In diesem Versuch soll die 16S-rDNA des stickstofffixierenden Endosymbionten
Sinorhizobium meliloti zunächst mit Hilfe einer PCR amplifiziert und anschließend mit Hilfe von Transformation in E.coli kloniert werden.
Dazu wird zuerst die gesamte DNA der Bakterien in einem Schnellverfahren isoliert und
anschließend für die PCR eingesetzt. Diese ist in der Lage, auch aus einem komplexen DNAGemisch eine bestimmte Gensequenz zu amplifizieren, wichtig sind hierfür jedoch u.a. die richtige Wahl der Annealing-Temperatur und der Primer. Da es sich bei der 16S-rDNA um hochkonservierte Sequenzen handelt (die z.B. auch für taxonomische Bestimmungen eine bedeutende Rolle spielen), lassen sich hier unabhängig vom Bakterienstamm universelle Primer einsetzen. Die Annealing-Temperatur wird, genauso wie die Auswirkung des für die Replikation wichtigen Cofaktors Mg 2+, mithilfe mehrerer PCR-Ansätze getestet.
Nachdem mithilfe einer Gelelektrophorese der erfolgreichste Ansatz ausgewählt wurde (es muss sich eine kräftige, dominierende Bande bei 1,5 kb zeigen), wird das amplifizierte Gen in einen Vektor eingebaut und in den E.coli-Stamm JM109 transfomiert und anschließend kloniert. Aus 10 Einzelkulturen wird schließlich die Plasmid-DNA isoliert und durch Restriktionsanalyse kontrolliert.
Damit fasst dieser Versuch eine große Bandbreite molekularbiologischer Techniken
zusammen, von der DNA-Isolierung über die PCR bis zur Transformation und Klonierung.
Inhaltsverzeichnis
- Einleitung
- Material und Methoden
- Isolierung chromosomaler DNA (Schnellverfahren)
- Ansetzen der PCR
- Kontrolle der PCR
- Klonierung des Amplifikats
- Kontrolle der Transformation
- Ergebnisse
- Diskussion
Zielsetzung und Themenschwerpunkte
Der Versuch zielt darauf ab, die 16S-rDNA des stickstofffixierenden Endosymbionten Sinorhizobium meliloti mithilfe von PCR zu amplifizieren und anschließend durch Transformation in E.coli zu klonieren.
- Isolierung chromosomaler DNA aus Sinorhizobium meliloti
- PCR-Amplifikation der 16S-rDNA
- Klonierung des Amplifikats in einen Vektor
- Transformation und Klonierung in E.coli
- Kontrolle der Transformation durch Restriktionsanalyse
Zusammenfassung der Kapitel
Einleitung
Dieser Abschnitt führt in die Thematik des Versuchs ein und erklärt die Zielsetzung der Amplifikation und Klonierung der 16S-rDNA von Sinorhizobium meliloti. Es werden die wichtigsten Aspekte der PCR-Methode sowie die Bedeutung der 16S-rDNA für taxonomische Bestimmungen erläutert.
Material und Methoden
Dieses Kapitel beschreibt detailliert die einzelnen Schritte der Versuchsdurchführung, beginnend mit der Isolierung der chromosomalen DNA aus Sinorhizobium meliloti bis hin zur Kontrolle der Transformation durch Restriktionsanalyse. Es werden die verwendeten Materialien und Methoden sowie die jeweiligen Parameter und Bedingungen für die einzelnen Schritte erläutert.
Ergebnisse
Dieser Abschnitt beinhaltet die Ergebnisse der durchgeführten Versuche. Es werden die Ergebnisse der PCR-Amplifikation, der Klonierung und der Transformation dargestellt und analysiert.
Diskussion
In der Diskussion werden die Ergebnisse des Versuchs interpretiert und in den Kontext der wissenschaftlichen Literatur eingeordnet. Es werden mögliche Ursachen für die beobachteten Ergebnisse sowie die Relevanz der Ergebnisse für das Forschungsfeld diskutiert.
Schlüsselwörter
Die zentralen Themen des Versuchs sind die 16S-rDNA-Amplifikation, die Klonierung, die Transformation und die Restriktionsanalyse. Weitere wichtige Begriffe sind Sinorhizobium meliloti, E.coli, PCR, Vektoren, Plasmide, kompetente Zellen und LB-Medium.
- Arbeit zitieren
- Cornelia Dorn (Autor:in), 2006, Amplifikation und Klonierung von rDNA aus Sinorhizobium meliloti, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/87892
