Proteinstruktur und Elektrostatik von beta-Lactoglobulin unter Hochdruck


Diplomarbeit, 2007
93 Seiten, Note: 1,0

Leseprobe

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung

2. b-Lactoglobulin
2.1. Thermisch induzierte Veränderungen des b-Lactoglobulin
2.2. Druckinduzierte Veränderungen des b-Lactoglobulin
2.3. Modifikationen durch den pH-Wert
2.4. Experimentelle Untersuchungen

3. Angewandte Methode: Molekularmechanik
3.1. Ensembles und Ergodizität
3.2. Nichtbindende Kräfte
3.3. Kovalente Verknüpfungen
3.4. Berechnungsalgorithmen
3.5. MD-Simulationen
3.6. CHARMM
3.7. Vorbereitung und Starten der Simulation

4. Angewandte Methode: Elektrostatik
4.1. Die Poisson-Boltzmann-Gleichung
4.2. Lösen der Poisson-Boltzmann-Gleichung mit dem Programmpaket Delphi
4.3. Wahl der Dielektrizitätkonstanten
4.4. Vorbereitung und Starten der Elektrostatikberechnungen
4.5. Solvatisierungsenergie
4.6. Berechnung von Bindungsenergien
4.7. pKs-Wert Berechnungen
4.8. Numerische Stabilität der Lösungen

5. Ergebnisse
5.1. Volumen- und Oberflächenänderungen des Proteins
5.2. Eindringen von Wassermolekülen in das Protein und Exponierung des Cystein121
5.3. Radiale Wasserverteilung – Hydrathülle des Proteins
5.4. Gyrationsradius
5.5. Konformationsänderungen
5.6. Kompressibilität einzelner Strukturelemente
5.7. Anteil der Elektrostatik an der Bindungsenergie der Monomere
5.8. pKs-Wert des Glu89

6. Zusammenfassung

7. Liste der Abbildungen und Tabellen

8. Anhang

9. Literaturverzeichnis

1. Einleitung

Hochdruck ist eine viel versprechende Möglichkeit Lebensmittel haltbar zu machen. Die derzeit übliche thermische Behandlung ist im Gegensatz zum Hochdruck mit einigen Nachteilen verbunden. Dazu zählen die Energiekosten, die oft unerwünschten chemischen und physikalischen Veränderung von Inhaltsstoffen sowie die Belastung des Biomaterials durch die Aufheizphase auf die gewünschte Temperatur. Druck hingegen herrscht sofort im gesamten Lebensmittel und ist insgesamt schonender, da er z.B. keine kovalenten Bindungen zu spalten vermag. Um nun Aussagen auf molekularer Basis der Inhaltsstoffe, z.B. Proteine, treffen zu können verwendet man Molekülsimulationen.

Numerische Simulation von Biomolekülen in verschiedenen Lösungsmitteln bilden seit vielen Jahren einen Forschungsschwerpunkt. Das liegt zum einen an der Entwicklung neuer Berechnungsalgorithmen und Modelle, zum anderen an der rapiden Zunahme an Rechenkapazität.

Eine der ersten molekulardynamischen Simulationen unter Hochdruck führten Kitchen et al. [i] im Jahr 1992 durch. Sie untersuchten BPTI (bovine pancreatic trypsin inhibitor) in Lösung bei einem Druck von 1000 MPa. Es gilt dabei zu bedenken, dass die damaligen Rechner nicht annähernd die Rechenleistung besaßen wie die heutigen, und damit die Simulationszeiten im Bereich von 100 ps lagen. Sie beobachteten, dass keine druckinduzierte Denaturierung in dieser kurzen Zeitspanne zu erkennen war. Heutige Rechnernetzwerke bringen ein Vielfaches der Leistung damaliger Rechner, sodass Beobachtungszeitspannen von 10-100 ns möglich werden. Dabei liegen vielfältige Möglichkeiten der Beobachtung von Mittelwerten und Fluktuationen struktureller und energetischer Größen vor: Es können die Abstände einzelner Atome, deren Geschwindigkeiten, die mittlere Temperatur und der mittlere Druck, die potentielle Energien, uvm. berechnet werden.

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss einer Hochdruckbehandlung auf hydratisiertes b-Lactoglobulin Dimer mit Hilfe von Molekularmechanik (empirisches Kraftfeld, CHARMM22) und Kontinuumselektrostatik (Potentialberechnung durch numerische Lösung der Poisson-Boltzmann-Gleichung, DelPhi v.4) untersucht. Dabei interessierten primär die Konformationsänderungen des Proteins, z.B. die Exponierung des freien, im Inneren des Proteins verborgenen, Cystein121, das Eindringen von Wassermolekülen in den hydrophoben Kern des Moleküls, der Volumenänderung von Protein und Hydrathülle sowie Einflüsse dieser Änderungen auf die Bindungsenergie der Monomere und den pKs-Werte des Glu89.

2. b-Lactoglobulin

b-Lactoglobulin (BLG) und a-Lactalbumin sind jedermann als „Milchhaut“ nach dem Kochen von Milch bekannt. BLG ist ein globuläres Protein der Lipocalin-Familie mit 162 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von ca. 18 kDa. Es kommt als Molkenprotein in der Kuhmilch, vornehmlich in den zwei genetischen Varianten A und B [ii], vor. Dabei erweist sich die Isoform A in einigen Experimenten (jedoch nicht in Infrarotspektroskopie und Kleinwinkelröntgenstreuung [iii]) als drucksensitiver [iv]. Diese beiden Varianten unterscheiden sich nur in zwei Aminosäuren an den Stellen 64 und 118. An der Stelle 64 trägt die Variante A eine Asparaginsäure und B einen Glycinrest, während an der Stelle 118 Variante A Valin und B Alanin enthält. Zu bemerken gilt dabei, dass Asparaginsäure eine große polare Aminosäure, Glycin hingegen die kleinste und unpolare Aminosäure ist. Somit werden manche Eigenschaften des Moleküls allein durch diese Modifikation entschieden verändert, doch im Großen und Ganzen ähneln sich die Varianten in ihren physikochemischen Eigenschaften sehr stark [v]. Des Weiteren existieren noch die Variante C (Jersey Kühe), D (Montbeliarde Kühe) sowie ADr und BDr (australische Droughtmaster Kühe) [vi].

Das BLG besitzt einen Massenanteil von ca. 3,2 g pro kg Milch und einen isoelektrischen Punkt, und somit auch seine geringste Löslichkeit, bei einem pH von 5,35-5,41 [6]. Das Protein bildet Oligomere nach folgendem Schema:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Dabei sei zu beachten, dass das Oktamere nur bei der Variante A existiert. Im pH Bereich > 8,6 erfolgt eine irreversible Denaturierung.

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Abbildung 1: Primär- und Sekundärstruktur des BLG. Kugeln repräsentieren Cystein121

In der Primärstruktur befinden sich fünf Cysteinreste, die wie folgt Disulfidbrücken ausbilden: Cys66-Cys160 und Cys106-Cys119. Das Cys121 ist im Inneren der Struktur verborgen und hat unter physiologischen Bedingungen keinen Kontakt zum Lösungsmittel. Erst unter hohen Temperaturen oder hohen Drücken wird dieses Cystein für seine Umgebung zugänglich, und es entstehen so Disulfidbrücken mit anderen Proteinen, die für die Gelbildung verantwortlich gemacht werden [vii]. Einsatz findet BLG in der Lebensmittelindustrie zur Verbesserung der Löslichkeit, Emulgierung, Gel- und Schaumbildung sowie zur Aromabildung [viii], [ix].

Abbildung 1 zeigt die Primär- und Sekundärstruktur des BLG. Das linke Teil der Abbildung stammt aus [x]. Falls nicht anders vermerkt wurden alle Molekülbilder mit Rasmol Version 2.7.3 [xi] angefertigt.

2.1. Thermisch induzierte Veränderungen des b-Lactoglobulin

Das BLG erfährt, wie alle anderen Proteine auch, durch eine Erhöhung der Temperatur über einen gewissen Schwellenbereich hinaus, dem sog. Schmelzpunkt, eine Veränderung seiner Tertiär- und ggf. Quartärstruktur. Die Sekundär- und später die Primärstruktur werden erst bei sehr hohen Temperaturanwendungen irreversibel zerstört. Da die beiden Varianten A und B in der Aminosäuresequenz weitestgehend übereinstimmen, ist auch ihr thermisches Verhalten nahezu identisch [xii], [xiii], [xiv]. Die thermische Denaturierung von Proteinen hat zur Folge, dass hydrophobe Bereiche im Inneren der Moleküle nach außen gekehrt werden und so für Sekundärreaktionen zur Verfügung stehen. Ebenso geschieht dies auch beim BLG, bei dem während des Erwärmens zunächst bestehende Oligomere dissoziieren. Bei Temperaturen größer 50 °C findet eine partielle Auffaltung der Tertiärstruktur unter Exponierung hydrophober Bereiche statt [xv], welche z.B. den Cysteinrest Cys121 enthalten. Diese Reaktion verläuft bis ca. 65 °C reversibel [xvi], darüber reagieren Cysteine mit anderen Thiolgruppen, sodass große Aggregate entstehen können.

Falls andere Proteine zur Verfügung stehen, wie z.B. Caseine in der Milch, so werden auch Disulfidbrücken mit diesen Molekülen ausgebildet. Das Ionenmilieu [xvii], der pH-Wert [13, 14], die Laktose [13, 14] und die Anwesenheit anderer reaktiver Stoffe wirken sich auf die einzelnen Schritte, und somit auf die gesamte thermische Denaturierung sowie die Aggregation und Quervernetzung aus [xviii]. Hohe Lactosekonzentrationen genauso wie niedrige pH-Werte verzögern die Denaturierungsreaktion. Durch Zusatz von Calcium oder Natrium kann die Transparenz und Festigkeit der Proteingele gesteuert werden [15].

2.2. Druckinduzierte Veränderungen des b-Lactoglobulin

Die thermische Denaturierung unterscheidet sich von der durch Druck hervorgerufenen. Während bei der thermischen oder chemischen Denaturierung die native Struktur weitgehend zerstört wird, bleibt sie bei der Anwendung von hydrostatischem Druck besser erhalten [xix]. Dabei müsste hoher Druck zur Verringerung des Volumens führen [xx], da für ein monomeres globuläres Protein gilt: Vdenaturiert < Vnativ (aufgrund der Hohlräume im nativen Protein), sodass nach dem Prinzip von LeChatelier der hohe Druck die thermodynamische Stabilität erhöht.

Folgende aus der Arbeit von E. Paci [xxi] entnommene und bearbeitete Grafik (Abbildung 2) soll diesen Sachverhalt schematisch erklären. An der Ordinate ist die freie Energie aufgetragen und an der Abszisse eine willkürlich gewählte Faltungskoordinate.

Abbildung 2 zeigt, dass bei physiologischer Temperatur und Atmosphärendruck (oberste Kurve) ein Energieminimum N im nativen Zustand vorliegt. Bei einer moderaten Erhöhung des Drucks (mittlere Kurve) verschiebt sich das Minimum nach N’. Diese Verschiebung kann als „elastisch“ betrachtet werden, da sich bei Entspannung wieder N einstellt und keine Denaturierung erfolgt. Bei starker Druckerhöhung verschiebt sich

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2: Energetik eines Modellproteins [21]

das Minimum weiter nach N’’. Zugleich entsteht ein neues Minimum in D. Dieser Zustand ist der denaturierte und der Übergang vom nativen in diesen geschieht langsamer als durch Temperatureinwirkung [20], [xxii] und wird als „plastisch“ bezeichnet.

Um Übergänge vom nativen zum denaturierten Zustand simulieren zu können wurden viele physikalische (z.B. Temperaturerhöhung) und nichtphysikalische Störungen verwendet um Energiebarrieren zu überwinden oder sie „abzuflachen“, so z.B. das thermische Entfalten des Hühnereiweißlysozyms bei 500 K [22], das von BPTI bei 423 K und 498 K [xxiii] und des Proteins Barnase bei 498 K und 600 K [xxiv], [xxv]. Da hoher Druck keine hinreichende Absenkung der Energiebarrieren bewirkt, sondern im Gegenteil die Kinetik verlangsamt, ist er offensichtlich nicht so effizient zur Entfaltung von Proteinstrukturen einsetzbar wie entsprechend hohe Temperaturen. Hochdrucksimulationen erlauben jedoch das Studium der elastischen Relaxation nach einem Drucksprung. Beobachtete Zeitintervalle für das Denaturieren liegen in der Größenordnung von Millisekunden, die heutzutage zugänglichen Simulationsintervalle hingegen im Bereich von 10-100 ns [23].

Der typische Aufbau globulärer Proteine ist ein hydrophober Kern im Inneren mit hydrophilen Aminosäuren außen in Kontakt mit dem wässrigen Lösungsmittel, vergleichbar mit einem Tropfen hydrophober Moleküle in Wasser, was zum „liquid-hydrocarbon model“ führt [16]. Dieses erklärt viele kalorimetrische Daten, nur versagt es bei der Erklärung der druckinduzierten Denaturierung [xxvi]. Bei Drücken unter 100-200 MPa lässt sich eine positive Volumenänderung DV vom nativen zum entfalteten Protein beobachten, welche sich erst bei noch höheren Drücken ins Negative kehrt. Bringt man hingegen einen Kohlenwasserstoff in eine wässrige Umgebung und steigert den Druck, so wird zunächst eine negative Volumenänderung und dann eine positive beobachtet, also genau entgegengesetzt zu dem Verhalten der Proteine. Hummer et al. [xxvii] führten Berechnungen mit zwei Methanmolekülen in Wasser durch und kamen zu dem Schluss, dass es bei höheren Drücken vom energetischen Gesichtspunkt immer weniger günstig ist Van-der-Waals (VdW) Wechselwirkungen miteinander einzugehen als Wechselwirkungen mit Wasser (siehe dazu Abbildung 1).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 3: Freie Energie zw. Methanmolekülen [27]

In dieser Abbildung von Hummer et al. [27] geben die Pfeile an, dass sich mit zunehmenden Druck auch W (freie Energie) in Einheit von kBT zu höheren Werten verschiebt. Man erkennt, dass am Punkt I, mit einem gegenseitigen Abstand der beiden Methanmoleküle von ca. 0,39 nm, der energetisch

stabilste Zustand vorliegt (direkte Berührung wie bei VdW üblich)und der Zustand II, mit einem Abstand von ca. 0,73 nm, hingegen auf einem höheren Energieniveau liegt (das ist der Fall mit eingelagertem Wasser zwischen den Methanmolekülen). Man beobachtet nun, dass mit steigendem Druck der Punkt I immer ungünstiger wird bezogen auf Punkt II. D.h., es wird für die Methanmoleküle energetisch immer weniger günstig in direktem Kontakt zu bleiben, da mit sehr hohen Drücken die Energieniveaus I und II fast identisch hoch liegen.

Bei der Denaturierung durch Druck wird eine Verschiebung der NMR-Spektren beobachtet [xxviii], [xxix], was sich als Zunahme der Wechselwirkungen zwischen hydrophoben Bereichen des Proteins und dem Lösungsmittel deuten lässt. Es ist bekannt, dass sich bei der thermischen Denaturierung hydrophobe Bereiche nach außen kehren mit der Folge, dass die native Struktur zerstört wird. Da man bei druckbehandelten Proteinen kaum eine Änderung des spezifischen Volumens misst, ist nun die Frage offen, woher der Anstieg der Wechselwirkung des Proteins mit dem Wasser kommt. Die Lösung dieses Problems lieferten Hummer et al. mit dem Vorschlag, dass Wassermoleküle in den hydrophoben Kern der Proteine eindringen und sie so denaturieren.

2.3. Modifikationen durch den pH-Wert

Die physiologische Funktion des BLG bleibt noch immer ungeklärt. Eine Hypothese besagt, dass es aufgrund seiner Fähigkeit unpolare Moleküle wie Fettsäuren, Triglyceride, Retinol, Vitamin D etc. aufnehmen zu können [10, [xxx], als eine Art „Schleußer“ durch den Magen fungiert. Dabei hilft die Tatsache, dass es im sauren pH Bereich in der „geschlossenen“ Form und im neutralen Bereich in der „offenen“ Form vorliegt [xxxi]. Abbildung 4 verdeutlicht dies sehr schön. Die Helizes sind rot, Faltblätter grün und die E-F-Loop blau gekennzeichnet. Es ist erkennbar wie die Loop den Eingang in den hydrophoben Kern verschließt. Als Beispiel sei hier die potentielle Schutzfunktion gegenüber dem Vorverdau essentieller Fettsäuren im Kälbermagen mit anschließender Freisetzung im Dünndarm erwähnt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 4: Offene (2BLG) und geschlossene Form (1DV9) des BLG aus [58]

Das Zustandekommen dieser zwei Formen begründet sich auf der Tatsache, dass das Glutamat89 (Glu89), welches sich in der E-F Loop befindet, einen erhöhten pKs-Wert von ca. 6-7 verglichen mit anderen Glutamatresten besitzt (ca. 4-5) [10]. Steigt der pH-Wert vom sauren Bereich beginnend an, so findet gerade im Bereich des pKs-Wertes die Konformationsänderung aufgrund der sich ändernden Protonierung statt. Durch die abstoßenden Kräfte gleichnamiger Ladungen kann diese entstehen. Und tatsächlich misst man vor dem Magen in der Milch einen pH von 6,5-6,75 („offene“ Position), im Magen von ca. 2 („geschlossene“ Position) und im Zwölffingerdarm einen leicht alkalischen pH von 7-8 (wieder „offene“ Position), sodass eingelagerte Fettsäuren wieder entlassen und vom Körper verwertet werden können [31]. Aber dies stellt, wie gesagt, nur eine Hypothese dar.

Funtenberger et al. [xxxii] erkannten, dass die Denaturierung im wässrigen System schneller verläuft als im druckunempfindlicherem (pH verändert sich nur gering mit dem Druck) Tris-Puffer. In mit bis zu 300 MPa behandelter Molkenproteinisolatlösung zerfielen die im Bereich zwischen pH 4 und 6 gebildeten Molkenproteinaggregate bei Neutralisierung und ein Rückgang des denaturierten BLG konnte festgestellt werden. Van Mil et al. [xxxiii] vermuteten, dass im genannten pH Bereich vermehrt nichtkovalente Bindungen und nur wenige Disulfidbrücken die denaturierte Form stabilisieren. Bei pH 7 hingegen sind die Aggregate über Disulfidbindungen verbunden.

2.4. Experimentelle Untersuchungen

In den letzten Jahren wurden viele experimentelle Arbeiten zu BLG veröffentlicht. Als ideales Arbeitsinstrument erwies sich die Intrinsische Fluoreszenz-Emissions-Spektroskopie (IFE), da sie die Emission von Tryptophanresten als Sonde verwendet, welche von der Temperatur, dem Druck und der Hydrophobizität des Lösungsmittels abhängt und somit ideal für die Messung der Exponierung hydrophober Bereiche geeignet ist. Diese Exponierung wird von einer Rotverschiebung des Emissionsspektrums begleitet. Valente-Mesquita et al. [xxxiv] verglichen das IFE Muster von druckbehandeltem mit dem durch das chaotrope Reagenz Guanidinhydrochlorid (GdnHCl) denaturierten BLG. Es ist bekannt, dass GdnHCl zur Dissoziation und Entfaltung von BLG führt. Durch den Vergleich der sehr ähnlichen Spektren kamen sie zu dem Schluss, dass dies auch bei einer Druckbehandlung geschehen muss. Natives BLG weist sein Absorptionsmaximum bei 332 nm auf. Nach der Behandlung mit GdnHCl wurde eine Rotverschiebung von ca. 11 nm festgestellt, wobei das ursprüngliche Maximum selbst nach Entspannung des Systems nicht mehr ganz erreicht wurde. Sie führten diesen Sachverhalt darauf zurück, dass nicht mehr 100% der Moleküle in ihre ursprünglich Konformation zurückkehrten, sondern dass ein Teil Faltungsschwierigkeiten hatte und teilweise Aggregate durch Disulfidbrücken entstanden, was wiederum durch andere Forschergruppen [28, 29, 32, [xxxv], [xxxvi], [xxxvii], [xxxviii], [xxxix] bestätigt wurde. Ein Umstand der zu dieser Erkenntnis führte war, dass man bei mit b-Mercaptoethanol behandeltem BLG keine hochmolekularen Aggregate mehr nachweisen konnte. b-Mercaptoethanol reagiert spezifisch mit freien Thiolgruppen und blockiert diese somit für andere Reaktionen [32]. Ein anderer Grund für die Annahme der Existenz hochmolekularer Aggregate war der Anstieg des hydrodynamischen Radius [34]. Dufour et al. [30] führten Experimente mit der Fluoreszenz des BLG-Retinol-Komplexes bei pH 7,0 in 50 mM Tris-Puffer durch, dessen Absorptionsmaximum bei ca. 450 nm liegt. Sie stellten einerseits fest, dass mit steigendem Druck auch die Fluoreszensintensität zunimmt, welche bei 150 MPa mit ca. 460 nm ihr Maximum erreicht. Andererseits ist mit weiter steigendem Druck eine Abnahme der Intensität verbunden, wobei sie bei 300 MPa gegen Null strebt. Als Begründung geben sie die Dissoziation des Komplexes an. Der Intensitätszuwachs soll durch die starke Änderung der hydrophoben Umgebung entstehen. Zu beachten gilt auch hier, dass nach einer Druckbehandlung von 300 MPa der Komplex nicht mehr vorliegt, was wiederum auf die Konformationsänderungen des BLG zurückgeführt wurde. Bei einer Druckanwendung von nur 200 MPa tauchte auch das ursprüngliche Absorptionsverhalten wieder auf, was sie mit der permanenten Erhaltung des Komplexes begründen.

Song [xl] zeigte mit Hilfe eines eigens entwickelten Hochdruckviskosimeters, kombiniert mir Messungen der dynamischen Lichtstreuung, dass im Druckbereich von 0,1 – 180 MPa eine reine Dissoziation des Dimers erfolgt. Bei Drücken über 200 MPa steigt die Viskosität aufgrund der Oligomerisierung stark an.

Oft werden Experimente mehrfache Alkohole wie z.B. Glycerin verwendet. Man geht davon aus, dass sie durch die bevorzugte Hydratisierung des Proteins im wässrigen Milieu Proteinstrukturen stabilisieren können. Dufour et al. [30] führten die schon oben erwähnten Experimente auch mit einer 40/60 v/v Glycerin/Tris-Puffer-Lösung durch. Hierbei stellten sie ein sehr ähnliches Verhalten gegenüber den Versuchen ohne Glycerin fest. Selbst die Hysterese der Rotverschiebung war zu beobachten. Sie folgerten daraus, dass Glycerin kaum stabilisierende Wirkung im hohen Druckintervall aufweist.

Des Weiteren bediente man sich auch anderer Analysemethoden, wie z.B. Zirkulardichroismus (CD) [28], [39], Fouriertransfomations-Infrarotspektroskopie (FTIR) [xli] und Kernresonanz (NMR) [38], [41]. Deren Ergebnisse unterstützen die oben erwähnten Theorien.

Bei den Forschungen zu Entstehung und Eigenschaften von Proteingelen stellte man fest, dass sich durch die Behandlung einer Molkenproteinlösung mit Druck die Viskosität und die Wasserbindung erhöhten. Bei Proteinkonzentrationen größer 5 bis 10 % bildeten sich Gele [xlii], [xliii], [xliv], [xlv], die im Vergleich zu thermischen Gelen eine porösere Struktur und geringere Festigkeit besaßen [xlvi], [xlvii], [xlviii]. Die Festigkeit der thermischen Gele kann nochmals gesteigert werden, wenn man eine Druckbehandung vorschaltet [xlix]. Als Grund wird diskutiert, dass die Druckbehandlung Thiolgruppen wie z.B. Cystein121 freilegt, die anschließend die thermische Vernetzung fördern. Das steht aber im Widerspruch zu den Experimenten von Olsen et al. [44], die keinen Einfluss der Druckvorbehandlung auf die Festigkeit der Proteingele feststellten.

Hinsichtlich der Emulgiereigenschaften von druck- und hitzebehandelten Molkenproteinen lässt sich sagen, dass diese sich im Gegensatz zum nativen Protein verschlechtern. Ausgebildete Emulsionen hingegen werden durch die Druckbehandlung nicht beeinträchtigt [l].

3. Angewandte Methode: Molekularmechanik

Ziel des Molecular Modelling ist die Beschreibung und Voraussage von Molekülbewegung auf atomarer Basis. Um dies mit den heutigen Rechnern sinnvoll bewerkstelligen zu können, werden einige Vereinfachung getroffen und Berechnungsalgorithmen geschaffen. Diese Vereinfachungen reduzieren die Komplexität der Wirklichkeit zwar stark, doch trotzdem lassen sich sinnvolle Ergebnisse mit ihnen gewinnen. Soweit nicht anders vermerkt stammen alle Ausführungen aus dem Vorlesungsskript für die Vorlesung "Grundlagen des Molecular Modelling" [li] von Dr. rer. nat. Christina Scharnagl am Lehrstuhl für Physik Weihenstephan E14 der TUM.

3.1. Ensembles und Ergodizität

In einer MD-Simulation beobachtet man eine Vielzahl von Mikrozuständen zu gegebenen externen Parametern (diese entsprechen dem Makrozustand) [lii], [liii], [liv].

Die vorliegende Arbeit verwendet das NPT-Ensemble, in Übereinstimmung mit den Randbedingungen der durchgeführten Experimente. Im NPT-Ensemble fluktuieren die innere Energie En, sowie das Volumen Vn der Mikrozustände, nicht aber der Druck, die Temperatur und die Teilchenzahl. Bei sehr langen Beobachtungszeiten kann davon ausgegangen werden, dass alle möglichen Mikrozustände realisieren. Man nennt diesen Zustand ergodisch. In diesem Fall ist der zeitliche Mittelwert gleich dem thermodynamischen Mittelwert für das Ensemble. Bei der zeitlich beschränkten MD wird jedoch nur ein Teil des Zustandraums durchlaufen. Im Gleichgewicht liegt ein Minimum der freien Enthalpie H vor, und den Zustand der Mikrozustände charakterisiert die normierte Wahrscheinlichkeit ρi („Boltzmann-Faktor“). Die freie Enthalpie H lässt sich aus der Summe über die Wahrscheinlichkeiten aller Mikrozustände berechnen (Siehe Tabelle 1: Zusammenfassung des NPT-Ensembles).

Tabelle 1: Zusammenfassung des NPT-Ensembles

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

b=1/kBT, En und Vn = Energie und Volumen der Mikrozustände.

Die Verwendung des NPT-Ensembles setzt konstanten Druck und Temperatur voraus. Dazu bedient man sich folgender Überlegungen: Die Temperatur lässt sich aus dem Gleichverteilungssatz der Thermodynamik herleiten:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Hierbei ist <K> die mittlere kinetische Energie des Systems, ½ mivi2 die kinetische Energie des Teilchens i, kB die Boltzmannkonstante, T die externe Temperatur und f die Zahl der Freiheitsgrade des Systems. Daraus lässt sich die instantane Temperatur Tinst ableiten, die momentan im System herrscht. Es ist zu erkennen, dass man die instantane Temperatur über die Geschwindigkeiten der Teilchen skalieren kann, sodass ihr Mittelwert mit der makroskopisch vorgegebenen Temperatur T übereinstimmt.

Bei der Berechnung des instantanen Drucks des Systems behilft man sich folgender Überlegung nach Clausius:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

[Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] mit [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] ( 3.3)

Die oberste Gleichung sagt aus, dass der Druck als die negative Änderung der mittleren gesamten Energie des Systems mit dem Volumen aufgefasst wird (Druck entspricht Energiedichte). Diese Gesamtenergie setzt sich aus den mittleren kinetischen und potentiellen Energien, Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten und Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten, additiv zusammen. Der Anteil Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten lässt sich wie oben aus der mittleren thermischen Energie pro Freiheitsgrad berechnen und über Skalierung der Geschwindigkeiten der einzelnen Teilchen auf T einstellen. Gleichung Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten verwendet diese Aussage nun. Pid.gas ist der Druck eines idealen Gases, also der Druck der nur aufgrund der kinetischen Energie und der Stöße mit der Wand ausgeübt wird. Gleichung Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten beschreibt dagegen den Anteil am Druck, der durch die Wechselwirkungen der Teilchen bedingt ist. Man nutzt hierfür folgende Umformung: statt die potentielle Energie nach dem Volumen zu differenzieren, bildet man nach der Kettenregel das Produkt aus der nach dem Ort differenzierten potentiellen Energie und dem Kehrwert des nach dem Ort differenzierten Volumens. Dabei wird ein kugelförmiges Volumen angenommen, welches sich leicht nach dem Ort (entspricht Radius) ableiten lässt. Bei der Anpassung des instantanen Druck Pinst an den gewünschten Druck P muss man einfach nur den Anteil Kinst mit den Geschwindigkeiten und Winst (Winst entspricht dem „Virial“ nach Clausius) mit den Orten skalieren. Das Ganze kann auch als verknüpftes System aus Baro- und Thermostat, sowie dem Simulationssystem, verstanden werden (Abbildung 5)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 5: Modell des Simulationssystems aus Thermo- und Barostat, sowie des Protein-Lösungsmittelssystems mit fluktuierenden Mikrozustandsgrößen En und Vn

3.2. Nichtbindende Kräfte

Zwischen Molekülen herrschen anziehende und abstoßende Kräfte, welche man als intermolekular bezeichnet: Lennard-Jones- und Coulombkräfte. Bei der Berechnung des Kraftfeldes, und damit der potentiellen Energien zwischen den Teilchen i und j (Abstand rij) nach Lennard Jones wird folgende Gleichung verwendet:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Bei der Deutung der Formelzeichen hilft folgende Abbildung (basiert auf [lv]):

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 6: Lennard Jones 6-12 Potential

Hierbei steht σij für den Abstand der Nullstelle vom Ursprung. Bereich I beschreibt die Abstoßung nach Van-der-Waals, Bereich II die Anziehung nach London. Zusammengefasst spricht man vom Lennard Jones-Potential. Dabei steht rm für den Abstand der Atome mit minimalem Energieinhalt und für εij den Abstand der minimalen Energie von der Abszisse. Bestimmt werden die Parameter εii und σii für homonukleare Systeme, d.h. die potentielle Energie beispielsweise zwischen zwei Wasserstoffatomen. Man verwendet folgende Kombinationsformel, wenn man nun die Werte εij und σij zwischen zwei verschiedenen Atomsorten berechnet:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Es ist zu erkennen, dass σij nichts anderes als das arithmetische und εij das geometrische Mittel aus den Einzelwerten der homonuklearen Atome ist.

Für die Coulombwechselwirkungen gilt:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Hierbei sind qi und qj die Partialladungen und rij der Abstand der Atome i und j, ε0 die Dielektrizitätskonstante in Vakuum und εeff ein Faktor um ε0 für das Medium zu korrigieren. In reinem Wasser ist εeff ≈ 80, für Vakuum εeff = 1 und für unpolare flüssige Kohlenwasserstoffe εeff = 2. Werden die Wassermoleküle explizit simuliert, beträgt εeff = 1.

3.3. Kovalente Verknüpfungen

Zur Beschreibung der Molekülkinetik und -energetik benötigt man auch kovalente Kräfte, d.h. die nur zwischen den gebundenen Atomen herrschen:

Ukovalent = Ubond + Uangle + Utorsion + Uimproper ( 3.6)

Um nun sinnvolle Ergebnisse in einer akzeptablen Rechenzeit zu erhalten, vereinfacht sich die Bindungskinetik indem man z.B. von harmonischen Oszillatoren ausgeht.

Streckschwingungen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Winkelschwingungen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Out-of-plane-Schwingungen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Bei Torsionsbewegungen hingegen kommt ein periodisches Potential zum Einsatz.

Torsionen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Jede Bewegung wird durch die Gleichgewichtslage (l0, q0, f0, w0) und die entsprechende Kraftkonstante (kl, kq, kf, kw) charakterisiert, die aus Experimenten für Modellmoleküle bestimmt werden können, wie z.B. aus IR-Spektroskopie.

3.4. Berechnungsalgorithmen

Grundlage für die Bewegungsanalyse bilden die Newtonschen Bewegungsgleichungen, welche numerisch integriert werden. Ausgehend von den Orten r, Geschwindigkeiten v und den Beschleunigungen a zur Zeit t werden die Orte r(t+Dt) zu einem späteren Zeitpunkt t+Dt berechnet. Dabei gilt für die Kraft Fi auf ein Teilchen i mit Masse mi:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten mit Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten ( 3.11)

Um nun eine numerische Integration durchführen zu können bedarf es folgender Voraussetzungen:

1. Energieerhaltung
2. Impulserhaltung
3. Finite Zeitschritte so klein, dass von konstanter Beschleunigung in diesem Intervall ausgegangen werden kann

Grundlage für Punkt 3 bildet eine Taylor-Reihe:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Annahme konstanter Kräfte in Δt bedingt:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten und Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten ( 3.15)

In der vorliegenden Arbeit kam der Leap Frog – Algorithmus zur Anwendung:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten ( 3.16) Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten ( 3.17)

Es ist zu erkennen, dass hier die Geschwindigkeiten explizit berechnet werden, was bei anderen Algorithmen nicht geschieht, aber für die MD-Simulation wichtig ist. Grund dafür ist die Einführung eines geschwindigkeitsabhängigen Reibungsterms zur Skalierung des Druckes durch die Ankopplung an einen Thermo- und Barostaten zur Berechnung des NPT-Ensembles (Langevin-Dynamik). Des Weiteren werden die Geschwindigkeit und der Ort nie zur selben Zeit berechnet, sondern mit einem halben Zeitschritt Unterschied.

Um die Frage zu klären wie lange Δt sein darf, nutzt man folgende Überlegung:

Die Zeitschritte müssen so kurz gewählt werden, dass die Bedingung a = konst in Dt auch für die hochfrequentesten Schwingungen (C-H-Streckschwingungen) erfüllt ist. Dafür wird eine Schwingungsperiode in zehn Segmente unterteilt und es resultiert mit einer Schwingungsdauer von ungefähr 10-14 s ein Δt = 10-15 s = 1fs, d.h. es bedürfte zur Berechnung einer Millisekunde an Bewegung einer Simulation von 1012 Schritten. Soll der Zeitschritt verlängert werden, so kann man die Bindungen mit Wasserstoffatomen über den SHAKE BONH - Algorithmus fixieren und erreicht so ein Δt von 2 fs.

In der folgenden Darstellung sind die Zeitskalen der Bewegung in biologischen Molekülen zusammengefasst:

- Lokale Bewegungen ( 0.01 – 5 Å, 10-15 – 10-1 s )
- Atomare Fluktuationen
- Bewegung von Seitenketten und Loops
- Bewegung starrer Körper ( 1 – 10 Å, 10-9 – 1 s )
- Helixbewegungen
- Domänenbewegung
- Bewegung von Untereinheiten
- Großräumige Bewegungen ( > 5 Å, 10-7 – 104 s )
- Helix-„Knäuel“-Übergang
- Dissoziation/Assoziation
- Faltung/Entfaltung

Es ist zu erkennen, dass die Entfaltungsvorgänge im Bereich von 10-9 - 1 s liegen und somit, wie schon erwähnt, nicht im erfassbaren Bereich einer MD-Simulation [lvi]. Ein Problem bei Hochdruck- im Gegensatz zu Hochtemperatursimulationen stellt die geringere thermische Energie dar. Sie verhindert die Beobachtung dieser großräumigen Bewegungen, doch Simulationen bei höherer Temperatur zeigen bereits im Nanosekundenbereich Entfaltungsvorgänge [lvii].

3.5. MD-Simulationen

Jede MD-Simulation startet von einer Ausgangsstruktur. Dazu steht z.B. die Protein Data Bank [lviii] zur Verfügung, die diese Strukturen als sog. pdb-Datei bereitstellt. Diese Dateien werden meist aus Röntgenstrukturanalysen der kristallisierten, oder aus NMR-Analysen der Proteine in fester oder flüssiger Phase gewonnen. Nähere Angaben über Materialien und Methoden der Gewinnung sind in der dazugehörigen Veröffentlichung nachzulesen. In einer pdb-Datei wird jedes Atom mit seinen Koordinaten im kartesischen Raum, sowie seinen Bindungspartnern, gespeichert. Mit Freewareprogrammen wie Rasmol, gOpenMol, Chime, usw. können diese Dateien betrachtet werden. Zur Simulation hingegen werden andere Programme benötigt, welche die Newtonschen Bewegungsgleichung numerisch zu integrieren vermögen. Das für diese MD verwendete Programm ist CHARMM (C hemistry at Har vard M acromolecular M echanics), welches unter der Leitung von M. Karplus in einer jährlich überarbeiteten Version erscheint. Nähere Angaben dazu im Kapitel 3.6. CHARMM. Weitere Simulationsprogramme sind z.B. AMBER [lix] und GROMOS.

Die verwendete Version von CHARMM ist 28B1 und die Berechnungen wurden auf einem Linux-Rechner des Physiklehrstuhls der TU-München Weihenstephan, unter der Betreuung von Dr. rer. nat. Christina Scharnagl durchgeführt. Der Rechner wies folgende Spezifikationen auf:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Um nun ein Protein zu solvatisieren, wird es mit einer Wasserbox der gewünschten Größe zusammengefügt. Diese Box besteht aus vielen äquilibrierten Einheitsboxen (mit der richtigen Dichte) der Kantenlänge 18 Å. Überlappungen von Wasser mit Proteinatomen werden mit dem Entfernen der entsprechenden Wassermoleküle beseitigt. Abbildung 7 macht dies deutlich. Darauf folgt, nach Bestimmung der Gesamtladung des Systems, das Einfügen der entsprechenden Anzahl an Gegenionen, statistisch um den Koordinatenursprung verteilt. Bei negativer Gesamtladung sind dies Natriumionen und bei positiver Gesamtladung Chloridionen, sodass die Wasserbox, das Protein und die Ionen nach außen hin neutral erscheinen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 7: Zusammenfügen des Proteins mit der Lösungsmittelbox

Unphysikalische Lösungsmittel-Vakuum-Übergänge beseitigt die Anwendung periodischer Randbedingungen. Eine Primärzelle wird erzeugt und diese in alle Raumrichtungen periodisch vervielfältigt, sodass diese neuen Bildzellen die Primärzelle gleichmäßig umschließen. Damit erhält man dann ein periodisches System von Bildzellen um die Primärzelle, welche die Bedingungen in der Realität besser darstellen als nur Vakuum. Dabei gilt zu beachten, dass die Bildzellen nichts anderes als das Spiegelbild der Primärzelle darstellen, d.h. alles was sich aus dieser nach rechts herausbewegt, tritt an der gleichen Stelle gegenüber wieder ein (siehe dazu Abbildung 8)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 8: Aufbau der periodischen Randbedingungen

[...]


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[viii] D.W.S. Wong: Proteins, Mechanism and Theory in Food Chemistry, Van Nostrand Reinhold Publishers, New York 1989

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[xii] H.-J. Beyer: Zum Einfluss der Proteinkonzentration auf das Denaturierungsverhalten der Molkenproteine sowie die damit verbundenen rheologischen Veränderungen, TU-München Weihenstephan, Dissertation, 1990

[xiii] J. Plock: Zum Einfluß von Lactose auf die Denaturierung von Molkenproteinen in Molkenkonzentrat und die Ausbildung thermisch induzierter Gelstrukturen, TU-München Weihenstephan, Dissertation, 1994

[xiv] T. Spiegel: Thermische Denaturierung und Aggregation von Molkenproteinen in Ultrafiltrationskonzentraten, TU-München Weihenstephan, Dissertation, 1999

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[xvii] K. Mayer: Einflüsse von pH-Wert und Ionenzusätzen auf die Molkenproteingelierung, TU-München Weihenstephan, Dissertation, 1990

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[xxxii] S. Funtenberger, E. Dumay, J. C. Cheftel: Pressure-induced aggregation of b-lactoglobulin in pH 7.0 Buffers, Lebensm.-Wiss. u.Technol. 28 (1995), S. 410-418

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[xxxv] S. Funtenberger, E. Dumay J. C. Cheftel: High pressure promotes b-lactoglobulin aggregation through SH/S-S interchange reactions, J. Agric. Food Chem. 45 (1997), S. 912–921

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[xxxviii] P. Kolakowski, E. Dumay, J.-C. Cheftel: Effects of high pressure and low temperature on b-Lactoglobulin unfolding and aggregation, Food Hydrocolloids 15 (2001), S. 215-232

[xxxix] N. Tanaka, Y. Tsurui, I. Kobayashi, S. Kunugi: Modification of the single unpaired sulfhydryl group of b-Lactoglobulin under high pressure and the role of intermolecular S-S exchange in the pressure denaturation [Single SH of b-Lactoglobulin and pressure denaturation], Intern. Journal of Biological Macromolecules 19 (1996), S. 63–68

[xl] K. Song: In-situ Untersuchung von wässriger b-Lactoglobulinlösung unter Hochdruck, Diplomarbeit TU München 2005

[xli] N. Tanaka, S. Kunugi, Effect of pressure on the deuterium exchange reaction of a-lactalbumin and b-lactoglobulin, Intern. Journal of Biological Macromolecules 18 (1996), S. 33–39

[xlii] J. van Camp, A. Huyghebaert: High pressure-induced gel formation of whey protein and haemoglobin protein concentrate, Lebensm.-Wiss. u. Technol. 28 (1995), S. 111–117

[xliii] J. Hinrichs, H. G. Kessler: Denaturation and functional properties of pressure-treated milk proteins, High Pressure Food Science, Bioscience and Chemistry, Ed. Issacs, N. S., The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK, S. 207–213

[xliv] K. Olsen, R. Ipsen, J. Otte, L. H. Skibsted: Effect of high pressure on aggregation and thermal gelation of b-Lactoglobulin, Milchwissenschaft 54 (1999), Nr. 10, S. 543–546

[xlv] C. Kanno, T.-H. Mu, M. Ametani, N. Azuma: Formation of a gel from b-lactoglobulin under high hydrostatic pressure, Advances in High Pressure Bioscience and Biotechnology, Ed. H. Ludwig, Springer Verlag, Berlin, Germany, S. 329–332

[xlvi] J. van Camp, A. Huyghebaert: A comparative rheological study of heat and high pressure induced whey protein gels, Food Chemistry 54 (1995), S. 357–364

[xlvii] D. V. Zasypkin, E. Dumay, J. C. Cheftel: Pressure-and heat-induced gelation of mixed b-Lactoglobulin/xanthan solutions, Food Hydrocolloids 10, S. 203-211

[xlviii] E. M. Dumay, M. T. Kalichevsky, J. C. Cheftel: Characteristics of pressure-induced gels of b-Lactoglobulin at various times after pressure release, Lebensm. Wiss. u. Technol. 31 (1998), S. 10–19

[xlix] K. Tada, T. Suzuki: Effect of pressure treatment on the heat-induced gelation of whey protein concentrate, Anim. Sci. Technol. 65 (1994), Nr. 9, S. 862–867

[l] V. B. Galazka, D. A. Ledward, E. Dickinson, K. R. Langley: High pressure effects on emulsifying behaviour of whey protein concentrate, Journal of. Food Science 60 (1995), S. 1341-1343

[li] URL: www.physik.blm.tu-muenchen.de , Stand 05.10.2005

[lii] H. C. Andersen: Molecular dynamics simulations at constant pressure and/or temperature, J. Chem. Phys. 72 (1980), S. 2384–2393

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[lv] A. R. Leach: Molecular Modelling: Principles and Applications, Second Edition, Prenctice Hall, 2002

[lvi] D. Trzesniak, R.D. Lins, W.F. van Gunsteren: Protein Under Pressure: Molecular Dynamics Simulation of the Arc Repressor, P ROTEINS: Structure, Function and Bioinformatics, 65 (2006), S. 136-144

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[lviii] URL: http://www.rcsb.org/pdb/, Stand 08.10.2005

[lix] W. D. Cornell, P. Cieplak, C. I. Bayly, I. R. Gould, K. M. J. Merz, D. M. Ferguson, D. C. Spellmeyer, T. Fox, J. W. Caldwell, P. Kollman: A second generation force field for the simulation of proteins, nucleic acids, and organic molecules, J. Am. Chem. Soc. 117 (1995), S. 5179–5197

Ende der Leseprobe aus 93 Seiten

Details

Titel
Proteinstruktur und Elektrostatik von beta-Lactoglobulin unter Hochdruck
Hochschule
Technische Universität München  (Lehrstuhl für Physik E13)
Note
1,0
Autor
Jahr
2007
Seiten
93
Katalognummer
V86344
ISBN (eBook)
9783638906708
ISBN (Buch)
9783638906746
Dateigröße
5363 KB
Sprache
Deutsch
Schlagworte
Proteinstruktur, Elektrostatik, Hochdruck
Arbeit zitieren
Alexander Kutter (Autor), 2007, Proteinstruktur und Elektrostatik von beta-Lactoglobulin unter Hochdruck, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/86344

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