Molekulare Analyse der Expression des TNF-Rezeptors 2 in der humanen Brustkrebszellinie MCF-7 nach Applikation von Antiestrogenen

Examensarbeit , 2000 , 66 Seiten , Note: 1,0

Biologie - Mikrobiologie, Molekularbiologie

Steroidhormone werden als Reaktion auf eine Vielzahl neuro-endokriner Aktivitäten synthetisiert. Sie üben beim Menschen einen wesentlichen Einfluß auf das Wachstum, die Entwicklung der Gewebe und auf die Homöostase aus (Lewin, 1991). Die Nebennieren sezernieren über 30 Steroide, die alle vom Cholesterin abgeleitet sind (s. Abbildung 1). Sie lassen sich in fünf Hauptklassen einteilen: Gestagene, Glucocorticoide, Mineralocorticoide, Androgene und Estrogene (früher als Östrogene bezeichnet). Progesteron, ein Gestagen, bereitet den Uterus für die Aufnahme des befruchteten Eies vor, es ist außerdem für die Aufrechterhaltung der Schwangerschaft verantwortlich. Androgene, wie Testosteron, bewirken die Ausprägung der sekundären männlichen, Estrogene die der sekundären weiblichen Geschlechtsmerkmale. Estrogene wirken außerdem am Eireifungszyklus und dem Wachstum der Brust mit. Glucocorticoide (wie Cortisol) fördern die Gluconeogenese und die Glucogenbildung, und erhöhen darüber hinaus den Fett- und Proteinabbau. Mineralcorticoide (Aldosteron) sind für die erhöhte Reabsorption von Na+, Cl- und HCO3- in der Niere verantwortlich, was in der Erhöhung des Blutvolumens und des Blutdrucks zum Ausdruck kommt. Diese Hormone werden hauptsächlich in den folgenden Organen synthetisiert: Gestagene im Corpus luteum, Estrogene in den Ovarien, Androgene in den Testes, Glucocorticoide und Mineralocorticoide in der Nebennierenrinde (Stryer, 1983). Der Wirkmechanismus der Steroide basiert auf einer hochspezifischen Bindung an die entsprechenden intrazellulären Rezeptoren. Diese üben einen direkten Einfluß auf die Genexpression und damit auf die Proteinsynthese aus.

Inhaltsverzeichnis

• 1 EINLEITUNG
• 1.1 Steroidhormone
• 1.1.1 Estrogene
• 1.1.1.1 Estrogenabhängige Tumore
• 1.2 Antiestrogene
• 1.2.1 Apoptose
• 1.2.1.1 Signaltransduktion apoptotischer Prozesse
• 1.2.1.1 Tumor-Nekrosis-Faktor α (TNFα)
• 1.2.1.2 TNF-Rezeptoren
• 1.3 Zielsetzung
• 2 MATERIAL UND METHODEN
• 2.1 Zellkultur
• 2.1.1 Zelllinien
• 2.1.2 Kulturbedingungen
• 2.1.3 Passagieren der Zellen
• 2.1.4 Hormonbehandlung
• 2.2 RNA-Präparation
• 2.2.1 RNA-Präparation mittels Trizol®
• 2.2.2 Quantifizierung von Nukleinsäuren
• 2.2.3 DNase-Verdau
• 2.3 Semiquantitative PCR (Diel et al. 1996; Murphy et al., 1990)
• 2.3.1 Ableiten der Primer
• 2.3.2 cDNA Synthese
• 2.3.3 PCR (Mullis et al., 1987)
• 2.3.4 Gelelektrophorese der PCR-Fragmente (Sambrock et al., 1989)
• 2.3.5 Dokumentation der Gele
• 2.4 Proteinisolierung aus MCF-7 Zellen
• 2.4.1 Proteinisolierung
• 2.4.2 Konzentrationsbestimmung
• 2.5 Western-Blot
• 2.5.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Laemmli, 1970)
• 2.5.2 Coomassie-Brilliant-Blue Färbung (Frazekas et al., 1963)
• 2.5.3 Semi-dry Blotting (Towbin et al., 1979)
• 2.5.4 Antikörperinkubation
• 2.5.5 Proteinnachweis durch das Lumi-Light Plus System
• 2.6 Material
• 2.6.1 Laborgeräte
• 2.6.2 Chemikalien
• 2.6.3 PCR Primer
• 2.6.4 Enzyme, Kits und weitere Materialien
• 2.6.5 Antikörper
• 3 ERGEBNISSE
• 3.1 Proteinisolierung aus Faslodex behandelten MCF-7 Zellen
• 3.1.1 Konzentrationsbestimmung der löslichen Proteinfraktionen
• 3.1.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese der Proteinproben
• 3.2 Western-Blot Analyse der Regulation des TNF-Rezeptors 2
• 3.3 Quantitative Analyse der mRNA-Expression mittels RT-PCR
• 3.3.1 Visuelle Qualitätskontrolle der isolierten RNA
• 3.3.2 RNA Präparation aus Faslodex behandelten MCF-7 Zellen
• 3.4 Semiquantitative PCR
• 4 DISKUSSION
• 4.1 MCF-7 Zellen als Modellsystem
• 4.2 Regulation des TNF-Rezeptors 2 nach Faslodex-Applikation
• 4.2.1 Western-Blot-Analyse
• 4.2.2 Semiquantitative PCR
• 4.2.3 Mechanismus der Regulation des TNF-Rezeptors 2
• 4.3 Funktion von TNF-R2 im Rahmen der Apoptoseinduktion
• 35 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK

Zielsetzung und Themenschwerpunkte

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der molekularen Analyse der Expression des TNF-Rezeptors 2 in der humanen Brustkrebszellinie MCF-7 nach Applikation von Antiestrogenen. Ziel ist es, die Regulation der TNF-Rezeptor 2 Expression durch Antiestrogene zu untersuchen und die mögliche Rolle des Rezeptors in der Apoptoseinduktion in Brustkrebszellen zu beleuchten.

• Estrogenabhängige Tumore und die Rolle von Antiestrogenen in der Therapie
• Apoptose als zellulärer Mechanismus des programmierten Zelltods
• Der TNF-Rezeptor 2 und seine Signaltransduktion in der Apoptose
• Die Modulation der TNF-Rezeptor 2 Expression durch Antiestrogene
• Die Bedeutung des TNF-Rezeptors 2 für die Apoptoseinduktion in Brustkrebszellen

Zusammenfassung der Kapitel

Die Arbeit gliedert sich in fünf Kapitel. Kapitel 1 führt in die Thematik ein und stellt die relevanten biologischen Hintergründe vor, darunter Steroidhormone, insbesondere Estrogene und Antiestrogene, sowie den Mechanismus der Apoptose. Kapitel 2 beschreibt die verwendeten Materialien und Methoden, darunter Zellkultur, RNA-Präparation, semiquantitative PCR und Western-Blot. Die gewonnenen Ergebnisse werden in Kapitel 3 präsentiert und interpretiert. Kapitel 4 widmet sich der Diskussion der Ergebnisse im Kontext des aktuellen Forschungsstandes und stellt mögliche Mechanismen der Regulation des TNF-Rezeptors 2 durch Antiestrogene vor.

Schlüsselwörter

TNF-Rezeptor 2, Antiestrogene, Brustkrebs, Apoptose, Zellkultur, RT-PCR, Western-Blot, MCF-7 Zellen, Signaltransduktion, Faslodex.

• Hochschule: Deutsche Sporthochschule Köln (Institut für Experimentelle Morphologie und Tumorforschung)
• Note: 1,0
• Autor: Marco Lennartz (Autor:in)
• Erscheinungsjahr: 2000
• Seiten: 66
• Katalognummer: V8517
• ISBN (eBook): 9783638154697
• Sprache: Deutsch
• Schlagworte: TNF-R2, Antiestrogene, Apoptose