Melatonin war seit seiner Entdeckung als Neurohormon immer wieder Gegenstand zahlreicher Untersuchungen in Bezug auf seine Funktion, Struktur und Wirkung. Während eine ursprüngliche Rolle in Pigmentierungseffekten der Haut gesehen wurde, zeigte sich eine weitaus bedeutsamere Funktion als Mediator der Information Dunkelheit. Die klassische Vorstellung, dass Melatonin lediglich als Hormon des Pinealorgans sowohl bei tag- als auch nachtaktiven Vertebraten circadiane Rhythmen mit ausgeprägten nächtlichen Gipfeln aufweist und als Chronobiotikum wirkt, erfuhr durch die Entdeckung extrapinealer Bildungsorte, z.B. in diversen Zellen und Organen wie der Retina, der Haut, des Gastrointestinaltrakts, den enterochromaffinen Zellen sowie der HARDERschen Drüse und Leukocyten, eine beträchtliche Erweiterung. Schließlich rechtfertigt die Entdeckung von Melatonin in Bakterien, Protozoen, Pflanzen, Pilzen und Invertebraten von ubiquitärem Vorkommen zu sprechen. Außer dem Weg der Deacetylierung wurden auch Wege der Demethylierung und der 2-Hydroxylierung beschrieben, jedoch wiesen Hirata et al. (1974) einen völlig anderen, lange Zeit vernachlässigten Abbauweg des Melatonins in Form der oxidativen Pyrrolringöffnung nach. Aus dieser Pyrrolringspaltung des Indolamins resultieren als Metabolite die zwei substituierten Kynuramine AFMK und dessen deformyliertes Folgeprodukt AMK.
Bereits in früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass Saccharomyces cerevisiae Melatonin produziert, von außen aufnimmt und verstoffwechselt; ebenso, dass exogen gegebene Vorstufen in Melatonin umgewandelt werden können. Ziel dieser Arbeit soll es nunmehr sein zu überprüfen, ob auch die substituierten Kynuramine von Hefe aufgenommen und weiter verstoffwechselt werden können. Die Untersuchung dieser Substanzen erscheint insofern sinnvoll, als AFMK aus Melatonin auch auf diversen nicht-enzymatischen Wegen – also organismenunabhängig – entsteht und somit auch in Hefen erscheinen sollte. Zu untersuchen wäre, ob auch die oben beschriebenen, kürzlich entdeckten Substanzen oder weitere, durch radikalische Reaktionen erzeugte AFMK-Metabolite von Saccharomyces gebildet werden. Da Hefezellen kaum Pigmente enthalten, liegt ein Vorteil darin, dass bei Auswertung der interessierenden Edukte und Produkte keine Überlagerung mit zelleigenen fluoreszenten oder anderweitig farbigen Verbindungen zu erwarten sein sollte. Außerdem lässt die hohe Stoffwechselaktivität diesen Organismus als besonders geeignet erscheinen.
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1. Einleitung
2. Material und Methoden
2.1 Chemikalien, Materialien und Geräte
2.1.1 Chemikalien
2.1.2 Materialien und Geräte
2.2 Herstellung der verwendeten Reagenzien und Medien
2.2.1 Herstellung des Hefe-Salzmediums (Grundmedium)
2.2.2 AFMK, AMK, AMMC und MQA
2.3 Herstellung der Hefe-Suspension
2.4 Umsatz von N 1-Acetyl- N 2-formyl-5-methoxykynuramin (AFMK)
zu N 1-Acetyl-5-methoxykynuramin (AMK)
2.4.1 Inkubationen in Gegenwart von Wasserstoffperoxid (H2O2)
in verschiedenen Konzentrationen
2.4.2 Inkubationen in Abwesenheit von Wasserstoffperoxid (H2O2)
und Untersuchung der AFMK-Aufnahmekapazität der Hefezellen
2.5 Intensitätsunterschiede in der AFMK-Umsatzrate durch H2O2-Zugabe
und veränderte Inkubationsbedingungen
2.5.1 Auswirkungen von H2O2-Zugabe auf die AFMK-Umsatzrate
2.5.2 Lyse der Hefezellen in hypotonem Medium (aq. dest.)
2.5.3 Inkubation eines größeren Hefevolumens bei höherer Temperatur
und Glucose-Konzentration
2.5.4 Weitere Verlängerung der Inkubationszeit und Untersuchung des Einflusses der Sauerstoffverfügbarkeit
2.6 Qualitative Analyse des entstandenen putativen AMK mittels
photometrischer und fluorometrischer Messungen
2.6.1 Aufnahme eines Absorptionsspektrums des entstandenen
putativen AMK im Spektralphotometer
2.6.2 Fluorometrischer Nachweis von AMK durch
Überführung in AMMC
2.7 Beeinflussung des AFMK- und AMK-Umsatzes durch Zugabe
verschiedener N-Quellen und hyperosmotischen Stress
2.7.1 Versuch des weiteren Umsatzes von aus AFMK entstandenem AMK
durch Hefen zu AMMC mittels Zugabe einer N-Quelle
2.7.2 Auswirkungen von hyperosmotischem Stress auf den AFMK-Umsatz
2.7.3 Auswirkungen verschiedener N-Quellen auf den AFMK-Umsatz
2.8 Quantitative Messung des AFMK-Umsatzes durch Hefezellen
mittels Photometrie
2.8.1 Aufnahme der Absorptionsspektren von AFMK und AMK
in Ethylacetat
2.8.2 Quantitative Messung des AFMK-Umsatzes in reinem Salzmedium
2.8.3 Quantitative Messung des AFMK-Umsatzes bei
hyperosmotischem Stress
2.8.4 Quantitative Messung des AFMK-Umsatzes nach Zugabe unterschiedlicher N-Quellen
2.8.5 Nähere Untersuchung der Ergebnisse aus 2.8.2 und 2.8.4 durch
weitere experimentelle Modifikationen
2.8.5.1 Vergleich des AFMK-Umsatzes in reinem Salzmedium
bei leicht saurem und alkalischem pH
2.8.5.2 Vergleich des AFMK-Umsatzes nach Zugabe von Arginin bzw. Guanidin bei leicht saurem und alkalischem pH
2.8.5.3 Vergleich des AFMK-Umsatzes nach Zugabe von Asparagin bzw. Asparaginsäure (Aspartat)
2.8.5.4 Vergleich des AFMK-Umsatzes nach Zugabe von Glutamin
bei leicht saurem und alkalischem pH
2.9 Qualitative Auswertung des AFMK-Umsatzes durch Hefen in
Glutamin-Salzmedium bei pH 5,8 und 10,5
2.10 Produktanalysen
2.10.1 Extraktion
2.10.2 Dünnschichtchromatographie
2.10.3 Reelution
2.10.4 Photometrie
2.10.5 Fluorometrie
3. Ergebnisse
3.1 Umsatz von N 1-Acetyl- N 2-formyl-5-methoxykynuramin (AFMK)
zu N 1-Acetyl-5-methoxykynuramin (AMK) in Hefezell-Suspensionen
3.1.1 Inkubationen in Gegenwart von Wasserstoffperoxid (H2O2)
in verschiedenen Konzentrationen
3.1.2 Untersuchung der AFMK-Aufnahmekapazität der Hefezellen
3.1.3 Beladung der Zellen mit AFMK und anschließende Nachinkubation
3.1.4 Lyse der Hefezellen in hypotonem Medium (aq. dest.)
3.2 Bedingungen für den Umsatz von AFMK in Hefezell-Suspensionen
3.2.1 Bildung von AMK aus AFMK bei verlängerter Inkubation
3.2.2 Verlängerte Inkubation mit AFMK in Gegenwart von H2O2
3.2.3 Inkubation eines größeren Hefevolumens bei höherer Temperatur
und Glucose-Konzentration
3.2.4 Weitere Verlängerung der Inkubationszeit und Untersuchung
des Einflusses der Sauerstoffverfügbarkeit
3.3 Qualitative Analyse des entstandenen putativen AMK mittels
photometrischer und fluorometrischer Messungen
3.3.1 Aufnahme eines Absorptionsspektrums des putativen AMK
im Spektralphotometer
3.3.2 Fluorometrischer Nachweis von AMK durch Überführung in AMMC
3.4 Beeinflussung des AFMK- und AMK-Umsatzes durch Zugabe
verschiedener N-Quellen und hyperosmotischen Stress
3.4.1 Prüfung auf Bildung von Metaboliten des AFMK in Hefezellen
unter dem Einfluss von Arginin als N-Quelle
3.4.2 Auswirkungen von hyperosmotischem Stress auf den AFMK-Umsatz
3.4.3 Auswirkungen verschiedener N-Quellen auf den AFMK-Umsatz
3.5 Quantitative Messung des AFMK-Umsatzes durch Hefezellen
mittels Photometrie
3.5.1 Absorptionsspektren von AFMK und AMK in Ethylacetat
3.5.2 Quantitative Messung des AFMK-Umsatzes in reinem Salzmedium
und bei hyperosmotischem Stress
3.5.3 Quantitative Messung des AFMK-Umsatzes nach Zugabe
unterschiedlicher N-Quellen
3.5.4 Vergleich des AFMK-Umsatzes in reinem Salzmedium
bei leicht saurem und alkalischem pH
3.5.5 Vergleich des AFMK-Umsatzes nach Zugabe von Arginin bzw.
Guanidin bei leicht saurem und alkalischem pH
3.5.6 Vergleich des AFMK-Umsatzes nach Zugabe von Asparagin bzw.
Asparaginsäure (Aspartat)
3.5.7 Vergleich des AFMK-Umsatzes nach Zugabe von Glutamin
bei leicht saurem und alkalischem pH
3.6 Qualitative Auswertung des AFMK-Umsatzes durch Hefen
in Glutamin-Salzmedium bei pH 5,8 und 10,5
4. Diskussion
5. Zusammenfassung
6. Literaturverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
1. Einleitung
Melatonin (Abb. 1) war seit seiner Entdeckung als Neurohormon immer wieder Gegenstand zahlreicher Untersuchungen in Bezug auf seine Funktion, Struktur und Wirkung. Während eine ursprüngliche Rolle in Pigmentierungseffekten der Haut gesehen wurde (Lerner et al., 1958, 1959), zeigte sich eine weitaus bedeutsamere Funktion als Mediator der Information Dunkelheit. Die klassische Vorstellung, dass Melatonin lediglich als Hormon des Pinealorgans sowohl bei tag- als auch nachtaktiven Vertebraten circadiane Rhythmen mit ausgeprägten nächtlichen Gipfeln aufweist und als Chronobiotikum wirkt (Arendt, 1985, 1986; Reiter, 1989, 1991 a,b, 1993; Binkley, 1993), erfuhr durch die Entdeckung extrapinealer Bildungsorte, z.B. in diversen Zellen und Organen wie der Retina, der Haut, des Gastrointestinaltrakts, den enterochromaffinen Zellen sowie der Harderschen Drüse und Leukocyten, eine beträchtliche Erweiterung (Zusf.: Pang und Allen, 1986; Huether et al., 1992; Huether, 1993; Hardeland und Rodríguez, 1995; Hardeland, 1996, 1997). Schließlich rechtfertigt die Entdeckung von Melatonin in Bakterien, Protozoen, Pflanzen, Pilzen und Invertebraten (Zusf.: Balzer und Hardeland, 1995, 1996; Hardeland und Fuhrberg, 1996; Hardeland et al., 1996a; Hardeland, 1999; Reiter et al., 2001; Hardeland und Poeggeler, 2003) von ubiquitärem Vorkommen zu sprechen. Im Wirbeltierkörper wird Melatonin nicht nur an diversen Orten gebildet, sondern vermag aufgrund seiner Amphiphilie aus der Zirkulation in alle Organe einzutreten und durch subzellulare Kompartimente zu permeieren (Poeggeler et al., 2002). Diese Eigenschaft beruht auf dem Besitz einer O -Methyl- und einer N -Acetylgruppe. Wie neuere Untersuchungen zeigten, sind diese beiden funktionellen Gruppen zudem für die antioxidative Wirkung und weitere biologisch relevante Eigenschaften wie immunmodulierende und neuro-endokrine Aktivitäten von Bedeutung (Poeggeler et al., 2002; Poeggeler, 2005; Pandi-Perumal et al., 2006).
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb. 1: Struktur von Melatonin
Nicht immer ist Melatonin ausschließlich mit Dunkelheit assoziiert, wie diverse, teils markante Beispiele bei Wirbeltieren, aber auch außerhalb der Vertebraten belegen (Zusf.: Hardeland und Fuhrberg, 1996; Hardeland et al., 1996a; Hardeland und Poeggeler, 2003), wobei neben arrhythmischen auch diurnal erhöhte Melatonin-Spiegel gefunden wurden.
Ein prominentes Exempel für Abweichungen von der Beziehung zur Dunkelheit lieferte der in dieser Arbeit untersuchte Organismus Saccharomyces cerevisiae. In ersten Studien zum Melatonin-Vorkommen in Pilzen wurden hohe intrazelluläre Konzentrationen dieses Indolamins gemessen, jedoch keine Unterschiede zwischen Tages- und Nachtphase festgestellt. Vielmehr beeinflussten sowohl Wachstumsbedingungen, denen die Hefen ausgesetzt waren, als auch die Verfügbarkeit von Tryptophan und hiervon abgeleiteten Vorstufen die Konzentration von Melatonin (Fuhrberg et al., 1996; Fuhrberg, 1997; Sprenger et al., 1997, 1999). Die Abwesenheit einer circadianen Rhythmik wurde schließlich mit dem Fehlen der für photische Signale erforderlichen C- und N-terminalen Kontrollregionen der Arylalkylamin- N -acetyltransferase von Saccharomyces cerevisiae erklärt (Ganguly et al., 2001).
Während das Hauptaugenmerk der meisten Arbeiten zum Melatonin-Stoffwechsel dem klassischen Abbauweg über die Bildung von 6-Hydroxymelatonin in der Leber mit nachfolgender Sulfat-Konjugation zum Zwecke der renalen Eliminierung galt, musste nach neueren Befunden berücksichtigt werden, dass die Mengen des Neurohormons im Gastrointestinaltrakt um mehr als zwei Zehnerpotenzen höher liegen als im Pinealorgan (Huether, 1993; Bubenik et al., 1999). Somit war es sehr wahrscheinlich, dass ein Großteil dieses Melatonins erst gar nicht in die Zirkulation übertritt und infolgedessen nicht in der Leber zwecks nachfolgender Ausscheidung hydroxiliert wird. Ein im Gehirn und im Pinealorgan, aber auch in weiteren Organen identifizierter Abbauweg führt über die Deacetylierung des Melatonins zum 5-Methoxytryptamin (5-MT) und zu dessen möglichen Folgeprodukten 5-Methoxyindol-3-acetyldehyd, 5-Methoxyindol-3-essigsäure und 5-Methoxytryptophol (5-ML) (Hardeland et al., 1993, 1996b).
Ein wichtiger Hinweis für die Beziehung zwischen Melatonin und 5-MT wurde ebenfalls bei Saccharomyces cerevisiae gefunden. Beide Substanzen konnten ebenso wie 5-ML in den Hefen nachgewiesen werden, waren allerdings – wie oben erwähnt – abhängig von der Verfügbarkeit geeigneter Substrate (Fuhrberg et al., 1996; Fuhrberg, 1997; Sprenger et al., 1997, 1999; Sprenger und Hardeland, 1999). Anhand solcher Resultate konnte eine ausführliche Darstellung dieses indolischen Melatonin-Metabolismus einschließlich der Nebenwege, die zu denselben Produkten führen, erreicht werden (Hardeland, 2005).
Außer dem Weg der Deacetylierung wurden auch Wege der Demethylierung und der 2-Hydroxylierung beschrieben, jedoch wiesen Hirata et al. (1974) einen völlig anderen, lange Zeit vernachlässigten Abbauweg des Melatonins in Form der oxidativen Pyrrolringöffnung nach. Aus dieser Pyrrolringspaltung des Indolamins resultieren als Metabolite die zwei substituierten Kynuramine N 1-Acetyl- N 2-formyl-5-methoxykynuramin (AFMK) und dessen deformyliertes Folgeprodukt N 1-Acetyl-5-methoxykynuramin (AMK) (Abb. 2).
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb. 2: Strukturen der Kynuramine AFMK und AMK
Aufgrund ihrer zahlreichen biologischen Aktivitäten stellen Kynuramine eine eigene, bemerkenswerte Klasse von biogenen Aminen dar (Zusf.: Balzer und Hardeland, 1989; Hardeland und Fuhrberg, 1994; Tan et al., 2001). Erstmals offenkundig wurde der kynurische Abbau des Melatonins, als nach Injektion von Melatonin in die Cisterna magna (= Cisterna cerebellomedullaris) die Kynuramine AFMK und vor allem AMK als Hauptmetabolite im Zentralnervensystem auftraten (Hirata et al., 1974). Wie erst vor kurzem gefunden wurde, unterliegen etwa 30% des gesamten Melatonin-Abbaus im Körper der Pyrrolringspaltung (Ferry et al., 2005), wodurch sich die quantitative Bedeutsamkeit dieses kynurischen Stoffwechselweges offenbart.
AFMK vermag durch zahlreiche Reaktionsmechanismen aus Melatonin bzw. dessen Intermediat, dem cyclischen 3-Hydroxymelatonin (c3OHM), hervorzugehen. Zu erwähnen sind neben enzymatischen und pseudoenzymatischen auch diverse photokatalytische oder radikalische Mechanismen (Abb. 3).
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb. 3: Enzymatische und nichtenzymatische Reaktionswege der
AFMK-Bildung aus Melatonin
(nach Tan et al., 2001; Hardeland, 2005)
Der Befund dieser zahlreichen Möglichkeiten der AFMK-Entstehung aus Melatonin erscheint umso beachtenswerter, als aus Strukturanaloga dieses Indolamins wie bspw. 5-MT, N -Acetylserotonin und Tryptamin in größerer Quantität verschiedene Produkte hervorgehen (Hardeland, 2005). Der kynurische Weg über die bevorzugte Bildung von AFMK wurde vor allem auch bei radikalischen Reaktionen mit Melatonin beobachtet, was im Kontext mit dessen antioxidativer Protektion steht.
Eine Übersicht der unterschiedlichen chemischen Reaktionen, die allesamt zur Bildung von AFMK aus Melatonin führen, liefert Tab. 1.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Tab. 1: Diverse chemische Reaktionen führen zur Bildung von AFMK aus Melatonin
(nach Hardeland, 2005)
Biologische Wirkungen von AFMK wurden zwar beschrieben, jedoch meist mit dem Hintergrund gesehen, dass AFMK als Metabolit des Melatonins für gewisse Effekte verantwortlich zeichnen könnte, die ursprünglich dem Hormon selbst zugeschrieben wurden, so z.B. Auswirkungen auf die Reproduktion oder circadiane Rhythmik, wohingegen sich neuere Untersuchungen auf protektive Eigenschaften des AFMK konzentrieren (Hardeland, 2006). Dennoch ist die physiologische Rolle des AFMK in Organismen weitgehend unbekannt. In neueren Studien konnte gezeigt werden, dass AFMK mit Hydroxylradikalen interagiert und daher DNA-Schäden durch Oxidation (Burkhardt et al., 2001) bzw. direkter Lipid-Oxidation (Tan et al., 2001) entgegenwirkt. Bei kultivierten Neuronen des Hippocampus wurde eine antagonistische Wirkung des AFMK sowohl gegenüber Excitotoxizität durch Glutamat und H2O2 als auch gegenüber Oxidotoxizität durch Amyloid-β25-35 nachgewiesen (Tan et al., 2001). Nach Untersuchungen an Ratten konnte durch AFMK eine Beschleunigung der Resynchronisation des Melatonin-Rhythmus festgestellt werden (Kennaway et al., 1989). Obwohl Interaktionen von AFMK mit den hoch reaktiven Hydroxylradikalen beschrieben wurden, erwies es sich gegenüber anderen Oxidantien als eher mäßig reaktiv, was durch seine Präferenz zu Zwei-Elektronen-Transferreaktionen (Tan et al., 2001; Hardeland, 2005) erklärt werden kann. AFMK erscheint daher gegenüber seinem deformylierten Folgemetaboliten AMK, welcher in der Lage ist, einzelne Elektronen zu übertragen, als relativ inert (Ressmeyer et al., 2003).
Anfangs wurde die Deformylierung von AFMK zu AMK auf die Wirkung einer relativ unspezifischen, aber weit verbreiteten Arylamin-Formamidase (früher auch Kynurenin-Formamidase) zurückgeführt (Hardeland et al., 1993, 2003, 2004). Später konnte eine weitere Möglichkeit der AMK-Bildung aus AFMK auch über Hämoperoxidase durch Dehydrierung zum Imid, Hydratisierung zum Carbamat und dessen anschließendem Zerfall nachgewiesen werden (Tan et al., 2000). Für diese Arbeit ist der beschriebene Stoffwechselweg über Hämoperoxidase insofern von Interesse, als er bei erhöhten H2O2-Konzentrationen und dem daraus resultierenden, höheren oxidativen Stress begünstigt sein könnte; nähere Untersuchungen im Zusammenhang mit Saccharomyces cerevisiae erscheinen daher lohnenswert.
Obgleich weitergehende Studien über die Eigenschaften von AMK und dessen Funktion als protektivem Agens oder Signalsubstanz bisher fehlen, kann davon ausgegangen werden, dass dieses Kynuramin einen Stoff mit pharmakologischem Potenzial darstellt. So wird bspw. die Expression von Cyclooxygenase 2 in Makrophagen durch AMK herabreguliert (Mayo et al., 2005), und als Cyclooxygenasehemmer wurde für AMK eine vielfach höhere Effizienz als für den klassischen Inhibitor Acetylsalicylsäure nachgewiesen (Kelly et al., 1984). AMK und auch seine Vorstufe Melatonin vermögen ferner den mitochondrialen Elektronentransport zu modulieren, Effekte von potenzieller Bedeutung, da die Atmungskette eine Hauptquelle freier Radikale in der Zelle bzw. im Organismus darstellt und Mitochondrien in die Auslösung von Apoptose eingeschaltet sind. Aufgrund dessen sind Mitochondrien sowohl durch oxidativen Stress als auch durch daraus resultierende Zellschädigungen primär betroffen. Die bereits oben erwähnte Amphiphilie von Melatonin und seinem Folgemetaboliten AMK wird ebenso wie die Befähigung zu Ein-Elektronen-Transferreaktionen als Grundlage für beobachtete Steigerungen des mitochondrialen Elektronentransports sowie die Begünstigung des Energie- und Sauerstoffmetabolismus vermutet (Hardeland et al., 2003). Schließlich konnte diesbezüglich für AMK sogar eine höhere Effizienz im Vergleich zu Melatonin nachgewiesen werden (Acuña-Castroviejo et al., 2003).
Bis vor kurzem bestand die Annahme, dass der kynurische Stoffwechselweg mit AMK sein Ende findet, da dieses nach Injektion von Melatonin als „Endprodukt“ über den Urin ausgeschieden wurde (Hirata et al., 1974). Aufgrund der gezeigten, hohen Reaktivität von AMK (Ressmeyer et al., 2003) wurden jedoch drei Folgemetabolite nach Exposition von AMK auf DC-Platten unter Lichtausschluss gefunden, deren Bildung auch unter physiologischen Bedingungen sehr wahrscheinlich erscheint (Guenther et al., 2005): das durch Nitrosierung entstehende Cinnolinon 3-Acetamidomethyl-6-methoxycinnolinon (AMMC), das durch Nitrierung gebildete N 1-Acetyl-5-methoxy-3-nitrokynuramin (AMNK) und das Chinazolin N -[2-(6-Methoxychinazolin-4-yl)-ethyl]-acetamid (MQA) (Abb. 4).
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb. 4: Strukturen des Cinnolinons AMMC,
des Nitrokynuramins AMNK und des Chinazolins MQA
Bereits in früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass Saccharomyces cerevisiae Melatonin produziert, von außen aufnimmt und verstoffwechselt; ebenso, dass exogen gegebene Vorstufen in Melatonin umgewandelt werden können (Fuhrberg et al., 1996; Fuhrberg, 1997; Hardeland, 1999; Sprenger et al., 1997, 1999). Ziel dieser Arbeit soll es nunmehr sein zu überprüfen, ob auch die substituierten Kynuramine von Hefe aufgenommen und weiter verstoffwechselt werden können. Die Untersuchung dieser Substanzen erscheint insofern sinnvoll, als AFMK aus Melatonin auch auf diversen nicht-enzymatischen Wegen – also organismenunabhängig – entsteht und somit auch in Hefen erscheinen sollte. Zu untersuchen wäre, ob auch die oben beschriebenen, kürzlich entdeckten Substanzen oder weitere, durch radikalische Reaktionen erzeugte AFMK-Metabolite von Saccharomyces gebildet werden. Da Hefezellen kaum Pigmente enthalten, liegt ein Vorteil dieses Organismus darin, dass bei Auswertung der interessierenden Edukte und Produkte keine Überlagerung mit zelleigenen fluoreszenten oder anderweitig farbigen Verbindungen zu erwarten sein sollte. Außerdem lässt die hohe Stoffwechselaktivität von Hefen diesen Organismus als besonders geeignet erscheinen.
2. Material und Methoden
2.1 Chemikalien, Materialien und Geräte
2.1.1 Chemikalien
Die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Kynuramine N 1-Acetyl- N 2-formyl-5-methoxykynuramin (AFMK) und N 1-Acetyl-5-methoxykynuramin (AMK) wurden von der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. Hartmut Laatsch (Institut für Organische und Biomolekulare Chemie, Georg-August-Universität Göttingen) nach Kennaway et al. (1988) synthetisiert und zur Verfügung gestellt. Das 3-Acetamidomethyl-6-methoxycinnolinon (AMMC) wurde ebenso wie das N -[2-(6-Methoxyquinazolin-4-yl)-ethyl]-acetamid (MQA) von Frau Sonja I. Schmidt in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. Hartmut Laatsch hergestellt.
Die Chemikalien entstammten nachfolgenden Bezugsquellen:
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Alle weiteren Substanzen wurden von Merck, Darmstadt, Deutschland bezogen.
2.1.2 Materialien und Geräte
Folgende Materialien und Geräte wurden im Rahmen dieser Arbeit verwendet:
- Dünnschichtchromatographie-Aluminiumfolien, 20 x 20 cm, Kieselgel 60 F254, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
- Einmalplastikküvetten, Plastibrand, PS, 2,5 mL makro und 1,5 mL halbmikro, Brand GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland
- Exsikkator, Glaswerk Wertheim, Wertheim, Deutschland
- Feinwaage, Typ 2404, Sartorius AG, Göttingen, Deutschland
- Feinwaage, Typ BP 110, Sartorius AG, Göttingen, Deutschland
- Feinwaage, Typ 310-9214/C PJ 60 A, PAG Oerlikon AG, Zürich, Schweiz
- Fluoreszenzküvetten, QS 1000 Suprasil, 2,5 mL makro und 1 mL halbmikro, Hellma GmbH & Co. KG, Müllheim, Deutschland
- Glasküvetten, OG 6040, 1,5 mL halbmikro, Hellma GmbH & Co. KG, Müllheim, Deutschland
- Kalt-/Warmluftgebläse, Typ clima 19 TL, ewt, Elektronik-Wärme-Technik, Nürnberg, Deutschland
- Kristallisationsschalen, mit Ausguss, Durchmesser 50 mm, Höhe 30 mm, Volumen 40 mL, Schott Duran, Mainz, Deutschland
- Magnetrührer ohne eingebaute Heizplatte, Typ Combimag REO, IKA Labortechnik, Janke & Kunkel, Staufen, Deutschland
- Magnetrührer mit eingebauter Heizplatte, Typ Combimag RCT, IKA Labortechnik, Janke & Kunkel, Staufen, Deutschland
- Phasenkontrastmikroskop, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Deutschland
- pH-Meter, digital, Typ 643, Knick Elektronische Messgeräte GmbH & Co. KG, Berlin, Deutschland
- PP-Test tubes, 50 mL, Cellstar, greiner bio-one, Frickenhausen, Deutschland
- Quarzküvetten, QS 110/114 Suprasil, 3,5 mL makro und 1,4 mL halbmikro, Hellma, Müllheim, Deutschland
- Rotationsverdampfer, Dagleff Patz KG, Wankendorf, Deutschland
- Safe-Lock Tubes, farblos, 1,5 mL und 2,0 mL, Eppendorf Tubes, Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland
- Schüttler, Typ 3016, Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel, Deutschland
- Simultan-Trennkammer mit Knopfdeckel, 200 x 200 mm, Desaga GmbH, Heidelberg, Deutschland
- Spektralphotofluorometer, Nr. JA-8965-E, mit ellipsoidalem Kondensationssystem, Ratio Photometer, Aminco Bowman, Silver Spring, Maryland, USA
- Spektralphotometer PM 7 inkl. Temperierung durch Wasserbad, Modell 2209 Multitemp, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Deutschland
- Spektralphotometer Shimadzu, UV-mini 1240, UV-VIS Spectrophotometer, Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg, Deutschland
- UV-Lampe mit Röhren der Emissionswellenlängen 254 nm und 366 nm, Desaga GmbH, Heidelberg, Deutschland
- Vortexer, Model G-560E, Vortex-Genie 2, Scientific Industries, Bohemia, N.Y., USA
- Vortexer, VF 2, IKA Labortechnik, Janke & Kunkel, Staufen, Deutschland
- Schüttelwasserbad, Typ 1083, Gesellschaft für Labortechnik mbH & Co., Hannover-Vinnhorst, Deutschland
- Zentrifuge, Eppendorf-Laborfuge 5417 C, Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland
- Zentrifuge, Hettich EBA 3S, Typ 2006, Hettich GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Deutschland
2.2 Herstellung der verwendeten Reagenzien und Medien
2.2.1 Herstellung des Hefe-Salzmediums (Grundmedium)
Zur Herstellung des Hefe-Salzmediums wurden di-Natriumhydrogenphosphat-2-hydrat (Na2HPO4) in der Endkonzentration 50 mM sowie 0,5% Natriumchlorid (NaCl) in destilliertem Wasser gelöst und mit 1 M Citronensäure auf einen pH-Wert von 5,8 eingestellt; Gesamtvolumen 250 mL. Das Medium wurde für die Dauer von maximal einer Woche in der Kühlkammer aufbewahrt.
2.2.2 AFMK, AMK, AMMC und MQA
Ethanolische Stammlösungen von AFMK und AMK mit einer Konzentration von 20 mM wurden in Szintillationsröhrchen im Kühlschrank aufbewahrt und durch Aluminiumfolie vor Licht geschützt.
AMMC und MQA wurden als Referenzsubstanzen in ethanolischer Lösung für die DC zur Verfügung gestellt. Sie wurden ebenfalls im Kühlschrank aufbewahrt und durch Aluminiumfolie abgeschirmt.
2.3 Herstellung der Hefe-Suspension
Für die Experimente wurde kommerziell erhältliche Hefe, Marke Wieninger Hefe der Fa. F.X. Wieninger Hefefabrik, Passau, Deutschland, Frischgewicht 42 g, verwendet.
Aus den frischen Hefezellen wurde mit dem zuvor angesetzten Hefe-Salzmedium im kleinen Erlenmeyerkolben unter vorsichtigem Durchmengen eine homogene Suspension hergestellt, so dass keine Zellaggregate mehr vorlagen.
2.4 Umsatz von N1-Acetyl-N2-formyl-5-methoxykynuramin (AFMK) zu
N1-Acetyl-5-methoxykynuramin (AMK)
Ziel dieser Versuchsreihe war neben dem nachweisbaren Umsatz von AFMK zu AMK durch die Hefe Saccharomyces cerevisiae die Optimierung der zugrunde liegenden Versuchsbedingungen, weshalb von Experiment zu Experiment Modifikationen vorgenommen und deren Auswirkungen festgestellt wurden. Die bislang bekannten Reaktionswege sind in Abb. 5 dargestellt, mit Ausnahme eines in dieser Arbeit irrelevanten photochemischen Prozesses.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb. 5: Umsatz von AFMK zu AMK
(nach Hardeland, 2005)
2.4.1 Inkubationen in Gegenwart von Wasserstoffperoxid (H2O2) in verschiedenen Konzentrationen
Da eine der Möglichkeiten der AMK-Bildung in einer Hämoperoxidase-Reaktion besteht, könnte eine Zugabe geringer Mengen an H2O2 die Deformylierung von AFMK stimulieren.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Die Hefe wurde im Salzmedium unter behutsamem Durchmengen auf dem Magnetrührer zur homogenen Suspension gebracht. Danach erfolgten unter stetigem Rühren zunächst die Zugabe von H2O2 und sodann die Zugabe von AFMK. Der Reaktionsansatz wurde luftdicht verschlossen und im dunklen Schüttelwasserbad für 2 Stunden bei 30°C unter langsamem Schütteln inkubiert. Im Anschluss wurde die Suspension für 10 Minuten bei max. Drehzahl (5.200 rpm) in der Tischzentrifuge abzentrifugiert. 8 mL des Überstands wurden vorsichtig ohne Verschleppen von Zellen abgenommen und mit dem 4-fachen Volumen an Ethylacetat (32 mL) extrahiert (s. 2.10.1). Der Rest des Überstands wurde verworfen; das Zellpellet wurde zweimal mit 8 mL Grundmedium gründlich gewaschen und jeweils für 10 Minuten bei 5.200 rpm abzentrifugiert. Die Überstände wurden vorsichtig mittels Pasteurpipetten abgenommen und verworfen, das Zellpellet in 1,5 mL Grundmedium resuspendiert und mit dem 4-fachen Volumen an Ethylacetat (8 mL) extrahiert. Nach Abwarten der Phasentrennung wurden die organischen Phasen im gleichen Verhältnis abgenommen, in Kristallisationsschälchen im Exsikkator auf jeweils 0,75 mL eingeengt und anschließend für 5 Minuten bei 14.000 rpm abzentrifugiert, um evtl. Wasserrückstände abzutrennen bzw. Zellreste zu sedimentieren. Bei der nachfolgenden aufsteigenden Dünnschichtchromatographie (s.u. 2.10.2) wurde das Laufmittel Ethylacetat/Methanol (9:1) verwendet. Auswertung und Identifikation von Edukt und Produkten erfolgten unter UV-Licht bei den Wellenlängen 366 bzw. 254 nm.
Variante a:
In Abweichung vom oben beschriebenem Reaktionsansatz wurden die folgenden zwei Modifikationen vorgenommen und parallel bearbeitet. Im ersten Ansatz wurde die Ausgangskonzentration von H2O2 auf 0,05% (Endkonzentration 0,005%) erhöht. Im zweiten Ansatz wurde das H2O2 durch das äquivalente Volumen an Grundmedium ersetzt, um die Ergebnisse in Gegenwart und in Abwesenheit von H2O2 in der anschließenden DC vergleichen zu können. Lediglich die Zellen wurden nach dem zweimaligen Waschen mit Grundmedium extrahiert.
Variante b:
Gemäß dem beschriebenen Reaktionsansatz wurden zwei Ansätze parallel inkubiert, in denen die Ausgangskonzentrationen von H2O2 auf 0,5% (Endkonzentration 0,05%) bzw. 5% (Endkonzentration 0,5%) erhöht wurden, um die Grenzen der Verträglichkeit der Hefezellen zu testen und ggf. neue Produkte identifizieren zu können. Wiederum wurden nur die Zellen nach zweimaliger Waschung extrahiert.
2.4.2 Inkubationen in Abwesenheit von Wasserstoffperoxid (H2O2) und Untersuchung der AFMK-Aufnahmekapazität der Hefezellen
Mittels Inkubationen der Hefezellen über unterschiedliche Zeiträume sollte herausgefunden werden, wie schnell die Hefen in der Lage sind, AFMK in die Zellen aufzunehmen, zu speichern, umzusetzen oder ggf. wieder auszuscheiden.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Zwei Hefesuspensionen wurden wie oben beschrieben hergestellt, wobei der erste Ansatz für 15 Minuten und der zweite Ansatz für 30 Minuten inkubiert wurde. Lediglich die Zellen aus beiden Inkubationen wurden für die Weiterverarbeitung verwendet, die Überstände hingegen verworfen. Die Vorgehensweise bis zur Produktanalyse entsprach in allen übrigen Punkten der unter 2.4.1 beschriebenen Methode für den Reaktionsansatz.
Beladung der Zellen mit AFMK und anschließende Nachinkubation:
Wie im oben beschriebenen Reaktionsansatz wurden zwei Hefesuspensionen angesetzt und für 1 Stunde inkubiert. Nach Abzentrifugation wurden beide Zellpellets zweimal mit je 8 mL Grundmedium gewaschen, um möglichst alle AFMK-Rückstände im Außenmedium zu eliminieren. Die Zellen aus Ansatz 1 wurden direkt extrahiert, die Zellen aus Ansatz 2 mit 9,5 mL Hefe-Salzmedium für 2 Stunden nachinkubiert. Der Überstand der Nachinkubation wurde extrahiert, um aus den Zellen entlassene Substanzen zu identifizieren. Das Zellpellet wurde erneut zweimal mit je 8 mL Grundmedium gewaschen und ebenfalls extrahiert. Ansatz 1 wurde später gestartet, so dass eine zeitgleiche Extraktion aller Proben und deren weitere Verarbeitung möglich waren. Die übrige Vorgehensweise bis zur Produktanalyse entsprach der unter 2.4.1 beschriebenen Methode.
Variante a:
Wiederholung des vorhergehenden Versuchs unter Zugabe von D(+)-Glucose-Monohydrat (nachstehend „Glucose“) 11,76 mM als C-Quelle in 8,5 mL Hefe-Salzmedium (Endkonzentration 10 mM). Die Nachinkubation erfolgte unter Zugabe von Glucose 10,53 mM in 9,5 mL Hefe-Salzmedium (Endkonzentration 10 mM).
Variante b:
Wiederholung des Reaktionsansatzes aus Variante a. Statt AFMK wurde jedoch 1,0 mL AMK 2 mM in 10% Ethanol und 90% Hefe-Salzmedium (Endkonzentration 0,2 mM) zugegeben, um mögliche Reaktionen der Hefezellen mit diesem deformylierten Kynuramin zu testen.
Variante c:
Erneute Wiederholung des Reaktionsansatzes aus Variante a. Jedoch wurde diesmal der Zeitraum der Erstinkubation von 1 Stunde auf 16 Stunden erhöht, um den Hefen mehr Gelegenheit zu geben, das AFMK aufzunehmen bzw. zu verstoffwechseln.
2.5 Intensitätsunterschiede in der AFMK-Umsatzrate durch H2O2-Zugabe und veränderte Inkubationsbedingungen
Ziel dieser Versuchsreihe war es, durch die Zugabe von H2O2 sowie veränderte Bedingungen während der Inkubationen Auswirkungen auf die AFMK-Umsatzrate festzustellen und diese anhand der gewonnenen Erkenntnisse zu optimieren.
2.5.1 Auswirkungen von H2O2-Zugabe auf die AFMK-Umsatzrate
Um die Wirkung von H2O2 auf die Umsatzrate des AFMK zu untersuchen, wurde der Reaktionsansatz aus Variante c des vorhergehenden Experiments ohne Nachinkubation aber unter Zugabe von verhältnismäßig hoch konzentriertem H2O2 wiederholt.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Beide Reaktionsansätze wurden über einen Zeitraum von 16 Stunden inkubiert. Die übrige Vorgehensweise bis zur Produktanalyse entsprach der unter 2.4.1 beschriebenen Methode für den Reaktionsansatz.
2.5.2 Lyse der Hefezellen in hypotonem Medium (aq. dest.)
Um zu prüfen, ob die Intaktheit der Hefezellen den AFMK-Umsatz limitiert, wurden die Zellen in aq. dest. lysiert und anschließend mit AFMK inkubiert.
Die Hefe wurde in aq. dest. unter Durchmengen auf dem Magnetrührer zur homogenen Suspension gebracht. Nach einer Einwirkzeit von 1 Stunde, während der die Suspension regelmäßig geschwenkt wurde, um eine Sedimentierung der Zellen zu vermeiden, erfolgte unter stetigem Rühren die Zugabe von AFMK. Der Reaktionsansatz wurde luftdicht verschlossen und im dunklen Schüttelwasserbad für 2 Stunden bei 30°C unter langsamem Schütteln inkubiert. Im Anschluss wurde die Suspension mit dem 4-fachen Volumen an Ethylacetat (40 mL) extrahiert. Die weitere Vorgehensweise bis zur Produktanalyse entsprach der unter 2.4.1 beschriebenen Methode für den Reaktionsansatz.
2.5.3 Inkubation eines größeren Hefevolumens bei höherer Temperatur und Glucose-Konzentration
Ergänzend zur verlängerten Inkubationszeit von 16 Stunden wurde nun zusätzlich die Temperatur während der Inkubation von 30°C auf 40°C angehoben sowie die Konzentration der Glucose im Hefe-Salzmedium von 10 mM auf 20 mM Endkonzentration erhöht. Des Weiteren wurde mit dem 4-fachen Hefevolumen inkubiert, um den Umsatz des AFMK zu steigern bzw. zu beschleunigen.
Bis zur Produktanalyse wurde methodisch wie mit dem unter 2.4.1 beschriebenen Reaktionsansatz verfahren, lediglich bei den entnommenen Volumina wurde das größere Hefevolumen berücksichtigt. Nach Zentrifugation wurden nun 7 mL des Überstands entnommen und mit dem 4-fachen Volumen an Ethylacetat (28 mL) extrahiert. Das Zellpellet wurde nach zweimaliger Waschung mit 3 mL Grundmedium resuspendiert und ebenfalls mit dem 4-fachen Volumen an Ethylacetat (20 mL) extrahiert.
2.5.4 Weitere Verlängerung der Inkubationszeit und Untersuchung des Einflusses der Sauerstoffverfügbarkeit
Für diesen Ansatz wurde die Inkubationszeit von 16 Stunden auf 45 Stunden heraufgesetzt, um Auswirkungen auf den AFMK-Umsatz festzustellen und eine evtl. weitergehende Verstoffwechselung zu erreichen. Mit demselben Hintergrund wurde eine Inkubation unter aeroben Bedingungen durchgeführt (Zutritt von Luft durch Wattestopfen), die andere unter Begrenzung der Sauerstoffzufuhr zur Begünstigung der Gärung (Verschluss durch Silikonstopfen). Der Reaktionsansatz und das methodische Vorgehen bis zur Produktanalyse entsprachen dem des vorangegangenen Experiments.
2.6 Qualitative Analyse des entstandenen putativen AMK mittels photometrischer und fluorometrischer Messungen
2.6.1 Aufnahme eines Absorptionsspektrums des entstandenen putativen AMK im Spektralphotometer
Eine weitere Hefesuspension wurde gemäß dem unter 2.5.3 beschriebenen zweiten Reaktionsansatz inkubiert, da hier die bisher größte Umsatzrate von AFMK zu putativem AMK beobachtet wurde. Zumal der Großteil des entstandenen putativen AMK im Medium zu finden war, wurden nach 45-stündiger Inkubation aus der abzentrifugierten Suspension lediglich 7 mL des Überstands mit dem 4-fachen Volumen an Ethylacetat (28 mL) extrahiert. Die organischen Phasen wurden im Exsikkator auf jeweils 0,75 mL eingeengt und anschließend für 5 Minuten bei 14.000 rpm abzentrifugiert, um evtl. Wasserrückstände abzutrennen. Bei der nachfolgenden aufsteigenden Dünnschichtchromatographie wurde das Laufmittel Ethylacetat/Methanol (9:1) verwendet. Die Identifikation der AMK-TL-Bande erfolgte aufgrund besserer Erkennbarkeit unter UV-Licht bei 366 nm und wurde anschließend in 28 mL Ethylacetat reeluiert. Nach dieser Elution, Einengung auf 0,75 mL und 5-minütiger Zentrifugation bei 14.000 rpm erfolgte eine zweidimensionale DC in Ethylacetat/Methanol (9:1). Der entstandene gereinigte AMK-Spot wurde unter UV-Licht bei 366 nm identifiziert, in 3 mL Ethanol reeluiert und bei 14.000 rpm abzentrifugiert. Das Absorptionsspektrum von 2,5 mL putativem AMK in Ethanol wurde in 3,5 mL Quarzküvetten im Bereich von 290 nm bis 540 nm photometrisch gegen 2,5 mL Ethanol aufgenommen.
2.6.2 Fluorometrischer Nachweis von AMK durch Überführung in AMMC
Dieses Experiment diente dem Versuch, das putative AMK nach dem AFMK-Umsatz mit Hefezellen in AMMC zu überführen. Die bislang bekannten Reaktionswege sind in Abb. 6 dargestellt. Der Umsatz erfolgte mit PAPA-NONOat unter gleichzeitiger Messung der Fluoreszenzaktivität des entstehenden AMMC.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb. 6: Umsatz von AMK zu AMMC
(nach Hardeland et al., 2007)
Die Struktur von PAPA-NONOat ist in Abb. 7 dargestellt. Bei dieser Substanz handelt es sich um einen NO-Donor, der spontan pH-abhängig nach einer Reaktion der 1. Ordnung dissoziiert und 2 Moleküle NO freisetzt, wobei in Folge das AMK durch Nitrosierung zu AMMC umgesetzt wird. Bei Guenther et al. (2005) hatte sich für Studien in wässriger Lösung PAPA-NONOat bei pH 7,4 als am geeignetsten erwiesen.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb. 7: Struktur des NO-Donors PAPA-NONOat
Zur Gewinnung der nötigen Menge an AMK wurden vier identische Ansätze nach der unter 2.6.1 beschrieben Methode verarbeitet. Anschließend wurde das in 3 mL Ethanol reeluierte putative AMK vor der Fluorometrie im Exsikkator auf 0,5 mL eingeengt.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Der Reaktionsverlauf wurde bei Excitation 366 nm und Emission 404 nm gemessen. Der Reaktionsstart wurde durch die Zugabe von PAPA-NONOat initiiert und über die Dauer von 70 Minuten im Fluorometer verfolgt.
[...]
- Arbeit zitieren
- Mirko Krotzky (Autor:in), 2007, Kynurischer Melatonin-Metabolismus in einfachen Testsystemen, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/86964
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