Seit Anfang der 80er Jahre hat sich die Meinung der Konsumenten bezüglich der Anwendung
von Konservierungsstoffen in Lebensmitteln sehr gewandelt. Der aufgeklärte und gesundheitsbewusste Verbraucher der heutigen Zeit wünscht sich einerseits hochwertige, naturbelassene, konservierungsstofffreie Lebensmittel. Andererseits verlangt er, dass diese keimfrei und möglichst lange haltbar sind. Jedoch sind Lebensmittel in der Regel nicht frei von Keimen. Sie enthalten neben erwünschten Mikroorganismen, wie z. B. Milchsäurebakterien und Kulturschimmel, auch unerwünschte Keime wie Verderbnis- und Krankheitserreger. Zu Letzteren gehören die Listerien, wobei von den sechs Spezies, die zum Genus Listeria gehören, Listeria monocytogenes die weitaus bedeutendste humanpathogene Art ist. Dieser Keim ist verantwortlich für die Listeriose, eine Lebensmittelinfektion. Eine Exposition verläuft bei gesunden Erwachsenen meist unbemerkt, stellt jedoch eine Gefahr für Schwangere und deren ungeborene Kinder, sowie für Immungeschwächte, vorwiegend ältere Personen, dar. Eine Infektion mit L. monocytogenes kann zu Früh- oder Totgeburt und Neugeborenenlisteriose bzw. zu Hirn- und Hirnhautentzündung und Sepsis führen. Diese Krankheitsformen verlaufen in 20 - 30 % der Fälle tödlich. L. monocytogenes ist in der Umwelt weit verbreitet. Aus diesem Grund gibt es nur wenige frische Lebensmittel, die dieses Bakterium nicht enthalten. Besonders anfällige Produkte sind neben Weichkäse, Wurst, Fertigsalaten, gekühlten Fertiggerichten, abgepacktem Gemüse und Rohkost auch abgepackter Lachs und Räucherfisch. Der Verzehr der letztgenannten Produkte stellt einen Listeriose-Risikofaktor dar, da L. monocytogenes sich leicht in geräuchertem Fisch nachweisen lässt, bzw. die Inokulation von geräuchertem Fisch mit L. monocytogenes zu einem sehr starken Wachstum führt. Den Wünschen der Verbraucher entsprechend, konservierungsstofffreie und lang haltbare Lebensmittel anbieten zu können, hat die Ernährungsindustrie begonnen, verstärkt die Wirkungsweise natürlicher antimikrobieller Substanzen zu erforschen. Verschiedene Pflanzen und die daraus gewonnenen Extrakte, die in Lebensmitteln aufgrund ihres Geschmackes und ihres Aromas eingesetzt werden, weisen die gewünschte antimikrobielle Wirksamkeit auf. Sie können somit eine Alternative zu den chemischen Konservierungsmitteln darstellen.
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG
1.1 LISTERIA MONOCYTOGENES
1.1.1 Historischer Hintergrund
1.1.2 Eigenschaften und Vorkommen
1.1.3 L. monocytogenes in Lebensmitteln, mit besonderem Augenmerk auf Räucherlachs
1.2 NATURSTOFFE
1.2.1 Oleuropein
1.2.2 Vanillin und Vanillinsäure
1.3 METHYLPARABEN
1.4 ZIEL DER ARBEIT
2 MATERIAL
2.1 MIKROORGANISMEN, VERWENDETES PRIMERPAAR UND SONSTIGES
2.1.1 Mikroorganismen
2.1.2 Verwendetes Primerpaar
2.1.3 Sonstiges
2.2 NÄHRMEDIEN
2.2.1 Für in vitro Versuche verwendete Nährmedien
2.2.2 Für in vivo Versuche verwendete Nährmedien
2.3 NATURSTOFFE
2.3.1 Oleuropeinhaltiger Olivenblätterextrakt
2.3.2 Vanillin
2.3.3 Vanillinsäure
2.4 METHYLPARABEN
2.5 DAS EINGESETZTE LEBENSMITTEL
2.6 PUFFER UND LÖSUNGEN
2.7 GERÄTE, CHEMIKALIEN UND SONSTIGE MATERIALIEN
2.7.1 Geräte
2.7.2 Chemikalien
2.7.3 Sonstige Materialien
3 METHODEN
3.1 IN VITRO VERSUCHE: KULTURELL-MIKROBIOLOGISCHE METHODEN
3.1.1 Stammhaltung von L. monocytogenes
3.1.2 Allgemeine Anzucht von L. monocytogenes
3.1.3 Spezielle Anzucht von L. monocytogenes : die Wirkung der ausgesuchten Naturstoffe in unterschiedlichen pH- und Temperaturbereichen als in vitro Versuch
3.1.3.1 Oleuropeinhaltiger Olivenblätterextrakt
3.1.3.2 Vanillin
3.1.3.3 Vanillinsäure
3.1.4 Spezielle Anzucht von L. monocytogenes : die Wirkung von Methylparaben als in vitro Versuch
3.1.5 Messung des bakteriellen Wachstums
3.2 IN VIVO VERSUCHE: KULTURELL-MIKROBIOLOGISCHE METHODEN
3.2.1 Probenentnahme
3.2.2 Kulturell-mikrobiologische Methoden zur Untersuchung des Keimstatus des Räucherlachses in Anlehnung an die LFGB § 64 Untersuchungsvorschriften
3.2.3 Versuchsaufbau zur Untersuchung der Wirkung von Vanillinsäure und Methylparaben, einzeln und in kombinierter Weise, auf das Wachstum von L. monocytogenes im Räucherlachs bei 7 und 30 °C als in vivo Modell
3.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN
3.3.1 DNA-Isolierung von L. monocytogenes aus Kultur und Räucherlachs
3.3.1.1 DNA-Isolierung von L. monocytogenes aus Kultur
3.3.1.2 DNA-Isolierung von L. monocytogenes aus Räucherlachs
3.3.2 Photometrische Reinheits- und Konzentrationsbestimmung isolierter DNA
3.3.3 Nachweis und Quantifizierung von L. monocytogenes-DNA mittels PCR
3.3.3.1 Quantitative Analyse mittels Real-Time PCR
3.3.3.1 Qualitative PCR-Analyse mit anschließender Agarose-Gelelektrophorese
4 ERGEBNISSE
4.1 IN VITRO VERSUCHE: WACHSTUMSKURVEN VON L. MONOCYTOGENES UNTER DEM EINFLUSS VERSCHIEDENER ZUSATZSTOFFE
4.1.1 Einfluss von oleuropeinhaltigem Olivenblätterextrakt auf das Wachstum von L. monocytogenes im Vollmedium
4.1.2 Einfluss von Vanillin auf das Wachstum von L. monocytogenes
4.1.2.1 Einfluss von Vanillin auf das Wachstumsverhalten von L. monocytogenes im Minimalmedium
4.1.2.2 Einfluss von Vanillin auf das Wachstumsverhalten von L. monocytogenes im Vollmedium
4.1.3 Einfluss von Vanillinsäure auf das Wachstum von L. monocytogenes
4.1.3.1 Einfluss von Vanillinsäure auf das Wachstumsverhalten von L. monocytogenes im Minimalmedium
4.1.3.2 Einfluss von Vanillinsäure auf das Wachstumsverhalten von L. monocytogenes im Vollmedium
4.1.4 Einfluss von Methylparaben auf das Wachstum von L. monocytogenes
4.1.4.1 Einfluss von Methylparaben auf das Wachstumsverhalten von L. monocytogenes im Minimalmedium
4.1.4.2 Einfluss von Methylparaben auf das Wachstumsverhalten von L. monocytogenes im Vollmedium
4.2 IN VIVO VERSUCHE: KULTURELL – MIKROBIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN
4.2.1 Bestimmung des Keimstatus des Räucherlachses mittels kulturell–mikrobiologischer Methode
4.2.2 Einfluss von Vanillinsäure und Methylparaben auf das Wachstum von L. monocytogenes im Räucherlachs im 7 und 30 °C Lagerversuch
4.2.2.1 7 °C Räucherlachs Lagerversuch
4.2.2.2 30 °C Räucherlachs Lagerversuch
4.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN
4.3.1 DNA-Konzentrationen der in vitro Versuche
4.3.2 Vergleich der ermittelten DNA-Konzentration von L. monocytogenes mit der gemessenen OD600 im in vitro Versuch
4.3.3 DNA-Konzentrationen der in vivo Versuche
4.3.4 Vergleich der ermittelten DNA-Konzentration von L. monocytogenes mit der Keimzahl im in vivo Versuch
4.3.5 Überprüfung der Spezifität der PCR Produkte der Real-Time PCR
4.3.5.1 Analyse der Schmelzkurve und der Gelelektrophorese der PCR-Produkte der in vitro Proben
4.3.5.2 Analyse der Schmelzkurve und der Gelelektrophorese der PCR-Produkte der in vivo Proben
5 DISKUSSION
5.1 OLEUROPEIN
5.2 VANILLIN
5.3 VANILLINSÄURE
5.4 METHYLPARABEN
5.5 EINSATZ VON VANILLINSÄURE UND METHYLPARABEN IM RÄUCHERLACHS BEI 7 UND 30 °C
5.6 VERGLEICH DES KULTURELL-MIKROBIOLOGISCHEN NACHWEISES VON L. MONOCYTOGENES MIT DER MOLEKULARBIOLOGISCHEN METHODE
6 ZUSAMMENFASSUNG
7 AUSBLICK
8 LITERATUR
Zielsetzung & Themen
Ziel der Arbeit war es, die antibakterielle Wirkung ausgewählter pflanzlicher Naturstoffe (Oleuropein, Vanillin, Vanillinsäure) sowie des chemischen Konservierungsmittels Methylparaben auf das Wachstum von Listeria monocytogenes in vitro und in vivo im Lebensmittel Räucherlachs zu erforschen. Dabei wurde untersucht, wie sich verschiedene Einflussfaktoren wie Temperatur, pH-Wert und Nährstoffangebot auf die Wirksamkeit dieser Substanzen auswirken und ob molekularbiologische Nachweisverfahren (Real-Time PCR) mit klassischen kulturellen Methoden korrelieren.
- Antimikrobielle Eigenschaften natürlicher Pflanzenextrakte im Vergleich zu chemischen Konservierungsmitteln
- Einfluss von Umweltparametern (Temperatur, pH-Wert, Nährmedium) auf das Wachstum von L. monocytogenes
- Wirksamkeit der Naturstoffe in einem realen Lebensmittelmodell (Räucherlachs)
- Validierung molekularbiologischer quantitativer Nachweismethoden mittels Real-Time PCR im Vergleich zur kulturellen Bestimmung
- Potential der Substanzen als natürliche Alternativen zur Lebensmittelkonservierung
Auszug aus dem Buch
1.2 Naturstoffe
In der Lebensmittelindustrie wächst das Interesse an Naturstoffen, die eine antimikrobielle Aktivität besitzen und somit möglicherweise als natürliches Konservierungsmittel eingesetzt werden können (Beuchat & Golden, 1989). Die Konsumenten fordern verstärkt hochwertige, naturbelassene Lebensmittel, die konservierungsstofffrei sind (Fitzgerald et al., 2005). Natürliche, antimikrobiell wirksame Verbindungen werden von Bakterien (z. B. Nisin aus Lactococcus lactis), von Pflanzen (z. B. phenolische Verbindungen wie Vanillin und Vanillinsäure oder Oleuropein) oder von Tieren (z. B. Enzyme, wie Lysozym, oder andere Proteine, wie Laktoferrin) produziert (Gould, 1996). Die Pflanzen stellen dabei die größte Quelle an möglichen antimikrobiellen Verbindungen dar (Fitzgerald et al., 2005). Man unterscheidet verschiedene Grundlagen der antimikrobiellen Wirkungsweise. Dazu zählen die Reaktion mit der Zellmembran, die Inaktivierung essenzieller Enzyme oder die Zerstörung bzw. Inaktivierung genetischen Materials (Davidson, 1993). Verschiedene Studien haben gezeigt, dass die antimikrobielle Wirkung verschiedener pflanzlicher ätherischer Öle (z. B. Oregano) bzw. deren phenolische Inhaltsstoffe (z. B. Carvacrol) darin besteht, die Zellmembran zu stören, so dass der Verlust der chemoosmotischen Kontrolle letztlich zum Zelltod führt (Fitzgerald et al., 2004). In zahlreichen Studien konnte bewiesen werden, dass eine Vielzahl von natürlichen Inhaltstoffen verschiedener Pflanzen, antimikrobiell gegen L. monocytogenes wirkt (Lin et al., 2004), beispielsweise hemmen Thymol und Carvacrol, enthalten in Oreganoextrakt, erfolgreich das Wachstum von L. monocytogenes. Je nach Lebensmittel inhibieren 150 bis 200 ppm reines Carvacrol oder Thymol signifikant die Vermehrung von L. monocytogenes (Seaberg et al., 2003). Verschiedene Studien haben gezeigt, dass auch Oleuropein antimikrobiell wirksam ist.
Zusammenfassung der Kapitel
1 EINLEITUNG: Die Einleitung beleuchtet die steigende Nachfrage nach natürlichen Konservierungsmitteln, die Problematik von Listeria monocytogenes als Lebensmittelkeim in Produkten wie Räucherlachs und die wissenschaftliche Zielsetzung der Arbeit.
2 MATERIAL: In diesem Kapitel werden die verwendeten Mikroorganismen, Nährmedien, Naturstoffe (Oleuropein, Vanillin, Vanillinsäure) und chemischen Zusätze sowie die technische Geräteausstattung detailliert aufgeführt.
3 METHODEN: Dieser Abschnitt beschreibt die kulturell-mikrobiologischen Anzuchtmethoden, die Durchführung der in vitro und in vivo Wachstumsversuche sowie die molekularbiologischen Untersuchungsschritte (DNA-Isolierung und Real-Time PCR).
4 ERGEBNISSE: Hier werden die gewonnenen Daten aus den Wachstumskurven unter verschiedenen Bedingungen sowie die DNA-Konzentrationsanalysen und Schmelzkurvenauswertungen der PCR-Versuche präsentiert.
5 DISKUSSION: Die Ergebnisse werden kritisch bewertet und in den Kontext der aktuellen wissenschaftlichen Literatur eingeordnet, wobei die Einflüsse von Medium, pH-Wert und Temperatur auf die Wirksamkeit der Naturstoffe diskutiert werden.
6 ZUSAMMENFASSUNG: Eine prägnante Zusammenfassung der wichtigsten Erkenntnisse bezüglich der Wirksamkeit von Oleuropein, Vanillin, Vanillinsäure und Methylparaben sowie der Vergleichbarkeit der kulturellen und molekularbiologischen Nachweismethoden.
7 AUSBLICK: Dieser Abschnitt thematisiert das Listeriose-Risiko bei kalten Lebensmitteln und gibt Anregungen für zukünftige Zulassungsverfahren sowie die Weiterentwicklung von DNA-Isolierungsmethoden.
8 LITERATUR: Umfassendes Verzeichnis der in der Diplomarbeit zitierten wissenschaftlichen Quellen.
Schlüsselwörter
Listeria monocytogenes, Naturstoffe, Oleuropein, Vanillin, Vanillinsäure, Methylparaben, Räucherlachs, Lebensmittelkonservierung, antimikrobielle Wirkung, Real-Time PCR, DNA-Isolierung, kulturelle Nachweismethode, Wachstumshemmung, pH-Wert, Lagertemperatur
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Diplomarbeit grundsätzlich?
Die Arbeit untersucht das Potential ausgewählter natürlicher Substanzen, das Wachstum des humanpathogenen Keims Listeria monocytogenes in Lebensmitteln – speziell in kaltgeräuchertem Lachs – zu hemmen, um chemische Konservierungsmittel zu ersetzen.
Welche zentralen Themenfelder werden bearbeitet?
Die Kerngebiete umfassen die Lebensmittel-Mikrobiologie, die Testung antimikrobieller Wirkstoffe (Phenole wie Oleuropein und Vanilline) sowie die Validierung molekularbiologischer Nachweisverfahren durch Real-Time PCR im Vergleich zur klassischen kulturellen Keimzahlbestimmung.
Was ist das primäre Ziel der Untersuchung?
Das primäre Ziel war die systematische Analyse der antibakteriellen Effekte von Oleuropein, Vanillin und Vanillinsäure auf L. monocytogenes unter Variation von Temperatur, pH-Wert und Nährmedium, um die wirksamste Substanz für den Einsatz in Räucherlachs zu identifizieren.
Welche wissenschaftliche Methode wurde für die Versuche verwendet?
Es kamen primär kulturell-mikrobiologische Methoden zur Bestimmung von Wachstumskurven (Trübungsmessung/OD600) sowie molekularbiologische Techniken wie die DNA-Isolierung mit anschließender quantitativer Real-Time PCR und Agarose-Gelelektrophorese zur Anwendung.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Der Hauptteil gliedert sich in die Materialbeschreibung, die detaillierte Darstellung der experimentellen Methoden, die Ergebnisauswertung der in vitro- und in vivo-Tests sowie eine ausführliche wissenschaftliche Diskussion dieser Resultate.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Forschung am besten?
Besonders relevant sind Listeria monocytogenes, Lebensmittelkonservierung, natürliche antimikrobielle Stoffe (insbesondere Vanillinsäure), Räucherlachs als Modellsystem und die molekularbiologische Analytik mittels Real-Time PCR.
Warum konnte Vanillinsäure als erfolgreichstes Mittel identifiziert werden?
In den durchgeführten in vitro-Vorversuchen zeigte Vanillinsäure im Vergleich zu den anderen getesteten Naturstoffen (Oleuropein, Vanillin) die konsistentesten hemmenden Effekte auf L. monocytogenes, weshalb sie für die weiteren in vivo-Untersuchungen am Räucherlachs ausgewählt wurde.
Welche Herausforderung ergab sich bei der DNA-Isolierung aus Räucherlachs?
Die Isolierung erwies sich als komplex, da das hohe Fettaufkommen des Lachses die Extraktion bakterieller DNA erschwerte und zudem Anzeichen für die Mit-Amplifikation von Fisch-DNA auftraten, was eine präzise Quantifizierung über die molekularbiologische Methode im Vergleich zur kulturellen Methode störte.
- Quote paper
- Yvonne Kirsch (Author), 2006, Antibakterielle Wirkung von ausgewählten Naturstoffen auf das Wachstum von Listeria monocytogenes, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/63077
