Zuerst wird in dieser Arbeit untersucht, welche Parameter die Proteinkristallisation beeinflussen. Dabei wird die Ausprägung dieser Einflussgrößen auf die Kristallisierbarkeit von Proteinen ermittelt und die Eigenschaften der Kristallisationsprodukte eruiert. Besonderes Interesse gilt hierbei der Filtrierbarkeit von Kristallsuspensionen. Ziel ist es, eine Erleichterung und Verkürzung der Filtration durch systematische Anpassung der Kristallisationsbedingungen zu erreichen. Für einen späteren Vergleich der Filtrationseigenschaften werden hierfür die Filtrationswiderstände an Modellpartikeln bekannter Korngrößenverteilung gemessen.
In ausgewählten Systemen bestehend aus Puffer, Salz und dem Protein Lysozym oder Albumin werden zunächst in Gefäßen ohne Energieeintrag Bedingungen gesucht, die einen geeigneten Kristallisationsbereich eingrenzen. Variablen sind hierbei Temperatur, Proteinkonzentration, pH-Wert, Salzart, Salzkonzentration und die Dauer der Kristallisation. Für die unterschiedlichen Bedingungen werden die Produkteigenschaften wie Partikelgröße und Morphologie mit dem Mikroskop sowie die Kinetik der Proteinkristallisation untersucht.
Mit der Erkenntnis geeigneter Kristallisationen werden dann Experimente in diskontinuierlich arbeitenden Rührkesseln mit verschiedenen verfahrenstechnischen Parametern durchgeführt, welche eine mechanische Abtrennung mittels Druckfiltration ermöglichen. Das Ergebnis der Kristallisation und Filtration hängt sowohl von der Wahl der chemischen als auch der verfahrenstechnischen Einflüsse ab. Hinsichtlich der chemischen Einflüsse gilt es, eine Optimierung von Salzkonzentration, Salzart sowie Proteinkonzentration bei gleichzeitiger Erhaltung der Proteinaktivität durchzuführen. Bezüglich verfahrenstechnischer Parameter sind bei der Kristallisation die Temperatur, Rührerdrehzahl und die Geometrie des Rührkörpers maßgeblich. Außerdem ist es wichtig, die Verweilzeit des Präzipitats im Rührkessel so zu wählen, dass einerseits möglichst viele Kristalle gewonnen, andererseits diese nicht wieder durch zu langes Rühren zerstört werden. Die durchgeführten Rührkesselkristallisationen sind anhand der Kristallisationskinetik, der Korngrößenverteilung und der Produktbeschaffenheit zu beurteilen. Im Rührkessel hergestellte Kristalle sind bezüglich ihrer Qualität mit geeigneten Methoden zu untersuchen. Nach Beendigung der Kristallisation sollen die Filtrationseigenschaften in einer Druckfiltrationsanlage bestimmt werden.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1.1 Problemstellung
1.2 Aufgabenstellung und Ziel der Arbeit
2 Theoretischer Teil
2.1 Biochemische Grundlagen
2.1.1 Allgemeines zu Proteinen
2.1.2 Hühnereiweiß-Lysozym (HEWL)
2.1.3 Bovine Serum Albumin (BSA)
2.2 Grundlagen der Kristallisation
2.2.1 Kristallisationskinetik
2.2.2 Kristallstruktur und Habitus
2.3 Prozesstechnische Grundlagen
2.3.1 Energieeintrag
2.3.2 Reaktionstechnische Berechnungen
2.4 Grundlagen der Filtration
3 Experimenteller Teil
3.1 Materialien und Methoden
3.1.1 Kristallisation
3.1.2 Filtration
3.2 Kristallisationen
3.2.1 Kristallisation von HEWL ohne Energieeintrag
3.2.2 Kristallisation von HEWL im Rührkessel
3.2.3 Kristallisation von BSA ohne Energieeintrag
3.2.4 Kristallisation von BSA im Rührkessel
3.3 Filtrationen
3.4 Ergebnisse
3.4.1 Kristallisation von Lysozym ohne Energieeintrag
3.4.2 Rührkesselversuche mit Lysozym
3.4.3 Kristallisation von BSA ohne Energieeintrag
3.4.4 Rührkesselversuche mit BSA
3.4.5 Filtrationsergebnisse
3.5 Diskussion
3.5.1 Beurteilung der HEWL-Kristallisationen
3.5.2 Bewertung der Kristallisation von BSA
4 Zusammenfassung
Zielsetzung & Themen der Arbeit
Die Arbeit untersucht die Einflussfaktoren auf die Proteinkristallisation und deren Auswirkungen auf die Filtrierbarkeit der resultierenden Präzipitate, mit dem Ziel, den Kristallisationsprozess prozesstechnisch so zu optimieren, dass eine effiziente mechanische Abtrennung ermöglicht wird.
- Analyse biochemischer Parameter (pH, Salzkonzentration, Proteintyp) bei der Kristallisation.
- Untersuchung des Einflusses von mechanischem Energieeintrag durch Rührprozesse.
- Bestimmung von Filtrationseigenschaften (Filterkuchenwiderstand) mittels Druckfiltration.
- Optimierung der Kristallmorphologie und Partikelgrößenverteilung für bessere Filtrationszeiten.
- Vergleich der Ergebnisse zwischen Modellpartikeln und Proteinkristallen (HEWL und BSA).
Auszug aus dem Buch
1.1 Problemstellung
Biologische Makromoleküle gewinnen zunehmend an Bedeutung. Peptide, Enzyme und Proteine sind als Medikamente in der Medizin nicht mehr wegzudenken. Allein am Beispiel des Peptidhormons Insulin zeigt sich die steigende Nachfrage an industriell hergestellten Biomolekülen. Mittlerweile hat sich diese Nachfrage längst auf andere Bereiche ausgedehnt. Neben der Pharmabranche, mit ihrer Forderung nach hochreinen Substanzen, haben sich vor allem die Kosmetik-, Lebensmittel- und Haushaltsindustrie als Interessenten von biologisch wirksamen Substanzen erwiesen. Dabei kommt es neben der Reinheit, zusätzlich auf die Menge und damit auf die Wirtschaftlichkeit der Produktion an. Werden die geringen Mengen an therapeutischen und analytischen Proteinen meist mit kostenintensiven Methoden, wie der Chromatographie gewonnen, genügt den übrigen industriellen Proteinen oft eine partielle Aufreinigung.
Beispielsweise werden für die Herstellung von Waschmitteln hydrolytische Depolymerasen (Enzyme) in Mengen von 100 kg bis zu mehreren Tonnen pro Jahr produziert [1, 2]. In solchen Prozessen, aber auch als erste Reinigungsstufe der Aufarbeitung zum hochreinen Protein, hat die Kristallisation entscheidende Vorteile gegenüber anderen Trennungsmethoden. Ein einfacher apparativer Aufbau, eine schnelle Prozessführung sowie eine kostengünstige Verfahrensauslegung sind nur ausgewählte Eigenschaften, die für eine Kristallisation sprechen.
Zusammenfassung der Kapitel
1 Einleitung: Beschreibt die zunehmende Bedeutung biologischer Makromoleküle und die Notwendigkeit effizienter, wirtschaftlicher Trennmethoden für industrielle Proteine.
2 Theoretischer Teil: Vermittelt die biochemischen Grundlagen von Proteinen, die Mechanismen der Kristallisation sowie verfahrenstechnische Aspekte des Energieeintrags und der Filtration.
3 Experimenteller Teil: Erläutert die eingesetzten Materialien, die Versuchsaufbauten für Kristallisation und Filtration sowie die methodische Vorgehensweise bei den durchgeführten Experimenten.
4 Zusammenfassung: Fasst die Erkenntnisse über den Einfluss chemischer und verfahrenstechnischer Parameter auf die Kristallqualität und Filtrierbarkeit von HEWL und BSA zusammen.
Schlüsselwörter
Proteinkristallisation, Filtration, Lysozym, HEWL, Albumin, BSA, Ammoniumsulfat, Rührkessel, Filterkuchenwiderstand, Kristallisationskinetik, Aussalzeffekt, Kristallhabitus, Energieeintrag, Phasendiagramm, Trennverfahren.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Diplomarbeit grundsätzlich?
Die Arbeit befasst sich mit der Optimierung der Kristallisation von Proteinen, insbesondere Hühnereiweiß-Lysozym (HEWL) und Bovine Serum Albumin (BSA), um die anschließende Filtration der Kristallsuspensionen effizienter zu gestalten.
Welche zentralen Themenfelder werden bearbeitet?
Die zentralen Felder umfassen die biochemischen Grundlagen der Proteinkristallisation, die verfahrenstechnische Gestaltung des Rührens im Kristallisationsprozess und die mathematische Beschreibung der Filtration mittels Druckfilter.
Was ist das primäre Ziel der Untersuchung?
Das Hauptziel ist die Verkürzung der Filtrationszeit und die Minimierung des Filterkuchenwiderstands durch eine gezielte Anpassung der Kristallisationsbedingungen.
Welche wissenschaftlichen Methoden kommen zum Einsatz?
Es werden Kristallisationsexperimente in Microwells und Rührkesseln durchgeführt, gefolgt von Druckfiltrationsversuchen sowie analytischen Methoden wie UV-Vis-Spektroskopie, Lichtmikroskopie und Röntgenbeugung (XRD).
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Der Hauptteil gliedert sich in eine theoretische Aufarbeitung der Kristallisations- und Filtrationsmechanismen sowie einen umfangreichen experimentellen Teil, in dem verschiedene Einflussgrößen wie Drehzahl, Salzkonzentration und Proteinkonzentration systematisch untersucht werden.
Welche Begriffe charakterisieren die Arbeit am besten?
Zu den wichtigsten Begriffen gehören Proteinkristallisation, Filtrierbarkeit, Filterkuchenwiderstand, Energieeintrag im Rührkessel und das Löslichkeitsverhalten von Proteinen.
Warum unterscheidet sich die Kristallisation von BSA von der von HEWL?
HEWL kristallisiert unter den gewählten Bedingungen besser in isometrischen Formen, während BSA schwieriger zu kristallisieren ist und unter vielen Bedingungen zur Bildung von schwer filtrierbaren amorphen Präzipitaten neigt.
Welchen Einfluss hat der Energieeintrag im Rührkessel auf das Ergebnis?
Ein zu hoher Energieeintrag führt durch Abrieb zu kleineren Kristallen oder zur Zerstörung der Kristallstruktur, was den Filterkuchenwiderstand negativ beeinflusst; ein optimaler Energieeintrag ist daher essenziell für die Filtrierbarkeit.
- Arbeit zitieren
- Dipl.-Ing. (Univ.) Kevin Moritz (Autor:in), 2006, Optimierung der Proteinkristallisation im Hinblick auf Filtrationseigenschaften des Präzipitats, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/69397
