Melatonin war seit seiner Entdeckung als Neurohormon immer wieder Gegenstand zahlreicher Untersuchungen in Bezug auf seine Funktion, Struktur und Wirkung. Während eine ursprüngliche Rolle in Pigmentierungseffekten der Haut gesehen wurde, zeigte sich eine weitaus bedeutsamere Funktion als Mediator der Information Dunkelheit. Die klassische Vorstellung, dass Melatonin lediglich als Hormon des Pinealorgans sowohl bei tag- als auch nachtaktiven Vertebraten circadiane Rhythmen mit ausgeprägten nächtlichen Gipfeln aufweist und als Chronobiotikum wirkt, erfuhr durch die Entdeckung extrapinealer Bildungsorte, z.B. in diversen Zellen und Organen wie der Retina, der Haut, des Gastrointestinaltrakts, den enterochromaffinen Zellen sowie der HARDERschen Drüse und Leukocyten, eine beträchtliche Erweiterung. Schließlich rechtfertigt die Entdeckung von Melatonin in Bakterien, Protozoen, Pflanzen, Pilzen und Invertebraten von ubiquitärem Vorkommen zu sprechen. Außer dem Weg der Deacetylierung wurden auch Wege der Demethylierung und der 2-Hydroxylierung beschrieben, jedoch wiesen Hirata et al. (1974) einen völlig anderen, lange Zeit vernachlässigten Abbauweg des Melatonins in Form der oxidativen Pyrrolringöffnung nach. Aus dieser Pyrrolringspaltung des Indolamins resultieren als Metabolite die zwei substituierten Kynuramine AFMK und dessen deformyliertes Folgeprodukt AMK.
Bereits in früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass Saccharomyces cerevisiae Melatonin produziert, von außen aufnimmt und verstoffwechselt; ebenso, dass exogen gegebene Vorstufen in Melatonin umgewandelt werden können. Ziel dieser Arbeit soll es nunmehr sein zu überprüfen, ob auch die substituierten Kynuramine von Hefe aufgenommen und weiter verstoffwechselt werden können. Die Untersuchung dieser Substanzen erscheint insofern sinnvoll, als AFMK aus Melatonin auch auf diversen nicht-enzymatischen Wegen – also organismenunabhängig – entsteht und somit auch in Hefen erscheinen sollte. Zu untersuchen wäre, ob auch die oben beschriebenen, kürzlich entdeckten Substanzen oder weitere, durch radikalische Reaktionen erzeugte AFMK-Metabolite von Saccharomyces gebildet werden. Da Hefezellen kaum Pigmente enthalten, liegt ein Vorteil darin, dass bei Auswertung der interessierenden Edukte und Produkte keine Überlagerung mit zelleigenen fluoreszenten oder anderweitig farbigen Verbindungen zu erwarten sein sollte. Außerdem lässt die hohe Stoffwechselaktivität diesen Organismus als besonders geeignet erscheinen.
Inhaltsverzeichnis
- Abkürzungsverzeichnis
- Inhaltsverzeichnis
- 1. Einleitung
- 2. Material und Methoden
- 2.1 Chemikalien, Materialien und Geräte
- 2.1.1 Chemikalien
- 2.1.2 Materialien und Geräte
- 2.2 Herstellung der verwendeten Reagenzien und Medien
- 2.2.1 Herstellung des Hefe-Salzmediums (Grundmedium)
- 2.2.2 AFMK, AMK, AMMC und MQA
- 2.3 Herstellung der Hefe-Suspension
- 2.4 Umsatz von N-Acetyl-N²-formyl-5-methoxykynuramin (AFMK) zu N-Acetyl-5-methoxykynuramin (AMK)
- 2.4.1 Inkubationen in Gegenwart von Wasserstoffperoxid (H2O2) in verschiedenen Konzentrationen
- 2.4.2 Inkubationen in Abwesenheit von Wasserstoffperoxid (H2O2) und Untersuchung der AFMK-Aufnahmekapazität der Hefezellen
- 2.5 Intensitätsunterschiede in der AFMK-Umsatzrate durch H2O2-Zugabe und veränderte Inkubationsbedingungen
- 2.5.1 Auswirkungen von H₂O2-Zugabe auf die AFMK-Umsatzrate
- 2.5.2 Lyse der Hefezellen in hypotonem Medium (aq. dest.)
- 2.5.3 Inkubation eines größeren Hefevolumens bei höherer Temperatur und Glucose-Konzentration
- 2.5.4 Weitere Verlängerung der Inkubationszeit und Untersuchung des Einflusses der Sauerstoffverfügbarkeit
- 2.6 Qualitative Analyse des entstandenen putativen AMK mittels photometrischer und fluorometrischer Messungen
- 2.6.1 Aufnahme eines Absorptionsspektrums des entstandenen putativen AMK im Spektralphotometer
- 2.6.2 Fluorometrischer Nachweis von AMK durch Überführung in AMMC
- 2.7 Beeinflussung des AFMK- und AMK-Umsatzes durch Zugabe verschiedener N-Quellen und hyperosmotischen Stress
- 2.7.1 Versuch des weiteren Umsatzes von aus AFMK entstandenem AMK durch Hefen zu AMMC mittels Zugabe einer N-Quelle
- 2.7.2 Auswirkungen von hyperosmotischem Stress auf den AFMK-Umsatz
- 2.7.3 Auswirkungen verschiedener N-Quellen auf den AFMK-Umsatz
- 2.8 Quantitative Messung des AFMK-Umsatzes durch Hefezellen mittels Photometrie
- 2.8.1 Aufnahme der Absorptionsspektren von AFMK und AMK in Ethylacetat
- 2.8.2 Quantitative Messung des AFMK-Umsatzes in reinem Salzmedium
- 2.8.3 Quantitative Messung des AFMK-Umsatzes bei hyperosmotischem Stress
- 2.8.4 Quantitative Messung des AFMK-Umsatzes nach Zugabe unterschiedlicher N-Quellen
- 2.8.5 Nähere Untersuchung der Ergebnisse aus 2.8.2 und 2.8.4 durch weitere experimentelle Modifikationen
- 2.8.5.1 Vergleich des AFMK-Umsatzes in reinem Salzmedium bei leicht saurem und alkalischem pH
- 2.8.5.2 Vergleich des AFMK-Umsatzes nach Zugabe von Arginin bzw. Guanidin bei leicht saurem und alkalischem pH
- 2.8.5.3 Vergleich des AFMK-Umsatzes nach Zugabe von Asparagin bzw. Asparaginsäure (Aspartat)
- 2.8.5.4 Vergleich des AFMK-Umsatzes nach Zugabe von Glutamin bei leicht saurem und alkalischem pH
- 2.9 Qualitative Auswertung des AFMK-Umsatzes durch Hefen in Glutamin-Salzmedium bei pH 5,8 und 10,5
- 2.10 Produktanalysen
- 2.10.1 Extraktion
- 2.10.2 Dünnschichtchromatographie
- 2.10.3 Reelution
- 2.10.4 Photometrie
- 2.10.5 Fluorometrie
- 3. Ergebnisse
- 3.1 Umsatz von N¹-Acetyl-N²-formyl-5-methoxykynuramin (AFMK) zu N'-Acetyl-5-methoxykynuramin (AMK) in Hefezell-Suspensionen
- 3.1.1 Inkubationen in Gegenwart von Wasserstoffperoxid (H2O2) in verschiedenen Konzentrationen
- 3.1.2 Untersuchung der AFMK-Aufnahmekapazität der Hefezellen
- 3.1.3 Beladung der Zellen mit AFMK und anschließende Nachinkubation
- 3.1.4 Lyse der Hefezellen in hypotonem Medium (aq. dest.)
- 3.2 Bedingungen für den Umsatz von AFMK in Hefezell-Suspensionen
- 3.2.1 Bildung von AMK aus AFMK bei verlängerter Inkubation
- 3.2.2 Verlängerte Inkubation mit AFMK in Gegenwart von H2O2
- 3.2.3 Inkubation eines größeren Hefevolumens bei höherer Temperatur und Glucose-Konzentration
- 3.2.4 Weitere Verlängerung der Inkubationszeit und Untersuchung des Einflusses der Sauerstoffverfügbarkeit
- 3.3 Qualitative Analyse des entstandenen putativen AMK mittels photometrischer und fluorometrischer Messungen
- 3.3.1 Aufnahme eines Absorptionsspektrums des putativen AMK im Spektralphotometer
- 3.3.2 Fluorometrischer Nachweis von AMK durch Überführung in AMMC
- Untersuchung des Stoffwechsels von AFMK in Saccharomyces cerevisiae
- Einfluss von Wasserstoffperoxid (H2O2) und anderen Faktoren auf den AFMK-Umsatz
- Bestimmung der Aufnahmekapazität von AFMK durch Hefezellen
- Identifizierung der Produkte des AFMK-Umsatzes
- Bedeutung des kynurischen Melatonin-Metabolismus für die Hefe Saccharomyces cerevisiae
Zielsetzung und Themenschwerpunkte
Die vorliegende Hausarbeit beschäftigt sich mit dem kynurischen Melatonin-Metabolismus in einfachen Testsystemen, genauer gesagt mit dem Stoffwechsel des Melatonin-Metaboliten N¹-Acetyl-N²-formyl-5-methoxykynuramin (AFMK) in der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Ziel ist es, die Bedingungen und Mechanismen des AFMK-Umsatzes in Hefezellen zu untersuchen und Erkenntnisse über die mögliche Rolle des kynurischen Melatonin-Metabolismus in diesem Modellorganismus zu gewinnen.
Zusammenfassung der Kapitel
Die Einleitung stellt den kynurischen Melatonin-Metabolismus vor und erläutert die Bedeutung der Untersuchung des AFMK-Umsatzes in einfachen Testsystemen wie der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Das Kapitel "Material und Methoden" beschreibt detailliert die verwendeten Chemikalien, Materialien und Geräte sowie die Durchführung der einzelnen Experimente. Die Ergebnisse werden in Kapitel 3 präsentiert und diskutieren den Umsatz von AFMK in Hefezell-Suspensionen unter verschiedenen Bedingungen, die qualitative Analyse des entstandenen Produkts sowie die Untersuchung der Auswirkungen verschiedener Faktoren auf den AFMK-Umsatz.
Schlüsselwörter
Kynurischer Melatonin-Metabolismus, N¹-Acetyl-N²-formyl-5-methoxykynuramin (AFMK), Saccharomyces cerevisiae, Hefe, Stoffwechsel, Wasserstoffperoxid (H2O2), Aufnahmekapazität, Produktanalysen, photometrische und fluorometrische Messungen.
- Quote paper
- Mirko Krotzky (Author), 2007, Kynurischer Melatonin-Metabolismus in einfachen Testsystemen, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/86964
