Der erfolgreiche therapeutische Einsatz von CpG ODN hängt entscheidend davon ab, wie gut mit diesen eine virale Infektion imitiert und das Immunsystem gezielt in einen Alarmzustand versetzt werden kann. Während das jeweilige immunologische Aktivierungsprofil der drei CpG-Klassen A, B und C bereits weitgehend bekannt ist, sind die sequenzspezifischen und strukturellen Voraussetzungen für diese unterschiedlichen Wirkungen unzureichend verstanden. Eine experimentelle Einschränkung stellt die begrenzte Übertragbarkeit der Struktur-Analysen auf die tatsächlichen Vorgänge im physiologischen Milieu dar. Ohne Kenntnisse der für die differenziellen Wirkprofile maßgeblichen Faktoren kann darauf kein Einfluss genommen werden, um das Spektrum an Einsatzmöglichkeiten für CpG-ODN zu erweitern und zu optimieren. Die therapeutische Anwendung von CpG ODN wird außerdem bislang durch deren geringe Halbwertszeit in vivo eingeschränkt. Eine galenische Hilfe, die systemische Stabilität zu erhöhen, stellt die Bindung der ODN an partikuläre Trägersysteme dar – eine Methode, deren Effektivität in unserer Abteilung bereits gezeigt werden konnte. Eine Weiterentwicklung dieses Prinzips wären partikuläre Strukturen, die aus immunstimulatorischen Nukleinsäuren aufgebaut sind und keiner weiteren Trägermaterialien bedürfen.
Ziele der vorliegenden Arbeit sind:
1)Die systematische Aufklärung der sequenzspezifischen und strukturbestimmenden Eigenschaften der bereits bekannten CpG Klassen A und C, um die maßgeblichen Struktur-Wirkungsbeziehungen darzulegen. Dabei soll die Entwicklung geeigneter Methoden zur strukturellen Analyse im physiologischen Milieu im Vordergrund stehen.
2)Die Entwicklung Nukleinsäure-basierter, immunstimulatorischer Partikel unter Einsatz der in Teil 1 ermittelten wirksamen Strukturelemente beider CpG Klassen.
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG
1.1 Das humane Immunsystem
1.1.1 Die angeborene und die adaptive Immunität
1.1.2 Toll-like Rezeptoren - Erkennungssysteme der angeborenen Immunität
1.1.3 Typ-I Interferon - ein Effektor der angeborenen Immunität
1.1.4 Dendritische Zellen - Mittler zwischen der angeborenen und der adaptiven Immunität
1.1.5 B-Zellen - Effektorzellen der adaptiven Immunität
1.2 CpG-Oligodesoxynukleotide
1.2.1 Geschichtlicher Hintergrund: Von bakteriellen Lysaten zu synthetischer CpG-DNA
1.2.2 Wirkung und Wirkmechanismen von CpG-DNA
1.2.3 Definition von drei Klassen synthetischer CpG-ODN: CpG-A, CpG-B und CpG-C
1.2.4 Therapeutischer Einsatz von CpG-Oligodesoxynukleotiden
1.3 Ziele dieser Arbeit
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1 Geräte, Chemikalien und Reagenzien
2.1.1 Geräte
2.1.2 Verbrauchsmaterialien
2.1.3 Chemikalien
2.1.4 Reagenziensätze
2.1.5 Materialien für die Zellkultur
2.1.6 Zytokine
2.1.7 Zellkulturmedien, Puffer und Lösungen
2.1.7.1 Medien und Puffer für die Zellkultur
2.1.7.2 Puffer und Lösungen für die Gelelektrophorese
2.1.8 Antikörper für die Durchflusszytometrische Analyse
2.2 Oligodesoxynukleotide
2.2.1 Zur Zellstimulation eingesetzte Sequenzen
2.2.2 Zur Gelelektrophorese eingesetzte Sequenzen
2.2.3 Temperatur-Präinkubation von ODN 2216
2.2.4 Temperatur-Präinkubation von ODN M362
2.3 Polyvalente Linker
2.3.1 Polyvalente Linker - CpG-DNA
2.3.2 Trivalente Linker - palindromische RNA
2.3.3 Poly-L-Arginine als Transfektionsreagenzien
2.3.3.1 Herstellung des ‚Master-Mixes‘ zur Transfektion
2.4 Zellulär – immunologische Methoden
2.4.1 Isolation der gewünschten Zellpopulation
2.4.1.1 Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes
2.4.1.2 Plasmazytoide dendritische Zellen
2.4.1.3 Gesamt B-Zellen (CD19+)
2.4.2 Herstellung autologen Serums
2.4.3 Zellkultur
2.4.4 Durchflusszytometrie (FACS-Analyse)
2.4.4.1 Grundprinzip der FACS-Analyse
2.4.4.2 Durchflusszytometrische Bestimmung der Reinheit von plasmazytoiden dendritischen Zellen und B-Zellen
2.4.5 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
2.4.5.1 Zytokine
2.4.5.2 Proliferation (BrdU-ELISA)
2.5 Molekularbiologische Methoden
2.5.1 Gelelektrophorese
2.5.1.1 Prinzip der Gelelektrophorese
2.5.1.2 Prinzip der Detektion von Digoxigenin-markierten Oligodesoxynukleotiden
2.5.1.3 Prinzip der Detektion von DNA durch Ethidiumbromidfärbung
2.5.1.4 Durchführung der Gelelektrophorese
2.5.1.5 Blotting und Detektion Digoxigenin-markierter Oligodesoxynukleotide
2.5.1.6 Färbung mit Ethidiumbromid
2.5.1.7 Auswertung der Gelbilder
2.5.2 Partikelgrößenbestimmung durch Zetapotenzialmessung
2.5.2.1 Grundprinzip
2.5.2.2 Durchführung der Messung
2.6 Statistische Analyse
2.7 Software
3 ERGEBNISSE
3.1 Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehungen von CpG-A und CpG-C
3.1.1 Untersuchung des Klasse A Oligodesoxynukleotids 2216
3.1.1.1 CpG-A bildet Nanopartikel im Größenbereich von Viren
3.1.1.2 Entwicklung der Temperatur-Präinkubationsmethode zur experimentellen Kontrolle der Multimerisierungen
3.1.1.3 Strukturelle Analyse: CpG-A multimerisiert im physiologischen Milieu
3.1.1.4 Identifizierung des zentralen Palindroms als notwendiges Element zum Aufbau größerer Partikel aus G-Tetraden
3.1.1.5 Identifizierung der Natriumionen als wichtiges stabilisierendes Element zum Aufbau der G-Tetraden
3.1.1.6 Große Partikel sind die Voraussetzung zur raschen Induktion hoher Mengen von Interferon-alpha in plasmazytoiden dendritischen Zellen
3.1.1.7 Die Präinkubation von PDCs mit Interferon-beta verstärkt die Induktion von Interferon-alpha durch Einzelstränge
3.1.1.8 B-Zellen werden von kleinen Partikeln und Einzelsträngen des ODN 2216 nicht aktiviert
3.1.1.9 Strukturelle Analyse: Die Multimere öffnen ihre Bindungen bei pH < 6
3.1.2 Untersuchung des Klasse C Oligodesoxynukleotids M362
3.1.2.1 Strukturelle Analyse bei 4 °C: Die Stabilität der Duplices hängt von den anwesenden Natrium- oder Magnesiumionen ab
3.1.2.2 Strukturelle Analyse bei 37°C: Weder Duplices noch Hairpins sind im physiologischen Milieu stabil
3.1.2.3 Übertragung der Ergebnisse der strukturellen Analyse auf den Zellversuch
3.2 Design immunstimulatorischer Partikel unter Einsatz wirksamer Strukturelemente von CpG-A und CpG-C
3.2.1 Polyvalente Linker - palindromische CpG-DNA
3.2.1.1 Strukturelle Analyse
3.2.1.2 Starke Induktion von Interferon-alpha in PBMCs nach Transfektion mit Poly-L-Arginin
3.2.1.3 Screening verschieden langer Poly-L-Arginine als Transfektionsreagenzien
3.2.1.4 Poly-L-Arginin verbessert die endozytotische Aufnahme der Polyvalenten Linker
3.2.1.5 Untersuchung der CpG-Abhängigkeit des immunstimulatorischen Effektes
3.2.1.6 Wirkung der transfizierten Polyvalenten Linker auf plasmazytoide dendritische Zellen und B-Zellen
3.2.2 Trivalente Linker - palindromische RNA
3.2.2.1 Strukturelle Analyse: PVL-RNA multimerisieren zu definiert aufgebauten, großen Strukturen
3.2.2.2 Induktion von Interferon-alpha in PBMCs nach Transfektion mit Poly-L-Arginin
4 DISKUSSION
4.1 Methodendiskussion
4.1.1 Möglichkeiten und Grenzen der Gelelektrophorese zur Simulation physiologischen Milieus
4.1.2 Wahrscheinlichkeit von strukturellen Veränderungen der PVL-Partikel durch die Inkubation mit Poly-L-Arginin
4.2 Struktur-Wirkungsbeziehungen von ODN 2216 (CpG-A)
4.2.1 Zusammenspiel aus Poly-Guanin-Sequenzen, Palindrom und monovalenten Kationen (Na+/K+) zur Strukturbildung im physiologischen Milieu
4.2.1.1 Bildung von G-Tetraden aus Poly-Guanin-Motiven
4.2.1.2 Multimerisierungen von G-Tetraden-Grundstrukturen zu größeren Partikeln mit Hilfe des zentralen Palindroms
4.2.1.3 Stabilisierung der G-Tetraden durch zentral eingelagerte monovalente Kationen (Na+/K+)
4.2.2 Definierter Partikelaufbau trotz konzentrationsabhängiger Umlagerungen
4.2.3 Die Multimerisierung zu höhermolekularen Strukturen ist die Voraussetzung für die hohe Induktion von Interferon-alpha in plasmazytoiden dendritischen Zellen
4.2.4 Erklärungsmodelle für die hohe Induktion von Interferon-alpha durch große 2216-Partikel
4.2.4.1 Aktivierung eines autokrinen feedback-loops für Interferon-alpha durch CpG-A
4.2.4.2 Clustering und Crosslinking von TLR 9
4.2.5 TLR 9-Bindung einzelsträngiger ODN 2216 während der endosomalen Azidifizierung
4.2.6 Interpretation der geringen B-Zell-Aktivierung durch CpG-A
4.3 Das Palindrom als zentrales Element in den Struktur-Wirkungsbeziehungen von ODN M362 (CpG-C)
4.3.1 Eigenschaften Palindrom-basierter Strukturen von ODN M362
4.3.2 Differenzielles Verhalten Palindrom-basierter Duplices im physiologischen Milieu: Aktivität trotz Strukturlabilität
4.3.3 Palindrom-basierte (Einzelstrang-) Effekte?
4.4 Design immunstimulatorischer Partikel unter Einsatz wirksamer Strukturelemente von CpG-A und CpG-C
4.4.1 Interpretation der strukturellen Analyse
4.4.2 Modelle der durch die palindromischen Nukleinsäuren ermöglichten Multimerisierungen trivalenter Linker
4.4.3 Differenzielles Aufnahmevermögen für große Partikel bei plasmazytoiden dendritischen Zellen und B-Zellen
4.4.4 Verbesserte Aufnahme oder wirkungssteigernde Umlagerungen durch Poly-L-Arginin?
4.4.5 Palindromische RNA als partikelaufbauendes Element
4.5 Ausblick
4.5.1 G-Tetraden-basierter Strukturaufbau immunstimulatorischer Partikel
4.5.2 Palindrom-basierter Strukturaufbau immunstimulatorischer Partikel
5 ZUSAMMENFASSUNG
Zielsetzung & Themen
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Aufklärung der sequenzspezifischen und strukturellen Voraussetzungen, die für die unterschiedlichen Wirkprofile der CpG-Oligodesoxynukleotid-Klassen A und C maßgeblich sind. Ein zentrales Ziel ist es, die Zusammenhänge zwischen der Multimerisierung dieser Moleküle im physiologischen Milieu und ihrer Fähigkeit zur Induktion von Interferon-alpha in plasmazytoiden dendritischen Zellen (PDCs) zu verstehen sowie neue Nukleinsäure-basierte Trägersysteme zu entwickeln, um deren therapeutisches Potenzial zu optimieren.
- Strukturelle Analyse und Charakterisierung der CpG-Klassen A (ODN 2216) und C (ODN M362).
- Identifizierung der Rolle von Palindromen, G-Tetraden und Ionenkonzentrationen bei der Strukturbildung.
- Entwicklung neuartiger partikulärer Trägersysteme unter Verwendung von Polyvalenten Linkern.
- Untersuchung der zellulären Aufnahme und immunstimulatorischen Wirksamkeit mittels Transfektionsmethoden (Poly-L-Arginin).
- Kinetik und Signalwege der Zytokininduktion (IFN-alpha, TNF-alpha) in PDCs und B-Zellen.
Auszug aus dem Buch
3.1.1.1 CpG-A bildet Nanopartikel im Größenbereich von Viren
Zunächst wurde mittels der Transmissions-Elektronen-Mikroskopie (TEM) versucht, die Partikel des ODN 2216 abzubilden. Im Gegensatz zum herkömmlichen Lichtmikroskop werden hochenergetische Elektronen benutzt, um ein Objekt bildhaft darzustellen. Die Präparation der zu untersuchenden Proben, welche sehr dünn (0,1-0,3 µm) sein müssen, ist hierbei sehr aufwändig. Da die Wechselwirkungen zwischen Elektronen und DNA im TEM zu gering sind, muss der Kontrast durch Negativfärbung (sog. negative stain) mit Uranylacetatlösung verbessert werden. Dies könnte jedoch die Strukturbildung beeinflussen und die Ergebnisse verfälschen. Außerdem sind die Aufnahmen nur in einem Vakuum möglich, welches ebenfalls Auswirkungen auf die Struktur DNA-haltiger Proben haben kann. Möglicherweise aus diesen Gründen konnten keine zufriedenstellend interpretierbaren Aufnahmen erzielt werden. Daher wurde zur Bestimmung der Partikelgrößen die Zetapotenzialmessung angewendet (Abbildung 2). Sie bietet den Vorteil, dass bei Raumtemperatur und mit in PBS gelösten ODN gearbeitet werden kann. Die Messung ergab mittlere Partikeldurchmesser von 24 nm bis 40 nm bei Polydispersitäten zwischen 3,87 und 4,09. Die kleinsten gemessenen Partikel waren 15,8 nm, die größten Strukturen waren 66,6 nm groß. Diese größten Partikel wurden jedoch nicht bei der höchsten gemessenen Konzentration gebildet, sondern bei der mittleren Konzentration von 500 µg/ml (= 77,5 µmol), die der in den Aliquots für die Zellversuche vorhandenen Konzentration entsprach (400 µg/ml).
Zusammenfassung der Kapitel
1 EINLEITUNG: Dieses Kapitel stellt die theoretischen Grundlagen des humanen Immunsystems, der Toll-like-Rezeptoren, der Bedeutung von Typ-I-Interferonen sowie die Eigenschaften und therapeutischen Ansätze von CpG-Oligodesoxynukleotiden dar.
2 MATERIAL UND METHODEN: Hier werden die verwendeten Geräte, Reagenzien, zellbiologischen Isolationsverfahren, molekularbiologischen Analysemethoden wie die Gelelektrophorese sowie statistische Auswertungsverfahren detailliert beschrieben.
3 ERGEBNISSE: Dieser Hauptteil präsentiert die experimentellen Befunde zur strukturellen Analyse und zum Design von immunstimulatorischen Partikeln, wobei die spezifischen Einflüsse von Ionen, Palindromen und Präinkubationstemperaturen auf die Wirksamkeit von CpG-A und CpG-C untersucht werden.
4 DISKUSSION: Die gewonnenen Erkenntnisse werden kritisch hinterfragt, insbesondere im Hinblick auf die methodische Simulation physiologischer Bedingungen, die strukturellen Eigenschaften der gebildeten Partikel und deren biologische Aktivität in verschiedenen Zelltypen.
5 ZUSAMMENFASSUNG: Der abschließende Teil fasst die zentralen wissenschaftlichen Ergebnisse der Arbeit zusammen und gibt einen Ausblick auf die klinische Relevanz und zukünftige Entwicklungen im Bereich der Immuntherapie.
Schlüsselwörter
CpG-Oligodesoxynukleotide, Immunsystem, Interferon-alpha, Toll-like-Rezeptor 9, G-Tetraden, Palindrom, Nanopartikel, Polyvalente Linker, Gelelektrophorese, B-Zellen, Plasmazellen, Immunadjuvans, Zytokininduktion, Strukturbildung, Transfektion
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser wissenschaftlichen Arbeit grundlegend?
Die Arbeit untersucht, wie synthetische CpG-Oligodesoxynukleotide (CpG-ODN) durch strukturelle Organisation (Multimerisierung) die Induktion antiviraler Zytokine, insbesondere Interferon-alpha, in humanen Immunzellen beeinflussen.
Welche zentralen Themenfelder werden behandelt?
Zentrale Themen sind die Struktur-Wirkungsbeziehungen von verschiedenen CpG-Klassen (A und C), die Entwicklung von Methoden zur Analyse dieser Strukturen im physiologischen Milieu sowie die Konstruktion neuer, partikulärer Wirkstoffträger.
Was ist das primäre Ziel der Forschungsarbeit?
Das primäre Ziel besteht darin, die strukturellen Voraussetzungen für die immunstimulatorische Aktivität von CpG-ODN aufzuklären und darauf basierend neue, hochwirksame Nukleinsäure-basierte Nanopartikel für den therapeutischen Einsatz zu entwickeln.
Welche wissenschaftlichen Methoden kommen zum Einsatz?
Zum Einsatz kommen vor allem die native Gelelektrophorese zur strukturellen Untersuchung, die Zetapotenzialmessung zur Größenbestimmung, Zellkulturtechniken mit PDCs und B-Zellen, sowie der ELISA zum Nachweis von Zytokinen.
Was steht im inhaltlichen Fokus des Hauptteils?
Der Hauptteil konzentriert sich auf die Analyse, wie Umweltfaktoren wie Temperatur, Ionen und Palindromsequenzen die Bildung von G-Tetraden und größeren Partikeln bei CpG-A und CpG-C steuern und wie diese die Immunantwort modulieren.
Durch welche Schlüsselbegriffe ist die Arbeit geprägt?
Die Arbeit wird maßgeblich durch Begriffe wie CpG-ODN, G-Tetraden, Interferon-alpha, Toll-like-Rezeptoren, Polyvalente Linker und Immunstimulation charakterisiert.
Warum spielt das Palindrom bei der Wirksamkeit von CpG-C eine so wichtige Rolle?
Das Palindrom im Zentrum von CpG-C ermöglicht dem Molekül eine strukturelle Flexibilität, die zur Bildung von Duplices beitragen kann, welche wiederum die Aktivierung von PDCs unterstützen, auch wenn diese im physiologischen Milieu bei 37°C eher instabil sind.
Welche Rolle spielt Poly-L-Arginin bei den entwickelten Partikeln?
Poly-L-Arginin dient als Transfektionsreagenz, das die zelluläre Aufnahme der Partikel verbessert, die Wirksamkeit der Polyvalenten Linker signifikant steigert und teilweise sogar bei ansonsten schwach wirksamen CpG-Sequenzen eine starke Zytokinantwort induzieren kann.
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- Dr. Christine Richter (Author), 2006, Aufklärung der Struktur-Wirkungsbeziehungen von CpG-A- und CpG-C-Oligodesoxynukleotiden als Grundlage für die Entwicklung immunstimulatorischer Nanopartikel, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/82264
