Einführung in die pharmazeutische instrumentelle Analytik

Inhalt

1. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

2. Gas-Chromatographie (GC)

3. Atomabsorptions-Spektroskopie (AAS)

4. Atomemissions-Spektroskopie (Flammen-Photometrie)

5. Polarographie

6. UV-VIS-Spektrometrie

7. Fluorimetrie

8. Infrarot-Spektrometrie (IR)

9. Kernmagnetische Resonanzspektroskopie (nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)

10. Literatur

1. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Die HPLC ist neben der Dünnschicht-Chromatographie (DC) und der Säulenchromatographie (SC) die wichtigste Form der Flüssigkeits-Chromatographie. Die Vorteile der HPLC sind insbesondere ihre im Vergleich zur Säulenchromatographie erhöhte Trennleistung und Empfindlichkeit sowie die verkürzte Analysendauer. Das Prinzip von Säulen-Chromatographie und HPLC ist identisch: Die Säule enthält die sog. Säulenpackung aus porösen Teilchen, und das Zwischenkornvolumen wird mit Fließmittel durchströmt. In den Hohlräumen der Partikel steht das Fließmittel. Die Verzögerung entsteht dadurch, dass die gegebene Substanz in der stationären Phase (in den Poren) länger verweilt als das Fließmittel. Die unterschiedliche Anziehungskraft der stationären Grenzfläche auf unterschiedliche Substanzen heißt Attraktion. Verschiedene Stoffe werden so nach unterschiedlichen Zeiten eluiert und können dann detektiert werden.

Voraussetzung für eine Trennung ist die reversible Adsorption (dynamisches Gleichgewicht mit Desorption), da sonst die Substanz die stationäre Phase nicht mehr verlassen könnte. Die stationäre Phase bewirkt auch auf die flüssige Phase eine Attraktion, die jedoch geringer sein muss als die Attraktion auf die gelösten Substanzen. Maß für die Attraktion des Fließmittels durch die stationäre Phase ist die Fließmittelstärke, nach der die Fließmittel in der eluotropen Reihe geordnet sind. Die „isokratische Elution“ arbeiten mit einer konstanten Fließmittelgeschwindigkeit, die „Gradientenelution“ dagegen mit einer Fließmittelzusammen-setzung, die sich während der Elution verändert. Dies hat oft den Vorteil einer reduzierten Trennzeit mit schmaleren und höheren Banden.

Aufbau der HPLC-Apparatur

Die Versorgungseinheit besteht aus dem Fließmittelreservoir, Pumpe und Filter und erzeugt den Fließmittelfluss durch die Säule. Als Dosiervorrichtung dient das Ventil mit Probenschleife: Die Schleife kann gefüllt werden, während das Fließmittel direkt auf die Säule geht. Danach kann die Schleife zwischen Pumpenausgang und Säule geschaltet werden, so dass die Probe vom Fließmittel mitgespült wird. Die Probe gelangt so auf die Trennsäule und anschließend in den Detektor, der aus verschiedenen Systemen bestehen kann und meist mit PC, Integrator oder Schreiber gekoppelt ist. Optional ist noch ein nachgeordnetes Fraktionierungssystem.

Auswertung mit UV/VIS-Detektoren

Die Auswertung mit UV/VIS-Detektoren beruht auf der Schwächung der Lichtintensität im Zweistrahl-Photometer (nach dem Lambert-Beerschen Gesetz): Der Probenstrahl wird beim Durchgang durch die Probe geschwächt, während der Referenzstrahl durch die Luft geht und den Lichtdetektor (Photozelle) so ungeschwächt erreicht. Bei Verwendung von UV-Detektoren muss die mobile Phase bei der entsprechenden, absorbierenden Wellenlänge der Probe vollständig durchlässig sein. Die qualitative Analyse beruht auf dem Vergleich der Retentionszeiten, die quantitative Analyse erfolgt durch Integration der Extinktions-Peakflächen, aus denen dann nach dem Lambert-Beerschen Gesetz die Konzentration bestimmt werden kann:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

E: Extinktion

[Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten]: molarer Extinktionskoeffizient

c: Konzentration der Substanz

d: Lichtweg durch Probe (Küvettenlänge)

Da c und d konstant sind, ist die Extinktion der Konzentration direkt proportional.

Kalibrierung

Die Kalibrierung erfolgt durch Ermittlung der Peakfläche einer bekannten Konzentration.

a) Kalibrierung mit externem Standard

Es können sowohl eine als auch zwei Standart-Konzentrationen analysiert und die dazugehörige Fläche in ein Koordinatensystem eingetragen werden (1-Punkt-/2-Punkt-Kalibrierung). Eine Probe ist bereits ausreichend, da die Kalibriergerade zwingend durch den Nullpunkt geht:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

b) Kalibrierung mit internem Standard

Es wird nicht das Verhältnis Peakfläche A/Konzentration C bestimmt, sondern die Konzentrations- und Peakflächenverhältnisse der Probe zu denen des inneren Standards.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Der interne Standard muss jedoch einige Anforderungen erfüllen: Der entsprechende Peak muss an einer freien Stelle im Chromatogramm liegen, der Standard soll ähnliche chemische Eigenschaften wie die Probe haben, und die Konzentration des Standards soll in der gleichen Größenordnung liegen wie die Konzentration der Probe.

Sonderformen der HPLC

Je nach Phasensystem unterscheidet man verschiedene Sonderformen:

a) Adsorptions-Chromatographie

Mobile Phase: organisches Lösungsmittel. Stationäre Phase: Kieselgel oder Al2O3

b) Reversed-Phase-Chromatographie

Mobile Phase: Gemisch aus organischem Lösungsmittel und Wasser. Stationäre Phase: Silanisiertes Kieselgel (Reversed-Phase-Material). Die stationäre Phase ist unpolar, die mobile Phase ist polar („reverse“). Die Elutionsreihenfolge ist daher umgekehrt zu der der Adsorptions-Chromatographie: Zuerst werden die polaren, dann die unpolaren Substanzen eluiert.

c) Verteilungs-Chromatographie

Mobile Phase: organisches Lösungsmittel. Stationäre Phase: hydrophile oder lipophile Flüssigkeit. Die Probekomponenten werden zwischen zwei nicht mischbaren Flüssigkeiten verteilt. Die Probemoleküle werden von den Flüssigkeiten nicht adsorbiert, sondern gelöst.

d) Ionenaustauch-Chromatographie

Mobile Phase: Pufferlösung. Stationäre Phase: Ionenaustauscher (Packungen mit sauren (-SO3H; -COOH) oder basischen Gruppen (-NH3+))

e) Affinitäts-Chromatographie

Mobile Phase: Pufferlösung. Stationäre Phase: Affinitätsträger mit spezifischen Liganden (meist biochemische Antigene)

2. Gas-Chromatographie (GC)

Voraussetzung für die Durchführbarkeit einer GC ist, dass die Probe gasförmig ist oder sich unzersetzt in den Gaszustand überführen lässt. Stoffe, die diese Bedingungen nicht erfüllen, können häufig durch Acylierung, Alkylierung oder Silylierung in verdampfbare Stoffe derivatisiert werden. Durch Umwandlung polarer Gruppen in unpolare oder weniger polare wird die Verdampfbarkeit so verbessert. Grundsätzlich sind zwei verschiedene Systeme möglich:

Adsorptionschromatographie (Gas-Fest-Chromatographie)

Die Adsorption der gasförmigen Substanz erfolgt an der Oberfläche fester Sorbentien.

Verteilungschromatographie (Gas-Flüssig-Chromatographie)

Die Verteilung der Substanz erfolgt zwischen Gasphase (mobil) und flüssiger Phase (stationär). Je mehr das Verteilungsgleichgewicht der Substanz auf der Seite der mobilen Phase liegt, desto kürzer ist die Nettoretentionszeit: Verbindungen mit hohem Dampfdruck und/oder niedriger Löslichkeit in der flüssigen (entsprechend stationären) Phase werden relativ früh eluiert. Als Trägergase werden vorwiegend verwendet: Stickstoff (Nachteil: hohe Viskosität); Argon; Helium (Nachteil: teuer); Wasserstoff (Nachteil: mögliche Hydrierung der Probe); Kohlendioxid.

Injektoren

Bei den Injektoren werden zwei verschiedene Systeme unterschieden:

a) Split-Injektion

Die eingegebene Probe wird geteilt (gesplittet): ein kleiner, definierter Teil gelangt auf die Säule, während der Überschuss abfließt. Der Vorteil ist hier, dass Überladungseffekte vermieden werden. Andererseits treten möglicherweise unerwünschte Diskrimierungseffekte auf: Bei Substanzgemischen mit stark unterschiedlichen Siedepunkten kann es dazu kommen, dass der Probenanteil, der auf die Säule gelangt, eine andere Zusammensetzung als der injizierte Anteil hat.

b) Splitlose Injektion

Bei der splitlosen Injektion gelangt die Probe vollständig auf die Probe, sodass Diskriminierungseffekte nicht auftreten können. Dafür muss die Gefahr der Säulenüberladung in Betracht gezogen werden.

Trennsäulen

a) Gepackte Säule: Länge: 0,5-3 m; Durchmesser: 2-4 mm

b) Kapillarsäule: Länge: 10-100 m; Durchmesser: 0,1-0,5 mm

Detektoren

a) Wärmeleitfähigkeits-Detektor (WLD)

Es existieren zwei Messzellen: Eine wird vom reinen Trägergas durchströmt, die andere vom Eluat der Säule (Trägergas + Probe). Die Temperatur in beiden Messzellen wird kontinuierlich durch einen stromdurchflossenen Draht gemessen: Sein Widerstand vergrößert sich proportional zur Temperatur. Die beiden Messdrähte in den beiden Zellen sind nun über eine abgeglichene Wheatston’sche Brücke gekoppelt: Ändert sich die Zusammensetzung des Eluats, so ändert sich auch die Temperatur. Die Brücke ist nun nicht mehr abgeglichen und es entsteht ein elektrisches Signal.

b) Flammenionisations-Detektor (FID)

Der FID ist nur für kohlenstoffhaltige Verbindungen geeignet. Das Eluat wird in eine Wasserstoff-Flamme geleitet, deren Ionisiation zwischen zwei Elektroden gemessen wird. Der zwischen den beiden Elektroden fließende Strom ist den in der Flamme befindlichen Ionen proportional. Zusätzliche Ionen entstehen durch Flammenionisation von im Eluat mitgeführten, organischen Verbindungen. Um die Kammer des FID zu füllen, wird dem Eluat noch reines Trägergas („Make-up-Gas) zugesetzt.

3. Atomabsorptions-Spektroskopie (AAS)

Das Prinzip der AAS beruht auf dem Phänomen der sog. Resonanzabsorption in Gasen. Hierzu werden Anteile der Analysenlösung angesaugt und in eine Flamme gesprüht. Durch thermische Dissoziation werden freie Atome erzeugt, deren Elektronen sich im Grundzustand befinden (Atomdampf). Dieser Atomdampf wird mit dem Spektrum des zu bestimmenden Elementes durchstrahlt, das von einer Hohlkathodenlampe (HKL) erzeugt wird: die HKL enthält als Kathode dasselbe Element, das bestimmt werden soll. Dadurch wird in den Elektronen der Probe derselbe Elektronenübergang angeregt, dem die Strahlung entstammt. Der Anteil der emittierten Strahlung, der vom Atomdampf absorbiert wird, ist der Elementkonzentration proportional (Lambert-Beer'sche Gesetz für die Absorption):

A(l) = a(l) × c × d

Dabei absorbieren die Atome des Dampfes ausschließlich die Wellenlänge, die von der Kathode emittiert wurde (Resonanzwellenlänge der Resonanzlinie), da ja die Resonanzwellenlänge für ein Element konstant ist. (Das heißt, ein Element emittiert bei Anregung genau die Wellenlänge, die ein anderes Atom desselben Elements zur Anregung benötigt.) Die Quantifizierung kann über zwei verschiedene Verfahren erfolgen:

Standard-Zumisch-Verfahren

a) In mehrere Kolben werden gleiche Volumina der Probelösung gefüllt.
b) Bis auf einen wird in alle Messkolben eine unterschiedliche Mengen von Referenzlösung zugegeben, sodass eine Lösungsreihe mit steigender Menge entsteht.
c) Alle Kolben werden mit Aqua bidest. auf ein definiertes Volumen aufgefüllt.
d) Analyse: Jede Lösung wird dreimal gemessen, und die jeweiligen Mittelwerte werden ins Koordinatensystem übernommen (y: Messwerte; x: Konzentration). Die erhaltene Gerade wird extrapoliert, bis sie die x-Achse schneidet. Der Abstand von Ursprung zum Schnittpunkt ergibt die unbekannte Konzentration.

Kalibrierkurven-Verfahren

a) Es werden Standard-Lösungen unterschiedlicher Konzentration hergestellt.
b) Nullpunkteinstellung der Extinktion durch Vernebelung von Aqua bidest.
c) Maximaler Ausschlag durch Vernebelung der konzentriertesten Lösung
d) Für jede Standard-Lösung werden drei Messungen durchgeführt; die Mittelwerte werden in Koordinatensystem gegen die Konzentration aufgetragen.
e) In gleicher Weise wird die Probe dreimal vermessen und ihre Konzentration von der Geraden abgelesen.
f) Die Richtigkeit wird durch Untersuchung mit Referenzlösung überprüft, deren Konzentration dem bei der Probe ermittelten Wert entspricht.

Die Gerade der Standard-Zumisch-Methode ist gegenüber der des Kalibrierkurven-Verfahrens um den Ordinatenabschnitt A parallelverschoben. Dieser Ordinatenwert entspricht dem Messwert der unbekannten Konzentration. Er würde aufgrund der Geraden 1 der Konzentration C entsprechen, die ja betragsgleich mit - C ist.

Aufbau der AAS-Apparatur

a) Hohlkathodenlampe (HKL)

Die Anode besteht aus Wolfram oder Nickel, das Kathodenmaterial ist identisch mit dem Probenelement. Beide, Anode und Kathode, befinden sich in einer druckreduzierten, mit Edelgas gefüllten Glasröhre. Anlegen der Spannung (ca. 400 V) bewirkt Ionisation des Füllgases. Es kommt zum Stromfluss (Glimmentladung): Die sich zur Kathode bewegenden Kationen schlagen Atome aus der Kathodenoberfläche (entsprechend Probenelement) heraus. Diese Atome werden angeregt und emittieren beim Rückfall in den Grundzustand die Resonanzwellenlänge der Probe. Das emittierte Licht wird durch ein Quarzfenster in den Atomisierer gestrahlt.

b) Atomisierer (Brenner)

Funktion des Atomisierers ist die Erzeugung von Atomen in der Gasphase durch thermische Atomisierung: In der Flamme verdampft das Lösungsmittel Wasser und es bleiben feste, atomare Teilchen zurück (Nebenreaktionen: Bildung von Oxiden, Molekülen, Ionen, Radikalen, angeregten Atomen). Die Luft-Acetylen-Flamme des Brenners liefert Temperaturen bis 2500°C. Neben dem Brenner für thermische Atomisierung gibt es auch alternativ Graphitrohr-Küvetten für flammenlose AAS: In einem elektrisch beheizbaren Graphitrohr wird die Probe durch Erhitzen auf 2000-3000°C verdampft und atomisiert.

c) Monochromator, Photodetektor, Anzeigegerät

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