pH 6,2, inkubiert bei 30 C

Abbildung 39A-D: Vergleich der ermittelten DNA-Konzentration der einzelnen Versuchsgruppen des 7 °C in vitro Versuchs (Vollmedium, pH 6,2) mit der gemessenen OD600

Abbildung 40A-D: Vergleich der ermittelten DNA-Konzentration der einzelnen Versuchsgruppen des 30 °C in vitro Versuchs (Vollmedium, pH 6,2) mit der gemessenen OD600

Abbildung 41: Ermittelte DNA-Konzentration der einzelnen Versuchsgruppen des 7 C Räucherlachs Lagerversuchs

Abbildung 42: Ermittelte DNA-Konzentration der einzelnen Versuchsgruppen des 30 C Räucherlachs Lagerversuchs

Abbildung 43A-D: Vergleich der ermittelten DNA-Konzentration der einzelnen Versuchsgruppen des 7 °C in vivo Versuchs (Räucherlachs, pH 6,1) mit der Keimzahl

Abbildung 44A-D: Vergleich der ermittelten DNA-Konzentration der einzelnen Versuchsgruppen des 30 °C in vivo Versuchs (Räucherlachs, pH 6,1) mit der Keimzahl

Abbildung 45: Schmelzkurvenanalyse der mittels Real-Time PCR amplifizierten PCR Produkte aus dem in vitro Versuch (Voll- und Minimalmedium)

Abbildung 46: Analyse der Gelelektrophorese der mittels Real-Time PCR amplifizierten PCR- Produkte aus dem in vitro Versuch (Minimal- und Vollmedium)..

Abbildung 47: Schmelzkurvenanalyse der mittels Real-Time PCR amplifizierten PCR-Produkte aus dem in vivo Versuch (30 °C Räucherlachs Lagerversuch)

Abbildung 48: Analyse der Gelelektrophorese der mittels Real-Time PCR amplifizierten PCR-Produkte aus dem in vivo Versuch (30 °C Räucherlachs Lagerversuch)

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Die, bei der mikrobiologischen Statusbestimmung des Räucherlachses, verwendeten Mikroorganismen

Tabelle 2: Das verwendete Primerpaar

Tabelle 3: Übersicht der durchgeführten Wachstumsexperimente im Minimal- und Vollmedium

Tabelle 4: Pipettierschema für die Beimpfung mit L. monocytogenes und die Zugabe der unterschiedlichen Konzentrationen des Olivenblätterextraktes in 20 ml TSY Bouillon

Tabelle 5: Pipettierschema für die Beimpfung mit L. monocytogenes und die Zugabe der unterschiedlichen Konzentrationen des Vanillins in 20 ml Nährmedium

Tabelle 6: Pipettierschema für die Beimpfung mit L. monocytogenes und die Zugabe der unterschiedlichen Konzentrationen der Vanillinsäure in 20 ml Nährmedium (mit Ausnahme von pH 6,2: 100 ml Vollmedium)

Tabelle 7: Übersicht der entsprechenden Mengen beimpfter Kultur, die benötigt wurden, um ein sichtbares Pellet zu erhalten

Tabelle 8: PCR-Reaktionsmix für den LightCycler®

Tabelle 9: Programm für die quantitative L. monocytogenes PCR mittels LightCycler®

Tabelle 10: PCR-Reaktionsmix für die Mastercycler-PCR

Tabelle 11: PCR-Programm im Mastercycler

Tabelle 12: Ergebnisse der kulturell-mikrobiologischen Untersuchungsmethode

Tabelle 13: DGHM-Richt- und Warnwerte für Räucherlachs

Abkürzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1 Einleitung

Seit Anfang der 80er Jahre hat sich die Meinung der Konsumenten bezüglich der Anwendung von Konservierungsstoffen in Lebensmitteln sehr gewandelt (Gill & Holley, 2004). Der aufgeklärte und gesundheitsbewusste Verbraucher der heutigen Zeit wünscht sich einerseits hochwertige, naturbelassene, konservierungsstofffreie Lebensmittel. Andererseits verlangt er, dass diese keimfrei und möglichst lange haltbar sind (Fitzgerald et al., 2003).

Jedoch sind Lebensmittel in der Regel nicht frei von Keimen. Sie enthalten neben erwünschten Mikroorganismen, wie z. B. Milchsäurebakterien und Kulturschimmel, auch unerwünschte Keime wie Verderbnis- und Krankheitserreger. Zu Letzteren gehören die Listerien, wobei von den sechs Spezies, die zum Genus Listeria gehören, Listeria monocytogenes die weitaus bedeutendste humanpathogene Art ist (Krämer, 2002). Dieser Keim ist verantwortlich für die Listeriose, eine Lebensmittelinfektion. Eine Exposition verläuft bei gesunden Erwachsenen meist unbemerkt, stellt jedoch eine Gefahr für Schwangere und deren ungeborene Kinder, sowie für Immungeschwächte, vorwiegend ältere Personen, dar. Eine Infektion mit L. monocytogenes kann zu Früh- oder Totgeburt und Neugeborenen- listeriose bzw. zu Hirn- und Hirnhautentzündung und Sepsis führen. Diese Krankheitsformen verlaufen in 20-30 % der Fälle tödlich (McLauchlin, 1997). L. monocytogenes ist in der Umwelt weit verbreitet. Aus diesem Grund gibt es nur wenige frische Lebensmittel, die dieses Bakterium nicht enthalten. Besonders anfällige Produkte sind neben Weichkäse, Wurst, Fertigsalaten, gekühlten Fertiggerichten, abgepacktem Gemüse und Rohkost auch abgepackter Lachs und Räucherfisch (Becker & Holzapfel, 2000). Der Verzehr der letztgenannten Produkte stellt einen Listeriose-Risikofaktor dar, da L. monocytogenes sich leicht in geräuchertem Fisch nachweisen lässt, bzw. die Inokulation von geräuchertem Fisch mit L. monocytogenes zu einem sehr starken Wachstum führt. Den Wünschen der Verbraucher entsprechend, konservierungsstofffreie und lang haltbare Lebensmittel anbieten zu können, hat die Ernährungsindustrie begonnen, verstärkt die Wirkungsweise natürlicher antimikrobieller Substanzen zu erforschen. Verschiedene Pflanzen und die daraus gewonnenen Extrakte, die in Lebensmitteln aufgrund ihres Geschmackes und ihres Aromas eingesetzt werden, weisen die gewünschte antimikrobielle Wirksamkeit auf. Sie können somit eine Alternative zu den chemischen Konservierungsmitteln darstellen (Fitzgerald et al., 2005).

1.1 Listeria monocytogenes

1.1.1 Historischer Hintergrund

Frühere Berichte weisen darauf hin, dass L. monocytogenes aus Gewebeschnitten deutscher Patienten bereits 1891 und aus dem Liquor von Patienten mit Meningitis 1917 und 1920 isoliert werden konnte (Reed, 1958). Dennoch wurde das Bakterium erst 1926 vollständig beschrieben, als Murray et al. (1926) ein kurzes, grampositives, nicht sporenbildendes Stäbchenbakterium isolierten, das bei Kaninchen und Meerschweinchen 1924 den Ausbruch einer Tierseuche verursachte. Dieses Bakterium wurde, aufgrund der Tatsache, dass es die Monozyten im Blut infizierte, Bacterium monocytogenes genannt. Ein Jahr später isolierte Pirie den gleichen Organismus aus Wüstenrennmäusen in Südafrika und nannte diesen Listerella hepatolytica (Pirie, 1927). Für diese Gattung wurde 1940 zu Ehren von Dr. Lister, dem Entdecker der Antisepsis, der endgültige Name Listeria monocytogenes eingeführt. Die Erkrankung beim Menschen war bislang selten, so dass selbst in berühmten Lehrbüchern Listeria lange Zeit kaum beachtet wurde (Seeliger, 1989). Untersuchungen im Rahmen eines Listeriose-Ausbruchs in Kanada 1981, der durch kontaminierten Krautsalat verursacht wurde, trugen dazu bei, die Listeriose beim Menschen aufzuklären (Schlech et al., 1983). Die erste Diagnose für eine Listeriose-Erkrankung bei einem an Meningitis erkrankten Soldaten konnte während des Ersten Weltkrieges bestätigt werden (Rocourt, 1994). Dennoch machen verschiedene Historiker bereits die Listeriose als Ursache für Queen Annes 17 erfolglose Schwangerschaften im 17. Jahrhundert verant- wortlich (Saxbe, 1972). Vor 1960 wurde nur von wenigen Fällen berichtet. Dahingegen wurden mehr als 10 000 Erkrankungen bis 1982 in der medizinischen Fachliteratur und mittlerweile Hunderte von Erkrankungen jährlich weltweit beschrieben (Rocourt, 1991; Rocourt & Brosch, 1991). Die ubiquitäre Verbreitung von L. monocytogenes in der Umwelt und dessen Fähigkeit selbst bei niedrigen Temperaturen bis +4 °C zu wachsen, können zu hohen Kontaminationen in verschiedenen Lebensmitteln führen (Rocourt, 1994).

1.1.2 Eigenschaften und Vorkommen

Nach Seeliger & Jones in „Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology“ (1984, S. 1235 ff.) sind Listerien kurze, grampositive, weder sporen- noch kapselbildende Stäbchen mit einer Länge von 0,5 bis 2 µm und einem Durchmesser von 0,4 bis 0,5 µm. Durch peritriche Begeißelung sind sie beweglich. Das Wachstum ist aerob und fakultativ anaerob und erfolgt bei pH-Werten zwischen 5,5 und 9, sowie einem aw Wert von 0,92 (Seeliger & Jones, 1986; Krämer, 2002). Die Keime können in einem weiten Temperaturbereich von 0 bis 45 C wachsen, wobei sich das Temperaturoptimum zwischen 30 und 37 °C befindet (Verheul, 1997). Der D71-Wert liegt bei ein bis vier Sekunden (Krämer, 2002). Listerien sind anspruchslos und widerstandsfähig. Selbst längere Perioden des Trocknens und Gefrierens mit anschließendem Auftauen werden von L. monocytogenes toleriert, so dass der Keim konventionelle nahrungsmittelkonservierende Techniken überleben kann (Lammerding & Doyle, 1990; Donnelly, 1994; Lou & Yousef, 1999). Das Bakterium kommt ubiquitär, d. h. in allen rohen Lebensmitteln, im Erdboden und in Oberflächenwasser, vor (Krämer, 2002). Aber auch aus menschlichen und tierischen Fäzes kann es isoliert werden (Seeliger, 1961). Zusätzlich kann das Bakterium mit einer Häufigkeit von 5 bis 10 % im Darm gesunder Menschen nachgewiesen werden (Gray & Killinger, 1966).

1.1.3 L. monocytogenes in Lebensmitteln, mit besonderem Augenmerk auf Räucherlachs

Aufgrund der Tatsache, dass L. monocytogenes überall in der Umwelt verbreitet ist, der Fähigkeit auch bei Kühlschranktemperaturen zu wachsen und der Toleranz gegenüber niedrigen pH-Werten und hohen Kochsalzkonzentrationen bis zu 10 % (Farber & Peterkin, 1991), ist die Kontrolle von L. monocytogenes in Lebensmitteln schwierig. So wurde das Bakterium in einer großen Vielzahl von Lebensmitteln, darunter Rohmilch, Weichkäse, fermentierten Wurstwaren, Geflügel, rohem Fleisch, Speiseeis, Gemüse, Salaten und rohem oder vakuumverpackten Fisch nachgewiesen. Eine hohe Anzahl von Listeriose-Ausbrüchen konnte auf den Verzehr von kontaminierten Lebensmitteln zurückgeführt werden (Rocourt & Cossart, 1997). Besonders problematisch erscheinen die so genannten „ready to eat“ Lebensmittel (Fertiggerichte), die aufgrund eines langen Mindesthaltbarkeitsdatums und langer Reifezeiten gute Wachstumsbedingungen für L. monocytogenes bieten (McLauchlin, 1993). Neben der primären Kontamination roher Lebensmittel mit dem Keim durch die

ubiquitäre Verbreitung, kann es auch zu einer sekundären Verunreinigung während der Verarbeitung des Lebensmittels durch Schmierinfektion, unsaubere Gerätschaften und mangelnde Körper- und Kleiderhygiene kommen. Nach Empfehlungen des Bundesinstitutes für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin (BGVV, 2000) werden in der Lebensmittelüberwachung für vier verschiedene Kategorien von Lebensmitteln Beanstand- ungsgrenzen festgelegt. Drei Kategorien (I, II und III) umfassen verzehrsfertige Produkte. Zur Kategorie I zählen Produkte, die für besonders gefährdete Zielgruppen (Säuglinge, Kleinst- kinder, Schwangere, Immungeschwächte) vorgesehen sind. Für diese wird eine Nulltoleranz gefordert. Für die Kategorien II und III gilt ein Grenzwert von 100 KbE/g. Zur Kategorie IV gehören nicht verzehrsfertige Lebensmittel, die bestimmungsgemäß unmittelbar vor dem Verzehr einem Listerien abtötenden Erhitzungsverfahren unterworfen werden, und für die es keine Grenzwerte gibt. Die Codex Alimentarius Kommission empfiehlt, dass grundsätzlich die Keimzahl in allen Lebensmitteln zum Zeitpunkt des Verzehrs 100 L. monocytogenes/g Lebensmittel nicht überschreiten sollte (Codex Alimentarius, 2003). Präventive Maßnahmen umfassen die fachgemäße, hygienisch einwandfreie Herstellung und Lagerung der Lebensmittel durch Anwendung von betrieblichen GHP (Gute-Hygiene-Praxis)- und Hygieneregeln. L. monocytogenes im Räucherlachs

Da L. monocytogenes auch in Sedimenten von Seen und Flüssen und im Oberflächen- wasser nachweisbar ist, besteht die Gefahr, dass das Bakterium auch Lachs kontaminieren kann (Ryser & Marth, 1991). Neben dieser primären Kontamination der Fische können eine unzureichende Betriebshygiene bei der Verarbeitung, zu hohe Temperaturen bei der Lagerung der Endprodukte oder ein zu lang angesetztes Mindesthaltbarkeitsdatum Ursache einer Verunreinigung vakuumverpackten Räucherlachses sein (Krämer, 2002). Während der Herstellung von Räucherlachs findet kein listerizider Prozess statt, d. h. L. monocytogenes übersteht den Prozess der Kalträucherung, bei dem der Temperaturbereich von 18 bis 26 C zu gering ist, um den Keim erfolgreich abzutöten (Rørvik, 2000). L. monocytogenes kann somit im Räucherlachs überleben und sich während der Lagerung vermehren. Seit 1987 konnte das Bakterium regelmäßig aus Fisch und Meeresfrüchten isoliert werden. Das relative hohe Vorkommen des Bakteriums (6-36 %) in so genannten „ready to eat“ Produkten, vor allem in kaltgeräuchertem Lachs und gekochtem Fisch, verstärkte das Interesse mehr über das Überleben und die Vermehrung von L. monocytogenes in Fisch und Meeresfrüchten zu erfahren, vor allem, weil diese Produkte nach der Lagerung und vor dem Verzehr nicht mehr hitzebehandelt werden, somit genussfertig sind (Embarek, 1994). Jemmi konnte in 26 % der untersuchten Räucherlachsproben L. monocytogenes nachweisen

(Jemmi, 1990). Kaltgeräucherter Lachs wird als eines der Risikoprodukte für Listeriose betrachtet und stellt ein Problem in der Fisch-Industrie dar (Rørvik, 2000).

1.2 Naturstoffe

In der Lebensmittelindustrie wächst das Interesse an Naturstoffen, die eine antimikrobielle Aktivität besitzen und somit möglicherweise als natürliches Konservierungsmittel eingesetzt werden können (Beuchat & Golden, 1989). Die Konsumenten fordern verstärkt hochwertige, naturbelassene Lebensmittel, die konservierungsstofffrei sind (Fitzgerald et al., 2005). Natürliche, antimikrobiell wirksame Verbindungen werden von Bakterien (z. B. Nisin aus Lactococcus lactis), von Pflanzen (z. B. phenolische Verbindungen wie Vanillin und Vanillinsäure oder Oleuropein) oder von Tieren (z. B. Enzyme, wie Lysozym, oder andere Proteine, wie Laktoferrin) produziert (Gould, 1996). Die Pflanzen stellen dabei die größte Quelle an möglichen antimikrobiellen Verbindungen dar (Fitzgerald et al., 2005). Man unterscheidet verschiedene Grundlagen der antimikrobiellen Wirkungsweise. Dazu zählen die Reaktion mit der Zellmembran, die Inaktivierung essenzieller Enzyme oder die Zerstörung bzw. Inaktivierung genetischen Materials (Davidson, 1993). Verschiedene Studien haben gezeigt, dass die antimikrobielle Wirkung verschiedener pflanzlicher ätherischer Öle (z. B. Oregano) bzw. deren phenolische Inhaltsstoffe (z. B. Carvacrol) darin besteht, die Zellmembran zu stören, so dass der Verlust der chemoosmotischen Kontrolle letztlich zum Zelltod führt (Fitzgerald et al., 2004). In zahlreichen Studien konnte bewiesen werden, dass eine Vielzahl von natürlichen Inhaltstoffen verschiedener Pflanzen, antimikrobiell gegen L. monocytogenes wirkt (Lin et al., 2004), beispielsweise hemmen Thymol und Carvacrol, enthalten in Oreganoextrakt, erfolgreich das Wachstum von

L. monocytogenes. Je nach Lebensmittel inhibieren 150 bis 200 ppm reines Carvacrol oder Thymol signifikant die Vermehrung von L. monocytogenes (Seaberg et al., 2003). Verschiedene Studien haben gezeigt, dass auch Oleuropein antimikrobiell wirksam ist.

1.2.1 Oleuropein

Das bittere Polyphenol Oleuropein ist Hauptbestandteil des Olivenbaumes (Olea europaea). Man findet Oleuropein im Blatt, in der Frucht, der Wurzel und der Rinde. Mit Hilfe des Oleuropeins schützt der Baum sich gegen Insekten und bakterielle Krankheiten (Caturla et al., 2005). Aus diesem Grund hat sich die Forschung verstärkt mit der antimikrobiellen Wirkung der Bestandteile von Oliven und Olivenöl auseinander gesetzt (Bisignano et al., 1999). Bereits 1908 wurde Oleuropein von Bourquelot und Vintilesco entdeckt und als heterosidischer Ester der Elenolsäure und des β-3-4-Dihydroxyphenylethylalkohol (DPE) identifiziert (Panizzi et al., 1960). Studien der letzten Jahre haben gezeigt, dass Oleuropein und dessen Derivate die Wachstumsrate von Schimmelpilzen, Bakterien, Hefen und Viren hemmen oder herabsetzen können (Juven et al., 1972). Spaltprodukte, wie die Elenolsäure, weisen eine noch größere Wirksamkeit auf. In Anlehnung an Fogg & Lodge (1945) beruht die antimikrobielle Wirkungsweise der Phenole auf deren Fähigkeit Proteine zu denaturieren.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1: Strukturformel von Oleuropein

1.2.2 Vanillin und Vanillinsäure

Weitere für diese Arbeit interessante Naturstoffe sind Vanillin und Vanillinsäure. Der natürliche Vanilleextrakt wird in einem aufwendigen und mehrstufigen Bearbeitungsprozess, z. B. durch alkoholische Extraktion, aus getrockneten oder fermentierten Schoten der Gewürzvanille (Vanilla planifolia Andrews) gewonnen (Walton et al., 2003; Delaquis et al., 2004). Hauptbestandteil des Extraktes ist Vanillin (4-Hydroxy-3-methoxybenzaldehyd).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2: Strukturformel von Vanillin

Vanillin gehört zu den Hauptgeschmackstoffen weltweit. Die Substanz wird verschiedenen Lebensmitteln zugesetzt, wie beispielsweise Eis und Backwaren. Aufgrund der aufwendigen und kostenintensiven Verarbeitung natürlicher Vanille, werden 90 % des Vanillins synthetisch aus Eugenol, Lignin oder Guaiacol hergestellt. Dies muss dann als „naturidentisch“ deklariert werden (Hocking, 1997). Vanillin bildet farblose oder crèmefarbene bis hellgelbe, meist prismatisch-nadelförmige Kristalle, die in Ethanol gut löslich sind. In 20 °C warmen Wasser löst sich Vanillin eher schlecht (etwa 1 g in 100 ml), in 80 °C heißem Wasser dagegen besser (ca. 5 g in 100 ml). Unter dem Einfluss von Licht und feuchter Luft zersetzt sich der Stoff langsam unter Braunfärbung (Bildung von Dehydrodivanillin bzw. Oxidation zu Vanillinsäure) (Delaquis et al., 2005).

Außerdem sind in natürlichem Vanilleextrakt geringe Mengen an Vanillinsäure (4-Hydroxy-3- methoxybenzoesäure) und mehr als 200 andere Bestandteile in Spuren enthalten (Boyce et al., 2003).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 3: Strukturformel von Vanillinsäure

Vanillin und Vanillinsäure besitzen antimikrobielle Eigenschaften. In verschiedenen Untersuchungen konnte Vanillin eine antioxidative Wirkung nachgewiesen werden, wie z. B. in der Studie von Burri et al. (1989). Es wurde berichtet, dass Vanillin in Lebensmitteln mit mehrfach ungesättigten Fettsäuren antioxidativ wirkt. Außerdem konnte eine antimutagene und fungistatische bzw. fungizide Wirksamkeit nachgewiesen werden (Fitzgerald, 2005). Die Wirkung von Vanillin gegen Pilze konnte in vitro, in verschiedenen Nährmedien, und in vivo, in Fruchtpürree enthaltenen Lebensmitteln und Fruchtsäften, nachgewiesen werden. Vanillinsäure hemmt die Hefe Saccharomyces cerevisiae. Vergleichsweise wenig ist bekannt

über den Effekt von Vanillin und Vanillinsäure auf Bakterien (Delaquis et al., 2004). Arbeiten von Ratunanga et al. (1997) zeigten, dass Vanillinsäure das Wachstum von Zymomonas mobilis hemmt. Katayama und Nagai (1960) berichteten, dass Vanillin eine sehr starke Hemmung bei grampositiven Bakterien, wie Bacillus subtilis verursacht, aber nur eine geringe Wirkung gegen gramnegative aufwies. Die hemmende Wirkung von Vanillin auf grampositive Bakterien wurde durch die Versuche im Zusammenhang mit Joghurt von Tipparaju et al. (2004) bestätigt.

1.3 Methylparaben

Chemische Konservierungsstoffe werden eingesetzt, um den mikrobiellen Verderb von Lebensmitteln zu verzögern und zu vermindern. Dabei wird das Wachstum der Mikroorganismen durch meist unspezifische Wirkungen auf den Stoffwechsel gehemmt. Zu diesen Konservierungsmitteln gehören die PHB-Ester (para-hydroxy-Benzoesäureester, auch Parabene genannt). Die Parabene sind antibakteriell wirksame Konservierungsmittel, die zur Verwendung in Lebensmitteln, Arzneimitteln, Kosmetika und Toilettenartikeln zugelassen sind (EFSA, 2004). Die Deklaration PHB-Ester umfasst eine Reihe von Verbindungen mit ähnlichen Eigenschaften. Basis ist PHB-Ester, eine Verbindung aus der Benzoesäure und Phenol (aromatischer Kohlenwasserstoff). Die einzelnen PHB-Ester- Varianten unterscheiden sich etwa bei der mikrobiellen Wirksamkeit und der Löslichkeit in Fetten oder Wasser. Oft werden Mischungen verschiedener PHB-Ester eingesetzt, die optimal auf das zu konservierende Lebensmittel zugeschnitten sind. PHB-Ester wurden als Alternative zu Sorbinsäure und Benzoesäure entwickelt, deren Anwendungsgebiet auf den sauren Bereich beschränkt ist (Schulte, 1995). Dagegen sind PHB-Ester sowohl in saurer wie alkalischer Umgebung wirksam. Die konservierende Wirkung von PHB-Ester- Verbindungen beruht darauf, dass Zellmembran und Proteine im Zellkern zerstört werden. Nachteilig ist jedoch, dass die PHB-Ester in den damit konservierten Lebensmitteln leicht geschmacklich hervortreten können (Lück, 1986). Außerdem wird ein starkes allergenes Potenzial vermutet. Auch pseudoallergische Reaktionen sind möglich. Methylparaben ist in der Europäischen Union gemäß der Richtlinie 95/2/EG als Lebensmittelzusatzstoff in vier Kategorien verarbeiteter Lebensmittel zugelassen: Zur Oberflächenbehandlung von getrockneten Fleischerzeugnissen, in Geleeüberzügen von Fleischerzeugnissen, in Süßwaren sowie in flüssigen, diätetischen Nahrungsergänzungsmitteln (EFSA, 2004).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 4: Strukturformel von Methylparaben

1.4 Ziel der Arbeit

Ziel der Arbeit war, die antibakterielle Wirkung von ausgewählten Naturstoffen auf das Wachstum von L. monocytogenes zu untersuchen. Das Verhalten des Keims wurde im Hinblick auf den Einfluss verschiedener Parameter erforscht. Zu diesen Einflussfaktoren gehörten die Temperatur, der pH-Wert, das Nährstoffangebot des Mediums und die Wirkung verschiedener Zusatzstoffe (Oleuropein, Vanillin und Vanillinsäure). Der Fokus lag auf der Wirkung dieser Naturstoffe. Als erstes wurde die Wirkung der drei Naturstoffe auf das Wachstum von L. monocytogenes in vitro untersucht. Die wirksamste Substanz wurde dann im Räucherlachs eingesetzt, um deren Effekt im Lebensmittel zu erforschen. Neben den Naturstoffen Oleuropein, Vanillin und Vanillinsäure kam ein chemischer Konservierungsstoff, Methylparaben, zum Einsatz, um einen Vergleich hinsichtlich der Wirkungsstärke ziehen zu können. Des Weiteren wurde untersucht, ob die Ergebnisse der kulturell-mikrobiologischen Nachweismethode mit denen einer molekularbiologischen Untersuchung verglichen werden können.

2 Material

2.1 Mikroorganismen, verwendetes Primerpaar und sonstiges

2.1.1 Mikroorganismen

Der in dieser Arbeit verwendete Räucherlachs wurde mikrobiologisch-kulturell untersucht. Diese Untersuchung umfasste den Nachweis verschiedener Mikroorganismen. In Tabelle 1 sind die, für den Ansatz der einzelnen Positivkontrollen, eingesetzten Mikroorganismen zusammengefasst.

Tabelle 1: Die, bei der mikrobiologischen Statusbestimmung des Räucherlachses, verwen- deten Mikroorganismen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen

2.1.2 Verwendetes Primerpaar

Das in dieser Arbeit verwendete Primerpaar wurde im Rahmen einer Diplomarbeit konzipiert. Es wurde bezüglich seiner Spezifität innerhalb einer PCR getestet, wobei auch für andere lebensmittelrelevante Mikroorganismen unverwünschte Nebenprodukte gebildet wurden (Osinski, 2005). Nach der Lieferung lagen die Primer im lysophiliertem Zustand vor. Für den weiteren Gebrauch wurden sie in sterilem A. reinst in der vom Lieferanten angegebenen

Menge (LIMF: 185, 22 µg; LIMR: 145, 89 µg) gelöst. Auf diese Weise erhielt man eine Stocklösung von 100 pmol/l. Um diese für eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) einsetzen zu können, wurde eine 1:2 Verdünnung angesetzt, um eine Konzentration von 50 pmol/ zu erhalten. Der Stock und die Verdünnung wurden bei -20 °C gelagert. Tabelle 2 listet die Oligonukleotide auf, die für die PCR verwendet wurden.

Tabelle 2: Das verwendete Primerpaar

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Das verwendete Primerpaar LIMF/LIMR wurde von Invitrogen GmbH, Karlsruhe bezogen.

2.1.3 Sonstiges

Auswertungssoftware:

LightCycler® Software 3.5 Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

2.2 Nährmedien

Für die in vitro und in vivo durchgeführten Wachstumsversuche von L. monocytogenes und für die Statusbestimmung des Räucherlachses wurden verschiedene Nährmedien verwendet.

2.2.1 Für in vitro Versuche verwendete Nährmedien

Vollmedium: TSY-B (Trypticase-Soja-Bouillon-Listeria-Anreicherungsbouillon) (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, England)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Falls nicht anders angegeben, wurden die verwendeten Aminosäure- und VitaminStammlösungen vor Gebrauch sterilfiltriert.

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Der Agar wird für 15 Minuten bei 121 C sterilisier t. Nach Abkühlen auf 50 °C wird ein Fläschchen Palcam-Selektivsupplement pro 500 ml Agar zugegeben. Das Selektiv- supplement liegt als Lyophilisat vor, das im Originalfläschchen durch Zugabe von sterilem

A. dest. (ca. 1,0 ml) gelöst wird. Der Inhalt eines Fläschchens wird in 500 ml sterilem, auf ca. 50-45 °C abgekühltem Basisnährboden gleichmäßig ein gemischt. pH 7,0±0,2

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Zusatz: Palcam-Listeria-Selektivsupplement (Merck KGaA, Darmstadt)

Die Bouillon wird für 15 Minuten bei 121 C sterili siert. Nach Abkühlen auf 50 °C wird ein Fläschchen Palcam-Selektivsupplement pro 500 ml Bouillon zugegeben. Durch vorsichtiges Umschwenken wird das Selektivsupplement homogen in die Nährbouillon eingemischt. pH 7,4±0,2

Nachweis der aeroben mesophilen Gesamtkeimzahl:

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Der Agar wird bis zum vollständigen Lösen erhitzt und dann für 15 Minuten bei 121 °C autoklaviert. pH 7,0± 0,2

Nachweis von Bacillus cereus: Cereus-Selektivagar

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Zusatz: Eigelb-Emulsion (100 ml/l)

(Oxoid, Basingstoke, Hampshire, England) Bacillus cereus-Selektivsupplement (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, England)

Typische Zusammensetzung je Röhrchen: Polymyxin B 50000 IE.

Der Agar wird 15 Minuten bei 121 °C sterilisiert. N achdem dieser auf ca. 50 °C abgekühlt ist, werden zu 475 ml der Agarbasis noch 50 ml sterile Eigelb-Emulsion und ein Röhrchen Bacillus cereus-Selektivsupplement zugegeben und gut vermischt. pH 7,2± 0,2

Nachweis von Clostridium perfringens:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

9 ml der Bouillon werden jeweils in Reagenzröhrchen verteilt, mit Durham-Röhrchen bestückt, die mit der Öffnung nach unten in die Röhrchen gegeben werden, und 15 Minuten bei 121 °C sterilisiert. pH 7,1± 0,2

Nachweis von coliformen Keimen/E.coli:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Zubereitung:

9 ml der Bouillon werden jeweils in Reagenzröhrchen verteilt und mit Durham-Röhrchen, die mit der Öffnung nach unten in die Röhrchen gegeben werden, bestückt. Die Bouillon wird dann 15 Minuten bei 121 °C sterilisiert. pH 6,8±0,2

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Zubereitung:

Der Agar wird bis zum vollständigen Lösen vorsichtig erhitzt. pH 7,4±0,2

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Zubereitung:

Der Agar wird 15 Minuten bei 121 °C sterilisiert. p H 6,6± 0,2

Nachweis von Lactobacillus casei:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Zubereitung:

Der Agar wird 15 Minuten bei 121 °C sterilisiert. p H 5,7± 0,2

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Zubereitung:

Die Sterilisation erfolgt durch Autoklavieren bei 121 °C für 15 Minuten. pH 7,2±0,2

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Zubereitung:

Die Lösung wird auf Reagenzgläser verteilt und bei 121 °C für 15 Minuten durch

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Zubereitung:

Eine Flasche Supplement wird in 1000 ml A. dest. eingemischt. Eine Flasche Nährbodenpulver wird dazugegeben und gut umgeschwenkt bis der Nährboden vollständig suspendiert ist. Der Ansatz muss dann unter häufigem Schwenken im Dampftopf kochen bis sich alle Bestandteile gelöst haben (ca. 20-40 min). pH 7,3±0,2

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Zubereitung:

Die Bouillon wird zum vollständigen Lösen erhitzt und dann auf 50 °C abgekühlt. Unmittelbar vor Gebrauch werden 20 ml einer Jod-Jodkalium-Lösung zugegeben. Anschließend wird der gelöste Inhalt von vier Röhrchen Novobiocin-Selektiv-Supplement aseptisch zugegeben. Die Bouillon wird gut gemischt und in geeignete Endgefäße abgefüllt. pH 8,2±0,2

XLD-Agar (Xylose-Lysin-Desoxycholat-Agar)

(Merck KGaA, Darmstadt)

Zusammensetzung: (g/l A. dest.)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Zubereitung:

Der Ansatz muss unter häufigem Schwenken im Dampftopf kochen bis sich alle Bestandteile gelöst haben. pH 7,4± 0,2

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Zubereitung:

Zusatz: Eigelb-Kaliumtellurit-Emulsion

(Oxoid, Basingstoke, Hampshire, England)

Typische Zusammensetzung (g/l A. dest.):

Eigelb-Emulsion mit 0,21 % (w/v) Kaliumtellurit.

Der Agar wird für 15 Minuten bei 121 C sterilisier t. Nachdem er auf 50 °C abgekühlt ist, werden 50 ml sterile Eigelb-Kaliumtellurit-Emulsion zugegeben. pH 6,8±0,2

2.3 Naturstoffe

2.3.1 Oleuropeinhaltiger Olivenblätterextrakt

Aus dem Olivenblätterextrakt mit einem Gehalt von 40 % Oleuropein wurden zwei unterschiedlich konzentrierte Stammlösungen, die 100x konzentriert waren, angesetzt. Die erste Stammlösung hatte eine Konzentration von 1,25 g/ml Olivenblätterextrakt (500 µg/ml reines Oleuropein). Die zweite Stammlösung hatte eine Konzentration von 2,5 g/ml Olivenblätterextrakt (1000 µg/ml reines Oleuropein). Für die einzelnen Stammlösungen wurde die entsprechende Menge Olivenblätterextrakt in 10 ml MeOH gelöst. Abschließend wurden die Stammlösungen sterilfiltriert und bei Raumtemperatur gelagert.

2.3.2 Vanillin

(MG = 152,15 g/mol)

Für die Versuche mit Vanillin wurden in Abhängigkeit vom pH-Wert zwei unterschiedlich konzentrierte Stammlösungen hergestellt. Für pH 5 wurde eine 230 mM Vanillin-Stamm- lösung und für pH 7 eine 270 mM Stammlösung separat für Minimal- und Vollmedium angesetzt. Die entsprechende Menge an Vanillin wurde abgewogen, in einigen Tropfen 70 %igen EtOH gelöst und mit 0,25x Bouillon aufgefüllt. Bei der Bouillon handelte es sich für den Einsatz der Stammlösung im Minimalmedium um MWB und im Vollmedium um TSY Bouillon. Die Bouillon wurde auf 50 °C erhitzt und dem Vanillin zugeführt. Der pH-Wert wurde in der noch warmen Flüssigkeit mit 3 M NaOH eingestellt. Die Messungenauigkeit des pH-Wertes aufgrund seiner Temperaturabhängigkeit wurde toleriert, zugunsten der Tatsache, dass das Vanillin nach Abkühlen der Stammlösung ohne vorherige pH-Wert- Einstellung wieder ausfallen würde. Abschließend wurde die Stammlösung sterilfiltriert und bei 7 °C gelagert.

2.3.3 Vanillinsäure

(MG = 168,15 g/mol)

Für die Versuche mit Vanillinsäure wurden, abhängig vom pH-Wert, drei unterschiedlich konzentrierte Stammlösungen hergestellt. Die Stammlösung für pH 5 hatte eine Konzentration von 100 mM Vanillinsäure. Für pH 6,2 war sie 575 mM konzentriert und für pH 7 betrug die Konzentration der Vanillinsäure-Stammlösung 1000 mM. Die Stamm- lösungen wurden sowohl für das Minimal- als auch für das Vollmedium angesetzt, mit einer Ausnahme: die Vanillinsäure-Stammlösung für pH 6,2 wurde nur für das Vollmedium hergestellt. Die entsprechende Menge Vanillinsäure wurde in einigen Tropfen 70 %igen EtOH gelöst und die passende Menge an 0,25x Bouillon hinzugegeben, die zuvor auf 80 C im Wasserbad erhitzt worden war. Der pH-Wert wurde in der noch warmen Vanillinsäure- Stammlösung mit 3 M NaOH eingestellt. Nach Abkühlen wurde die Stammlösung sterilfiltriert und bei 7 °C gelagert.

2.4 Methylparaben

Unabhängig vom pH-Wert und dem verwendeten Medium wurde Methylparaben 100 %ig in

70 %igem EtOH gelöst und anschließend sterilfiltriert. Die Stammlösung wurde bei Raumtemperatur gelagert.

2.5 Das eingesetzte Lebensmittel

Für die in dieser Arbeit durchgeführten in vivo Versuche wurde Räucherlachs verwendet. Dieser wurde in handelsüblicher Packungsgröße (200 g) bei einem Lebensmittel-Discounter eingekauft und bis zu seiner endgültigen Verwendung bei 7 °C gelagert.

Skandinavischer Räucherlachs:

Zutaten: Lachs (Salmo Salar), Salz, Rauch

- aus Aquakultur/Norwegen
- „unter Schutzatmosphäre verpackt“
- Lot.NR. 0106068
- PL 22121818 WE

2.6 Puffer und Lösungen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.7 Geräte, Chemikalien und sonstige Materialien

2.7.1 Geräte

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.7.2 Chemikalien

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.7.3 Sonstige Materialien

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

3 Methoden

3.1 In vitro Versuche: Kulturell-mikrobiologische Methoden

3.1.1 Stammhaltung von L. monocytogenes

Mit dem verwendeten Stamm Listeria monocytogenes DSMZ 12464 wurde eine Plattenkultur angelegt. Als Medium diente TSY - Agar. Nach Beimpfen wurde die Kultur für 24 Stunden bei 30 °C inkubiert und alle vier Wochen passagiert. Di e Lagerung erfolgte bei 7 C.

3.1.2 Allgemeine Anzucht von L. monocytogenes

Das Wachstum von L. monocytogenes wurde in zwei Medien bei zwei verschiedenen Inkubationstemperaturen untersucht. Die Anzucht von L. monocytogenes erfolgte in einem Vollmedium (TSY B) und einem Minimalmedium (MWB). Für das Vollmedium wurden zunächst zwei Vorkulturen angesetzt, d. h. von einer mit L. monocytogenes beimpften TSY-Nähragarplatte wurde etwas Impfmaterial mit einer sterilen Impföse in je ein mit ca. 20 ml flüssigem Vollmedium versetzten Falcon-Röhrchen überimpft. Ein Falcon-Röhrchen wurde bei 30 °C im Brutschrank über Nacht inkubiert . Das andere wurde bei 7 C im Kühlschrank 48 Stunden bebrütet. Aus diesen Vorkulturen wurden dann die Hauptkulturen angesetzt, indem je 0,5 ml der Vorkultur in ein Falcon-Röhrchen mit je 20 ml flüssigem Vollmedium überimpft und für 24 Stunden bei 30 °C u nd 7 °C inkubiert wurden. Für die Anzucht von L. monocytogenes im Minimalmedium wurde nach dem gleichen Prinzip vorgegangen, jedoch wurde die Inkubationszeit der Vor- und Hauptkultur bei 7 C auf 48 Stunden erhöht.

3.1.3 Spezielle Anzucht von L. monocytogenes : die Wirkung der ausgesuchten Naturstoffe in unterschiedlichen pH- und Temperaturbereichen als in vitro Versuch

Verschiedene Komponenten wurden dem verwendeten Minimal- und Vollmedium zugesetzt, um das Wachstumsverhalten von L. monocytogenes in Abhängigkeit von pH-Wert und Temperatur zu untersuchen. Bei den Komponenten handelte es sich um oleuropeinhaltigen Olivenblätterextrakt, Vanillin und Vanillinsäure. Eine Übersicht liefert Tabelle 3.

Tabelle 3: Übersicht der durchgeführten Wachstumsexperimente im Minimal- und Voll- medium. Die zugesetzten Komponenten, sowie der pH- und Temperaturwert wurden variiert.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

3.1.3.1 Oleuropeinhaltiger Olivenblätterextrakt

Der Versuch mit Olivenblätterextrakt fand nur im Vollmedium (TSY B) bei 30 °C statt. Untersucht wurde das Wachstumsverhalten von L. monocytogenes unter Zusatz von Oliven- blätterextrakt bei pH 5 und pH 7. Nachdem zwei Vorkulturen des Bakteriums, wie unter 3.1.2 beschrieben, angesetzt wurden, konnten die Hauptkulturen in Falcon-Röhrchen beimpft werden. Es wurden zwei unterschiedliche Konzentrationen des Olivenblätterextraktes eingesetzt, mit den Endkonzentrationen von 500 und 1000 µg/ml an reinem Oleuropein. In Tabelle 4 werden die verwendeten Stammlösungen und Endkonzentrationen in Abhängigkeit vom pH-Wert zusammenfassend dargestellt. Da bei der Herstellung der Olivenblätterextrakt- Stammlösung Methanol als Lösungsmittel verwendet wurde, lief als Kontrolle eine mit L. monocytogenes beimpfte und mit Methanol versetzte TSY Bouillon ebenfalls als Kontrolle mit. Des Weiteren lief als Kontrolle eine beimpfte TSY Bouillon mit. Der gesamte Versuch wurde im Doppelansatz durchgeführt.

Tabelle 4: Pipettierschema für die Beimpfung mit L. monocytogenes und die Zugabe der unterschiedlichen Konzentrationen des Olivenblätterextraktes in 20 ml TSY Bouillon

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

3.1.3.2 Vanillin

Der Versuch mit Vanillin fand sowohl im Minimal- als auch im Vollmedium, bei 7 und 30 C und bei pH 5 und 7 statt. Bei pH 5 wurde eine Stammlösung mit einer Konzentration von 230 mM eingesetzt. Ausgehend von dieser wurde der Einfluss von Vanillin mit einer Endkonzentration von 11,5 mM und 23 mM im Medium auf das Wachstum von

L. monocytogenes untersucht. Bei pH 7 wurde von einer 270 mM Stammlösung und den Endkonzentrationen von 13,5 mM und 27 mM ausgegangen. In Tabelle 5 werden die verwendeten Stammlösungen und Endkonzentrationen in Abhängigkeit vom pH-Wert zusammenfassend dargestellt. Als Kontrolle lief jeweils ein beimpftes Medium mit. Der gesamte Versuch wurde im Doppelansatz durchgeführt.

Tabelle 5: Pipettierschema für die Beimpfung mit L. monocytogenes und die Zugabe der unterschiedlichen Konzentrationen des Vanillins in 20 ml Nährmedium

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

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