1 Einleitung
Als 1928 C. V. Raman zusammen mit K. S. Krishnan den nach ihm benannten Effekt des inelastischen Photonenstreuprozesses an Molekülen und Atomverbänden in Flüssigkeiten entdeckte [1], legte er damit den Grundstein für eine bis heute anhaltende Spektroskopietechnik. Kurz nach ihrer Entdeckung gelang es zwei russischen Wissenschaftlern, G. Landberg und L. Mandelstam, den Raman-Effekt auch an Kristallen zu zeigen [2]. Bereits 1923 hatte A. Smekal [3] das Phänomen des Raman-Effekts vorhergesagt. Seither wurden auf dem Gebiet der Ramanspektroskopie wesentliche Fortschritte technischer Art erzielt und mit Hilfe dieser Spektroskopie Erkenntnisse im Aufbau und in der Struktur der Materie gewonnen.
Die Entwicklung und der anschließende Siegeszug des Lasers Anfang der sechziger Jahre des 20. Jahrhunderts eröffneten der Ramanspektroskopie eine Vielzahl neuer Möglichkeiten und Einsatzgebiete.
1969 wurde von S. K. Freeman et al. [4] sowie von M. Deporcq et al. [5] die Einsatzmöglichkeit der Ramanspektroskopie an mikroskopisch kleinen Proben gezeigt mit der Absicht, Strukturen und Zusammensetzung sehr kleiner Probenvolumina zu erhalten. Die Erkenntnisse dieser Arbeiten nutzte M. Delhaye et al. [6], um nicht nur mikroskopische Proben spektroskopisch zu untersuchen, sondern auch deren Form und Lage in einer makroskopischen Umgebung. Damit wurde 1975 das erste Raman-Mikroskop realisiert. Hierbei nutzte Delhaye das so genannte Imaging-Verfahren, bei dem die gesamte Probe in einem beleuchtet und das Ramanlicht über Filter aufgenommen wurde.
In den Achtzigern entwickelte dann D. J. Gardiner et al. [7] ein Raman-Mikroskop, das einzelne Punkte einer Probe abrastert und dadurch wesentlich detailliertere Informationen über die Beschaffenheit liefert.
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[1] C. V. Raman and K. S. Krishnan, Nature, 121, 501, 1928
[2] G. Landsberg and L. Mandelstam, Naturwiss., 16, 557, 772, 1928
[3] A. Smekal, Naturwiss., 11, 873, 1923
[4] S, K, Freeman and D. O. Landon, Anal. Chem., 41, 398 1969
[5] M. Deporcq and R. Demol, Revue du G. A. M. S., 3, 324, 1969
[6] M. Delhaye and P. Dhamelincourt, J. Raman Spectrosc., 3, 33 1975
[7] D. J. Gardiner, M. Bowden and P. R. Graves, Phil. Trans. R. Soc. London, Series A,320, 295, 1986
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
2 Der Raman-Effekt
2.1 Klassische Betrachtung des Raman-Effekts
2.1.1 Polarisierbarkeit
2.1.2 Ramanstreuung
2.2 Quantenmechanische Betrachtung
2.2.1 Allgemeines
2.2.2 Der Resonanz-Raman-Effekt
3 Ausbreitung von Lichtwellen
3.1 Wellenoptik und Gaußsche Strahlen
3.1.1 Paraxiale Näherung
3.1.2 Gaußsche Strahlen
4 Experimenteller Aufbau
4.1 Der Strahlengang
4.2 Der Laser
4.3 Das Raumfilter
4.4 Das Mikroskop
4.5 Die Probenträger
4.6 Das Monochromatoren-System
4.6.1 Der Vormonochromator
4.6.2 Der Hauptmonochromator
4.7 Antrieb der Monochromatoren und des xy-Tisches
4.8 Die CCD-Kamera
5 Experimentelle Ergebnisse und Diskussion
5.1 Charakterisierung des Systems
5.1.1 Der Laser
5.1.2 Das Monochromatoren-System
5.1.3 Die Probenträger
5.1.4 Das Auflösungsvermögen des Raman-Mikroskops
5.1.5 Langzeitschädigung durch Laserbestrahlung
5.2 Ortsaufgelöste Ramanbilder
6 Zusammenfassung und Ausblick
7 Anhang: Auswerteroutinen
7.1 Peak-Integration
7.1.1 Trennen zweier Substanzen
7.2 Fit-Algorithmus
8 Literaturverzeichnis
Zielsetzung & Themen
Ziel dieser Arbeit ist der Aufbau und die Inbetriebnahme eines Raman-Mikroskops, das eine leistungsfähige laterale Auflösung sowie bildgebende Verfahren zur Untersuchung biologischer Systeme ermöglicht. Dabei soll die Brücke zwischen der ortsaufgelösten Ramanspektroskopie und deren Anwendung auf biologische Moleküle (wie Proteine) geschlagen werden, wobei insbesondere auch neue Ansätze zur Auswertung lateraler Spektren entwickelt werden.
- Entwicklung und Aufbau eines vielseitigen Raman-Mikroskops
- Implementierung eines bildgebenden Verfahrens zur lateral aufgelösten Probenanalyse
- Charakterisierung der technischen Systemkomponenten (Laser, Monochromatoren, Detektion)
- Untersuchung der Leistungsfähigkeit an biologischen Systemen (Cytochrom c, Benzoesäure)
- Entwicklung von Algorithmen zur automatisierten Auswertung (Peak-Integration, Fit-Methoden)
Auszug aus dem Buch
5.1.4 Das Auflösungsvermögen des Raman-Mikroskops
Das laterale Auflösungsvermögen des Mikroskops wird von drei Faktoren begrenzt bzw. festgelegt. Ein Faktor ist die Schrittweite des xy-Tisches. Diese wurde bereits im vorangegangenen Kapitel dargestellt. Sie ergab sich aus der Kombination der Mikrometerschrauben und der ⅛-Schritt-Steuerung der Schrittmotoren zu etwa 156 nm.
Der zweite die Auflösung begrenzende Punkt ist die Optik. Diese muss im vorliegenden Fall in zwei getrennten Bereichen betrachtet werden: die einkoppelnde Seite mit der Fokussierung des Lasers und die Auskoppelseite mit dem Schwarzschild-Objektiv als Sammeloptik. Zur Letztgenannten kann man das Auflösungsvermögen nach dem Rayleigh-Kriterium mit der Airy’schen Formel (vgl. einschlägige Literatur wie z.B. [21], [34], oder [35]) bestimmen (vgl. Abbildung 5-7). Mit dieser Formel r_Airy = 1.22λ / 2NA (5.1) und der Numerischen Apertur des Schwarzschild-Objektivs von 0.65 ergibt sich dessen Auflösungsvermögen zu 0.48 µm und ist damit in jedem Fall das schwächere Glied in der Kette gegenüber der Mechanik des Verschiebetisches.
Bei der einkoppelnden Seite stellt sich die Sachlage etwas komplizierter dar. Der Laserstrahl kann nach Kapitel 3 nicht auf einen unendlich kleinen Spotdurchmesser fokussiert werden. Es müssen vielmehr die in Kapitel 3 diskutierten Parameter der Ausbreitung von Gaußschen Strahlen betrachtet werden. Mit der in diesem Kapitel abgeleiteten Näherungsformel für den kleinsten Laserspot, der durch Fokussieren zu erreichen ist, ergibt sich bei dem verwendeten Leitz-Objektiv mit einer numerischen Apertur von 0.2 und voller Ausleuchtung der Linse ein möglicher Durchmesser für diesen Laserspot von 2.5 µm. Mit dem kleinen Schwarzschild-Objektiv (Objektiv 1 in Tabelle 4-2 auf S. 30) und seiner numerischen Apertur von 0.5 ist es theoretisch sogar möglich, einen Spotdurchmesser von 1.0 µm zu erreichen. Ein Kriterium für die laterale Auflösung stellt der Fleckdurchmesser dar. Zwei Punkte werden lateral aufgelöst, wenn sie sich gerade noch berühren, also einen Abstand von einem Fleckdurchmesser haben. Mit diesem Kriterium ist das Auflösungsvermögen direkt durch den Durchmesser des Laserspots gegeben.
Zusammenfassung der Kapitel
1 Einleitung: Die Arbeit gibt einen Überblick über die historische Entwicklung der Ramanspektroskopie und formuliert das Ziel, ein leistungsfähiges Raman-Mikroskop für biologische Anwendungen zu entwickeln.
2 Der Raman-Effekt: Dieses Kapitel erläutert die theoretischen Grundlagen des Raman-Effekts, sowohl klassisch als auch quantenmechanisch, und diskutiert den Resonanz-Raman-Effekt.
3 Ausbreitung von Lichtwellen: Hier werden die physikalischen Bedingungen der Lichtausbreitung, insbesondere die Gaußsche Strahloptik und die paraxiale Näherung, für das Raman-Mikroskop detailliert beschrieben.
4 Experimenteller Aufbau: Dieser Abschnitt beschreibt die verwendeten Hardware-Komponenten des Gesamtsystems, inklusive Strahlengang, Laser, Mikroskop, Monochromatoren und CCD-Kamera.
5 Experimentelle Ergebnisse und Diskussion: Hier findet eine umfassende Charakterisierung der Komponenten sowie die Validierung der Auflösung an Testproben und biologischen Systemen (Cytochrom c) statt.
6 Zusammenfassung und Ausblick: Das Fazit fasst die erfolgreiche Inbetriebnahme des Mikroskops zusammen und gibt einen Ausblick auf künftige Forschungsmöglichkeiten wie die Auflicht-Mikroskopie.
7 Anhang: Auswerteroutinen: Der Anhang dokumentiert die mathematischen Routinen zur Datenverarbeitung, insbesondere zur Peak-Integration und zur Anwendung des Fit-Algorithmus.
8 Literaturverzeichnis: Hier sind sämtliche wissenschaftlichen Quellen und Referenzen gelistet, die für die physikalischen und experimentellen Analysen in dieser Diplomarbeit herangezogen wurden.
Schlüsselwörter
Ramanspektroskopie, Raman-Mikroskop, Laser, Ortsauflösung, Schwarzschild-Objektiv, Cytochrom c, Resonanz-Raman-Effekt, Bildgebung, Gaußsche Strahlen, CCD-Kamera, Monochromator, Spektroskopie, Biologische Systeme, Automatisierung, Fit-Algorithmus.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?
Die Diplomarbeit beschreibt den Eigenbau eines Raman-Mikroskops, das darauf ausgelegt ist, räumlich aufgelöste spektrale Informationen von biologischen Proben zu gewinnen.
Welche zentralen Themenfelder werden bearbeitet?
Die Arbeit deckt die theoretischen Grundlagen der Ramanstreuung und Lichtausbreitung ab sowie den praktischen Aufbau der optischen Apparatur und die anschließende digitale Datenverarbeitung.
Was ist das primäre Ziel der Arbeit?
Ziel war es, ein vielseitiges Mikroskop-System zu entwickeln, das eine hohe laterale Auflösung bietet und die Analyse von Assays (z.B. Proteinen) durch automatisierte Datenauswertung ermöglicht.
Welche wissenschaftliche Methode wird verwendet?
Es werden rasterbasierte Ramanspektroskopie-Messungen durchgeführt, wobei das Auflösungsvermögen mittels Kalibrierstandards und die spektrale Analyse durch mathematische Algorithmen (Fit-Methoden) optimiert werden.
Was wird im Hauptteil behandelt?
Der Hauptteil konzentriert sich auf die technische Charakterisierung der Komponenten (Laser, Monochromatoren-System) und die Validierung der Systemleistung durch experimentelle Linienscans und die Abbildung von Testsubstanzen wie Cytochrom c.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Die Arbeit ist geprägt durch Begriffe wie Ramanspektroskopie, Ortsauflösung, Schwarzschild-Optik, Proben-Abrasterung und mathematische Datenanalyse mittels Fit-Algorithmen.
Warum wurde Cytochrom c als Testsubstanz gewählt?
Cytochrom c dient aufgrund seiner spezifischen Absorption bei 520 nm als ideale Substanz, um den Resonanz-Raman-Effekt bei Anregung mit 514,5 nm auszunutzen und so eine starke Raman-Signatur zu erhalten.
Warum ist das Monochromatoren-System in dieser Arbeit so besonders?
Das System wurde am Lehrstuhl selbst entwickelt, um bei hoher Auflösung und Lichtdurchsatz kosteneffizienter als kommerzielle Standardgeräte zu arbeiten und insbesondere bei der Verwendung breiter Eintrittsspalte noch präzise Ergebnisse zu liefern.
- Citation du texte
- J. Micha Kölbach (Auteur), 2002, Ortsaufgelöste Ramanstreuung, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/7531
