In dieser Arbeit wurde untersucht, ob MIA, neben Wechselwirkungen mit
Extrazellularmatrixmolekülen, auch spezifisch mit Rezeptoren auf der Oberfläche
von Melanomzellen interagieren kann. Zusätzlich sollte geklärt werden, um welche
Rezeptoren es sich dabei handelt. Zur Verbesserung der Detektion von MIA wurde
dieses biotinyliert. Die Herstellung des rekombinanten, biotinmarkierten Moleküls
erfolgte in einem zellfreien, in vitro Transkriptions-/Translationssystem auf E.coli
Basis (RTS Roche). Das daraus gewonnene, biotinmarkierte Protein wurde für die
gesamten Experimente verwendet. Die korrekte Faltung des Proteins konnte
dadurch verifiziert werden, dass es möglich war, das biotinylierte MIA mittels
Antikörper in einem bereits etablierten ELISA-Assay nachzuweisen. Durch
zusätzliche funktionelle Assays, wie Zellmigrationsassay und Invasionsassay,
konnte ebenfalls sichergestellt werden, dass die migrationshemmende Wirkung
von MIA auf Zellen in vitro, auch nach dessen Biotinmarkierung, erhalten blieb.
In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass MIA die Aktivität der MAP-Kinase ERK 1/2
vermindert. Zusätzlich konnte erstmals gezeigt werden, dass MIA nicht nur an
Extrazellularmatrixproteine, sondern direkt spezifisch an die Fibronektinrezeptoren
alpha4 beta1 und alpha5 beta1 binden kann. Weitere Untersuchungen zur
Wirkungsweise von MIA auf Integrine ergaben, dass MIA die Aktivierung der
Integrine hemmen kann.
Im Rahmen eines weiteren Projekts stellte sich bei einer Untersuchung von Zell-
Zelldadhäsionsproteinen mittels Western Blot heraus, dass das klassische PCadherin
in Melanomzellen in einer verkürzten, 50 kDa Form vorliegt. Dabei
wurde gezeigt, dass die Verkürzung von P-Cadherin bereits auf mRNA-Ebene
nachgewiesen werden kann. Mittels RT-PCR konnte demonstriert werden, dass in
allen untersuchten Melanomzelllinien das 3´Ende der mRNA von P-Cadherin ab
Exon 10 fehlte.
Inhaltsangabe
1 Zusammenfassung
2 Einleitung
2.1 Struktur und Aufbau der Haut
2.1.1 Funktion der Melanozyten
2.2 Das Maligne Melanom
2.2.1 Das Melanom – Geschichtlicher Hintergrund
2.2.2 Mortalität und Inzidenz des malignen Melanoms
2.2.3 Proteine, die an der Entstehung des malignen Melanoms beteiligt sind
2.3 Zell-Zell-Adhäsionsmoleküle im malignen Melanom
2.3.1 Cadherine
2.3.2 Die Rolle der klassischen Cadherine im malignen Melanom
2.4 Zell-Matrix-Adhäsionsmoleküle im malignen Melanom
2.4.1 Integrine
2.4.2 Die Struktur der Integrine
2.4.2.1 Die extrazelluläre Domäne
2.4.2.2 Die zytoplasmatische Domäne
2.4.3 Die Rolle der Integrine im malignen Melanom
2.4.4 Die Integrinexpression in Melanozyten
2.4.5 Die Integrinexpression im malignen Melanom
2.5 Die Adhäsion von Zellen
2.5.1 Signalkaskaden, bei der Zell-Matrixadhäsion, ausgehend von Integrinen
2.5.2 Signalkaskaden bei der Zell-Zelladhäsion ausgehend von Cadherinen
2.6 Das Protein MIA
2.6.1 Die Rolle von MIA bei der Zelladhäsion im malignen Melanom
3 Material und Methoden
3.1 Materialien
3.1.1 Allgemeine Materialien
3.1.2 Geräte
3.1.3 Organismen
3.1.4 Säugerzelllinien
3.1.5 Oligonukleotide
3.1.6 Peptide
3.2 Medien, Antibiotika und Puffer
3.2.1 Medien zur Anzucht von E.coli und Säugerzellkulturen
3.2.2 Antibiotika
3.2.3 Puffer und Lösungen
3.3 Methoden
3.3.1 Arbeiten mit Escherichia Coli
3.3.1.1 Kultivierung von Bakterien
3.3.1.2 Transformation von E.coli
3.3.1.3 Herstellung kompetenter Bakterien
3.3.1.4 Isolierung von Plasmid DNA
3.3.1.5 Isolierung von Plasmid DNA im größeren Maßstab (Midipräparation)
3.3.1.6 Isolierung genomischer DNA aus eukaryontischen Zellen.
3.3.2 Molekularbiologische Methoden
3.3.2.1 DNA- und RNA Methoden
3.3.2.1.1 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen
3.3.2.1.2 Gelelektrophorese von DNA
3.3.2.1.3 Isolierung und Reinigung von DNA-Fragmenten
3.3.2.1.4 DNA- und RNA-Konzentrationsbestimmung
3.3.2.1.5 Reverse Transkription
3.3.2.1.6 Polymerase Kettenreaktion (PCR)
3.3.2.1.7 3´RACE (rapid amplification of cDNA ends)
3.3.2.2 RNA-Methoden: RNA Isolierung aus Säugerzellen bzw humanen Geweben
3.3.2.3 Proteinchemische Methoden
3.3.2.3.1 Rekombinante zellfreie Herstellung von biotinyliertem MIA
3.3.2.3.2 Herstellung von Gesamtproteinextrakten
3.3.2.3.3 Konzentrationsbestimmung von Gesamt- und Kernproteinen
3.3.2.3.4 SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese
3.3.2.3.5 Western Blot
3.3.2.3.6 Proteindetektion auf Western-Blots
3.3.2.3.7 Silberfärbung im SDS Gel
3.3.2.3.8 ELISA
3.3.2.3.9 MAP-Kinase-Aktivitätsassay
3.3.2.3.10 Ko-Immunpräzipitation
3.3.2.3.11 Immunhistochemie
3.3.3 Zellkulturmethoden
3.3.3.1 Kultivierung von eukaryontischen Zellen
3.3.3.2 Stabile und transiente Transfektion von Zellkulturzellen
3.3.3.3 Durchflußzytometrische Analyse von Zellen (FACS)
4 Ergebnisse
4.1 Untersuchungen an einer verkürzten und sezernierten Form von P-Cadherin in Melanomzellen
4.1.1 Suche nach Veränderungen bei Zelladhäsionsmolekülen während der Entstehung des malignen Melanoms
4.1.2 Analyse der P-Cadherinexpression in Melanomzelllinien
4.1.3 Sezernierung der verkürzten Form von P-Cadherin
4.1.4 Analyse der in situ Expression der 50 kDa Form von P-Cadherin
4.1.4.1 Analyse der P-Cadherinexpression in tissue microarrays (TMA)
4.1.5 Western Blot Analyse von P-Cadherin in Melanommetastasen
4.1.6 Analyse der genomischen P-Cadherinsequenz in Melanomzelllinien
4.1.7 Analyse der P-Cadherin mRNA in Melanomzelllinien
4.2 Charakterisierung von spezifischen Bindungspartnern des Proteins MIA
4.2.1 Expression von rekombinantem biotinyliertem MIA
4.2.2 MIA reduziert die MAP-Kinase Aktivität im malignen Melanom
4.2.3 MIA bindet an die Zelloberfläche
4.2.4 Identifikation von MIA- Bindungspartnern
4.2.5 MIA bindet direkt an alpha4 beta1 und alpha5 beta1
4.2.6 MIA inhibiert Integrinaktivität
4.2.7 Analyse der Interaktion zwischen MIA und Integrinen
5 Diskussion
5.1 Identifikation einer trunkierten Form von P-Cadherin im malignen Melanom
5.2 Regulation des MAP-Kinase Signalweges über MIA
5.3 Bindung von MIA an Integrine alpha4 beta1 und alpha5 beta1
Zielsetzung & Themen
Die vorliegende Arbeit untersucht die molekularen Mechanismen der Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktion beim malignen Melanom. Ziel ist es, die Rolle der sezernierten Proteine P-Cadherin (in einer verkürzten 50 kDa Form) und MIA (melanoma inhibitory activity) bei der Ablösung von Tumorzellen aus ihrem ursprünglichen Gewebeverband sowie bei der Migration und Invasion zu identifizieren.
- Analyse einer trunkierten, sezernierten P-Cadherin-Form (P-Cad50) in Melanomzellen.
- Untersuchung der regulatorischen Einflüsse von MIA auf den MAP-Kinase-Signalweg (ERK 1/2).
- Identifikation und Charakterisierung spezifischer Bindungspartner von MIA, insbesondere die Fibronektinrezeptoren alpha4 beta1 und alpha5 beta1.
- Aufklärung der Inaktivierung von Integrinen durch MIA als Mechanismus zur Ablösung von der extrazellulären Matrix.
Auszug aus dem Buch
4.1.1 Suche nach Veränderungen bei Zelladhäsionsmolekülen während der Entstehung des malignen Melanoms
Im Zuge dieser Arbeit wurde der Versuch unternommen, Unterschiede bei zelladhäsionassoziierten Molekülen zwischen Melanozyten und Melanomzelllinien festzustellen. In einem Western Blot auf Veränderungen an Zelladhäsionsmolekülen in Melanomzellinien wurden die Proteine pp120, Paxillin, gamma-Catenin, VASP, N-Cadherin und P-Cadherin untersucht (siehe Abbildung 4-1). Gemäß der Datenbank Online Mendelian Inheritance in MAN weisen diese Proteine in den Melanomzelllinien jeweils die erwartete Größe auf.
pp120 hat ein Molekulargewicht von 120 kDa. In Abbildung 4-1 erkennt man zusätzliche kleinere Proteinbanden, welche auf Degradationen oder deglykosylierte Formen des Proteins hinweisen. VASP hat ein Molekulargewicht von 40 kDa. Paxillin weist Banden zwischen 65 und 70 kDa auf, wobei das aberrante Laufverhalten des Proteins im Gel wahrscheinlich auf seinen hohen Prolingehalt (10%) zurückzuführen ist (OMIM). N-Cadherin zeigt das bekannte Molekulargewicht von 130 kDa und Plakoglobin von 82 kDa.
P-Cadherin jedoch hat ein auffälliges niedriges Molekulargewicht von ungefähr 50 kDa, wohingegen die erwartete Größe von P-Cadherin 120 kDa beträgt. Aufgrund dieser Besonderheit wurde in dieser Arbeit die kurze, 50 kDa Form von P-Cadherin in Melanomzelllinien genauer untersucht. In den folgenden Kapiteln werden die Ergebnisse dargestellt.
Zusammenfassung der Kapitel
1 Zusammenfassung: Diese Arbeit untersucht, ob MIA spezifisch mit Rezeptoren auf der Oberfläche von Melanomzellen interagieren kann und analysiert das Vorliegen einer verkürzten, 50 kDa schweren Form des klassischen P-Cadherins in Melanomzellen.
2 Einleitung: Dieses Kapitel erläutert den Aufbau der Haut, die Entwicklung und Biologie des malignen Melanoms sowie die Rolle von Zelladhäsionsmolekülen wie Cadherinen und Integrinen bei der Tumorentstehung.
3 Material und Methoden: Dieser Abschnitt beschreibt detailliert die verwendeten Materialien, Geräte sowie die molekularbiologischen, proteinchemischen und zellkulturellen Methoden zur Analyse der untersuchten Proteine.
4 Ergebnisse: Hier werden die Untersuchungen zur verkürzten Form von P-Cadherin sowie die Charakterisierung spezifischer Bindungspartner des Proteins MIA dargelegt.
5 Diskussion: Dieses Kapitel interpretiert die Ergebnisse bezüglich der P-Cadherin-Trunkierung und der Interaktion von MIA mit Integrinen im Kontext der Metastasierung von Melanomzellen.
Schlüsselwörter
Malignes Melanom, P-Cadherin, MIA, Integrine, Zelladhäsion, Metastasierung, MAP-Kinase, ERK 1/2, Signaltransduktion, Tumorprogression, Zellmigration, Fibronektin, Rezeptorinteraktion, Tumorzellverband, Zell-Zell-Kontakte.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Dissertation im Kern?
Die Arbeit untersucht zwei spezifische Aspekte der Zelladhäsion beim malignen Melanom: die Trunkierung des P-Cadherins und die regulatorische Wirkung des Proteins MIA auf Integrin-Signalwege.
Welche zentralen Themenfelder werden behandelt?
Die Themenfelder umfassen die Zelladhäsionsbiologie, die Metastasierung von Melanomzellen, die Signaltransduktion über MAP-Kinasen sowie die Interaktion zwischen Tumorzellen und der extrazellulären Matrix.
Was ist das primäre Ziel der Forschungsarbeit?
Das primäre Ziel ist es, den Beitrag der Proteine MIA und P-Cadherin zur Ablösung von Tumorzellen aus dem Zellverband und deren darauffolgende Migration und Invasion in umliegendes Gewebe aufzuklären.
Welche wissenschaftliche Methode wird primär verwendet?
Es kommen diverse molekularbiologische, proteinchemische und zellbiologische Methoden zum Einsatz, darunter Western Blot-Analyse, ELISA, Ko-Immunpräzipitation, FACS-Analyse und PCR-basierte Ansätze.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Der Hauptteil gliedert sich in die Untersuchung der 50 kDa P-Cadherin-Form in Melanomzelllinien und -metastasen sowie in die Charakterisierung der Bindung von MIA an spezifische Integrine und dessen hemmende Wirkung auf die MAP-Kinase-Aktivität.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Zentrale Begriffe sind malignes Melanom, P-Cadherin, MIA (Melanoma Inhibitory Activity), Integrine, Zelladhäsion und Metastasierung.
Warum spielt P-Cadherin bei Melanomen eine Rolle?
Es konnte gezeigt werden, dass das klassische P-Cadherin in Melanomzellen in einer verkürzten, 50 kDa großen Form vorliegt, die sezerniert wird und die normalen Zell-Zell-Kontakte stören kann.
Welchen Einfluss hat das Protein MIA auf Melanomzellen?
MIA blockiert spezifische Integrin-Rezeptoren (alpha4 beta1 und alpha5 beta1) und reduziert dadurch die Aktivität des MAP-Kinase-Signalweges, was die Ablösung der Zellen von der extrazellulären Matrix begünstigt.
- Citar trabajo
- Richard Bauer (Autor), 2005, Aspekte der Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktion im malignen Melanom, Múnich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/93069
