Altersabhängige Veränderung von Immunsystem und Verhalten weiblicher Tupajas (Tupaia belangeri)

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung
1.1 Warum wurde diese Untersuchung an Tupaia belangeri durchgeführt?
1.2 Physiologische Veränderungen im Alter
1.3 Verhalten im Alter
1.4 Altersabhängige Reaktionen auf Stress
1.5 Fragestellung

2 Tiere, Material & Methoden
2.1 Tiere
2.2 Haltungsbedingungen
2.3 Versuchsdurchführung
2.3.1 Versuchsteil 1: Veränderung im Alter unter Haltungsbedingungen
2.3.2 Versuchsteil 2: Altersabhängige Veränderung der Reaktion auf nicht sozialen Streß
2.4 Verhaltensuntersuchungen
2.4.1 Verhaltensaufnahme in den Haltungsräumen
2.4.2 Verhaltensaufnahme in den Versuchsräumen
2.4.3 Aufgenommene Verhaltensweisen
2.4.4 Auswertung der Videoaufnahmen
2.5 Aufnahme physiologischer Daten
2.5.1 Körpermasse
2.5.2 Blutabnahme
2.5.3 Immunologische und hämatologische Untersuchungen
2.5.3.1 Zellzahlbestimmung
2.5.3.2 Zellpopulationen des Vollblutes ( Differentialblutbild)
2.5.3.3 Gewinnung Lymphozyten-Suspension (Dichtegradientenzentrifugation)
2.5.3.4 Lymphozytentransformationstest (LTT) von isolierten Zellen
2.5.3.5 Lymphozytentransformationstest mit Vollblut
2.5.3.6 In vitro-Phagozytosekapazität (Chemilumineszenstest) aus Vollblut
2.5.3.7 Klassische Komplementbindungsreaktion (CH50-Test)
2.5.4 Endokrine Untersuchungen
2.6 Mathematik, Statistik und Darstellungsweise

3 Ergebnisse
3.1 Ergebnisse unter Haltungsbedingungen (Versuch 1)
3.1.1 Altersabhängige Unterschiede im Verhalten (Haltungsbedingungen)
3.1.2 Physiologische Veränderungen in Abhängigkeit vom Alter (unter Haltungsbedingungen)
3.1.2.1 Körpergewicht
3.1.2.2 Immunologische und hämatologische Parameter
3.1.2.3 Endokrine Parameter
3.2 Vergleich der Ausgangswerte von 8 Uhr und 12 Uhr
3.3 Altersabhängige Reaktionen auf nicht sozialen Stress (Versuch 2)
3.3.1 Altersabhängige Unterschiede im Verhalten
3.3.2 Altersabhängige Veränderung der Reaktion physiologischer Parameter (Umsetzphase)
3.3.2.1 Körpermasse
3.3.2.2 Immunologische und hämatologische Parameter
3.3.2.3 Endokrine Parameter

4 Diskussion
4.1 Altersabhängige Veränderungen unter Haltungsbedingungen
4.1.1 Verhalten
4.1.2 Physiologie
4.2 Altersabhängig veränderte Reaktionen auf den Umsetzversuch
4.3 Schlussbetrachtung

5 Zusammenfassung

6 Anhang
6.1 Verwendete Abkürzungen
6.2 Geräte
6.3 Originaldaten
6.3.1 Versuch 1 (Haltungsbedingungen)
6.3.1.1 Verhaltensdaten
6.3.1.2 Physiologische Daten
6.3.2 Versuch 2 (Umsetzphase)
6.3.2.1 Verhaltensdaten
6.3.2.2 Immunologische und hämatologische Parameter

7 Literaturverzeichnis

1 Einleitung

Aging is: „an increased liability to die, or an increasing loss of vigour, with increa- sing chronological age, or with the passage of the life cycle“ (COMFORT, 1960)

Sollte die derzeitige demographische Entwicklung eines generellen Geburtenrück- gangs und einer wachsenden Lebenserwartung im Alter keine Änderung erfahren, sagen Prognosen eine dramatische „Überalterung“ der westlichen Gesellschaft vor- aus: Ein fünftel der Bürger wird dann über 65 Jahre alt sein (FURGUSON 1995; MAC GREGOR 1990). Diese Entwicklung wird insbesondere auf viele medizinische Fort- schritte in der Vorbeugung und Behandlung von infektiösen Erkrankungen zurückge- führt.

Doch trotz der zentralen Bedeutung des Alterns für den Menschen sind die physio- logischen Mechanismen, die zum Altern der Lebewesen und letztlich zu ihrem Tod führen, weitgehend unbekannt. Zwar gibt es die verschiedensten Hypothesen über die dem Altern zu Grunde liegenden Prozesse, doch keine kann auch nur einigerma- ßen als belegt oder allgemein gültig gelten. Selbstverständlich müssen Altern und Seneszenz letztlich auf Prozesse zurückzuführen sein, die auf zellulärer und subzellu- lärer Ebene ablaufen. Entsprechend werden gerade derartige Prozesse in vivo und - insbesondere - in vitro sehr intensiv untersucht (z.B. an Zellkulturen von Fibroblasten). Doch muss man sich über die Grenzen dieses Forschungsansatzes ge- rade im Bereich der Altersforschung im Klaren sein: Unterschiedliche Zelltypen altern selbst in vitro sehr unterschiedlich, in vivo gibt es sogar Zellen, die kaum altern, ob- wohl sie sich nicht teilen können (Nervenzellen). Es ist auch keineswegs geklärt, ob nicht eher eine Verschlechterung zentralnervöser oder endokriner, immunologischer oder sonstiger Regulationsprozesse für das Altern verantwortlich ist, als definierte zelluläre Prozesse (Übersicht: ARKING 1991; S. 283-284).

So stirbt heute etwa die Hälfte aller Menschen westlicher Industrienationen an Herz- kreislauferkrankungen, an deren Entstehung neben genetischen Prädispositionen Umweltfaktoren einen entscheidenden Anteil haben. Es nehmen jedoch auch solche Erkrankungen zu, die für ältere Menschen typisch sind und an deren Entstehung oder Verlauf das Immunsystem beteiligt ist, wie die verschiedensten Krebsformen sowie Autoimmunkrankheiten (MC GLAUCHLEN & VOGEL 2003). In wieweit die Zunah- me dieser Erkrankungen jedoch altersbedingt ist oder auf Außeneinflüsse zurück- geht, die im Laufe des Lebens auf die Individuen einwirken, kann nicht entschieden werden, zumal sich gerade beim Menschen Ernährungs- und Lebensgewohnheiten ebenso wie verschiedene Umwelteinflüsse in den letzten Jahrzehnten stark verändert haben.

Um daher Aufschluss über altersabhängige Veränderungen zu erlangen, müssen Untersuchungen an Tieren durchgeführt werden, die unter standardisierten Bedingungen (konstantes Klima und Temperatur) gehalten werden. Dies ist jedoch aus finanziellen Gründen meist nur an relativ kurzlebigen Standardlabortieren wie Laborratten und Labormäusen möglich.

Im Rahmen meiner Diplomarbeit untersuchte ich daher altersabhängige Veränderungen an weiblichen Tupajas (Tupaia belangeri), die von ihrer Geburt an unter konstanten Laborbedingungen gehalten worden waren.

1.1 Warum wurde diese Untersuchungan Tupaiabelangeri durch- geführt?

Die in diesem Versuch eingesetzten Tupaia belangeri gehören zur Ordnung Scan- dentia (Spitzhörnchen), welche in 5 Gattungen mit insgesamt 19 Arten eingeteilt wird. Spitzhörnchen sind etwa eichhörnchengroße, tagaktive Säugetiere, die in Süd- ostasien weit verbreitet sind. Dort leben sie als Paare in festen Revieren, welche sie gegen Artgenossen des gleichen Geschlechts heftig verteidigen (KAWAMICHI & KAWA- MICHI 1979). Sie ernähren sich von Insekten, Früchten, Samen und Knospen (MARTIN 1968).

Spitzhörnchen sind besonders in den Focus von Altersforschern geraten, weil sie phylogenetisch (Karyogramm Vergleiche) näher mit dem Menschen verwandt sind als dies Mäuse und Ratten sind (MÜLLER et al. 1999; PRIMMER 2002). Zudem werden Tupajas für ein Tier ihrer Größe sehr alt. Neuere Untersuchungen legen sich auf ein maximales Lebensalter abhängig von der Art auf 10-14 Jahre fest (PRIMMER 2002). Die in der Studie verwendete Art (Tupaia belangeri) ist anderen Scandentia Arten aufgrund der stabilsten Sterberate in den ersten 3-4 Lebensjahren als Modelorga- nismus vorzuziehen. Zudem werden sie schon seit den sechziger Jahren intensiv un- tersucht (V. HOLST 1972, 1998), es liegen daher umfassende Kenntnisse über ihr Ver- halten (u.a. SPRANKEL 1961; MARTIN 1968; V. HOLST 1975, 1997) und die verschiedensten physiologischen Parameter vor. Zudem ist es möglich, Tupajas einzeln zu halten; dies gestattet es, ihr Verhalten ohne Störungen (z.B. durch Interaktionen mit Artgenossen) aufzuzeichnen.

1.2 Physiologische Veränderungen im Alter

Das Immunsystem unterliegt im Alter vielfältigen Veränderungen (GLOBERSON & EFFROS 2000). Dies ist vor allem für den Menschen von großer Bedeutung, da mit der Alterung Erkrankungen zunehmen, an deren Entstehung und Verlauf das Immunsys- tem beteiligt ist (s. oben). Untersuchungen über derartige altersabhängige Verände- rungen wurden unter standardisierten Laborbedingungen u. a. an Mäusen durchge- führt (HIROKUWA & UTSAMA 2002). Die Autoren fanden eine signifikante Verschlechte- rung der Lymphozytenproliferationsfähigkeit mit zunehmendem Alter; ebenso wie zuvor bei Hunden auch STRASSER et al. (2000: Labrador Retriever). Entsprechende Befunde stammen auch von Pavianen (JAYASHANKAR 2003) und dem Menschen (KRAUSE et al. 1999; STRAUB 2001). Das spezifische Immunsystem nimmt also in seiner Aktivierbarkeit ab. Strasser et al. (2000) fanden zudem eine höhere Komplementak- tivität bei Hunden im Alter.

Auch endokrine Parameter dürften altersabhängigen Veränderungen unterliegen, allerdings sind die Befunde widersprüchlich: Während manche Autoren z.B. bei La- borraten erhöhte Serumkonzentrationen von Corticosteron im Alter fanden, konnten andere Untersuchungen diese Befunde nicht bestätigen (Übersicht MASARO 1995). Diese Widersprüche könnten auf Unterschieden in Geschlecht oder Stamm der un- tersuchten Tiere beruhen (De KLOET 1992) oder auf unterschiedliche Zeitpunkte der Blutentnahmen. Im Vergleich hierzu sind Befunde bei Primaten einheitlich: Mensch, Rhesusaffen und Makaken zeigen keine erhöhten Cortisol-Werte im Alter.

1.3 Verhalten im Alter

Das Alter hat natürlich auch einen entscheidenden Einfluss auf das Verhalten von Individuen. Eine Untersuchung an Primaten zeigte eine Abnahme des Sexualverhal- ten und des aggressiven Verhalten gegenüber gleichaltrigen Artgenossen (AUJARD & PERRET 1998). Untersuchungen an weiblichen Ratten zeigten eine Abnahme der Fellpflege (SCIMONELLI et al. 1998). Weiterhin fanden diese und andere Autoren (CHEN 2000; MEAD 1994; GATTERMAN 2003; EMBORG 1998) eine Abnahme der Lokomotion mit dem Alter bei Mäusen, Gerbils, Goldhamstern und Rhesus Affen. Vergleichbare Veränderungen belegen SIWAK et al. (2002) bei Hunden: Junge Beagle waren wesentlich aktiver, spielten mehr und erkundeten eine neue Umgebung stärker als ihre älteren Artgenossen. Bei älteren Tieren ging die Abnahme der Lokomotion mit längeren Ruhephasen einher.

1.4 Altersab ängige Reaktionen auf Stress

Stress hat genau wie das Altern Einfluss auf das Immunsystem. Werden Tiere ir- gendeiner Belastung ausgesetzt, zeigen sie verschiedene Stresssymptome. Der dabei wirkende Stress kann z. B. durch Artgenossen ausgelöst werden. Hierbei spielen vor allem Konfrontationen eine wichtige Rolle, bei denen Dominanzbeziehungen zwi- schen gleichgeschlechtlichen Artgenossen geklärt werden (V. HOLST 1972). Der Stress führt zu Verhaltensänderungen der unterlegenen Tiere; dies äußert sich beispielswei- se in einer Reduktion ihrer Mobilität (v. HOLST 1972). Veränderungen zeigen sich auch auf physiologischer Ebene. Bei Stress kommt es zu einer Abnahme der Körper- masse (ZELENA 1999), einem Absinken der Lymphozytenzahl und deren Aktivierbar- keit (V. HOLST 1997; KAISER 1996; STEFANSKI 2001). Eine Abnahme der Aktivität fand man auch bei den Natürlichen Killerzellen (STEFANSKI 1998) und beim Komplement- system (COE 1988). Stress ist zudem mit einem Anstieg der Nebennierenrindenhor- mone verbunden (AYENSU et al. 1994; COLLINS 1997; OTTEN et al. 2002).

1.5 Fragestellung

In dieser Arbeit sollten weibliche Tupaia belangeri hinsichtlich möglicher altersabhängiger Veränderungen in ihrem Verhalten und einigen physiologischen Parametern untersucht werden.

Es wurden folgende Fragestellungen bearbeitet:

1. Zeigen Tupajas mit zunehmendem Alter Veränderungen in ihrem Verhalten?
2. Finden sich bei Tupajas Zusammenhänge zwischen Alter und Immunparame- tern?
3. Verändern sich endokrine Parameter im Alter?
4. Reagieren Tupajas altersabhängig unterschiedlich in ihrem Verhalten und ei- nigen physiologischen Parametern auf eine leichte, nicht soziale Belastung?

2 Tiere, Material & Methoden

2.1 Tiere

Als Versuchstiere wurden insgesamt 36 weibliche Tupajas (Tupaia belangeri) ver- wendet, die ausschließlich der institutseigenen Zucht des Lehrstuhls für Tierphysiolo- gie in Bayreuth entstammten. Die Tiere waren zu Beginn der Untersuchung zwischen 3 Monaten und 7 Jahren alt. Ein Teil der Tiere war sozial unerfahren. Tabelle 1 gibt das Alter der Versuchstiere wieder.

Tabelle 1: Aufstellung aller Tiereund deren Alter mit Geburtsdatum.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.2 Haltungsbedingungen

Vor und während des Versuchs lebten die Tiere in Einzelkäfigen (69×49×49cm; Eigenbau) mit Front-, Decken-, und Bodengittern aus rostfreien Drahtgitter und Seitenwänden aus Holz.

Die Haltungskäfige waren mit einem Kletterast, einem Futterkasten, einer Wasserflasche und einem verschließ und abnehmbaren Schlafkasten ausgestattet der auch dem Transport der Tiere diente. Unter den Käfigen befanden sich Kotwannen, die monatlich gewechselt wurden.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1: Skizze eines Haltungskäfigs ; Vorderansicht

Alle Versuchstiere waren in Käfigen der oben beschriebenen Bauart, in insgesamt 8 verschiedenen Räumen unter identischen Haltungsbedingungen untergebracht. In den Haltungsräumen herrschte ein künstlicher Tag-Nacht-Rhythmus von 12:12 Stunden (Hellphase: von 10.00-22.00 Uhr). Die Raumtemperatur betrug 25±1°C bei einer relativen Luftfeuchte von 40-60%. Den Tieren stand Wasser und standardisier- tes Futter (altromin® 6023, Haltungsdiät Affen, Altromin GmbH) ad libitum zur Ver- fügung.

Für die Versuche unter Einfluss von nicht sozialem Stress („Umsetzversuche“) wurden die Tiere aus den Haltungsräumen in Versuchsräume mit speziellen Beobachtungskäfigen umgesetzt. Diese entsprachen in ihrem Aufbau zwei spiegelverkehrt aneinandergesetzten Haltungsraumkäfigen; Trinkflaschen, Schlaf und Futterkästen waren an der Rückfront abnehmbar angebracht, Bodendraht und Kotwanne waren durchgehend. Die Käfighälften waren durch eine Holzwand getrennt. Ein Sichtkontakt zwischen den 2 Tieren in einem Beobachtungskäfig war nicht möglich.

2.3 Versuchsdurchführung

Diese Untersuchung besteht aus zwei Versuchsteilen.

2.3.1 Versuchsteil 1: Veränderung im Alter unter Haltungsbedin- gungen

Von allen 36 Tieren wurden individuelle Werte der untersuchten physiologischen Parameter bestimmt. Diese Werte werden im Folgenden als 8h Ausgangswert (AGW8h) bezeichnet.

Mindestens vierzehn Tage nach der Blutabnahme wurde von jedem Versuchstier eine gesamte Aktivitätsphase (12h, 10.00-22.00 Uhr) im Heimatkäfig mit einer Videokamera aufgezeichnet.

2.3.2 Versuchsteil 2: Altersabhängige Veränderung der Reaktion auf nicht sozialen Streß

Im zweiten Versuchsteil wurden die Tiere einer akuten nicht sozialen Stresssituation ausgesetzt. Hierfür wurden die Tiere zu Beginn der Hellphase für zwei Stunden (10.00-12.00 Uhr) in eine ihnen unbekannte Umgebung umgesetzt (Versuchsräume). Das Verhalten der Tiere wurde über die gesamte Dauer der Umsetzphase als Video- aufnahme festgehalten.

Im Anschluss an die Umsetzphase (12h) wurde von allen Tieren eine Blutprobe ent- nommen, um individuelle Werte der untersuchten physiologischen Parameter zu bestimmen.

Mindestens vierzehn Tage vor dem zweiten Versuchteil wurden von jedem Tier die physiologischen Parameter um 12 Uhr bestimmt (AGW12).

2.4 Verhaltensuntersuchungen

Von den Versuchstieren wurden in ihren Heimatkäfigen und während der Zeit in den Versuchsräume (Umsetzphase) das Verhalten mit Hilfe einer Videokamera aufge- zeichnet.

2.4.1 Verhaltensaufnahme in den Haltungsräumen

Das Verhalten der Tiere in ihrem Haltungskäfig wurde mit Hilfe einer über dem Käfig angebrachten Miniatur-Kamera aufgezeichnet mit der alle Bereiche des Käfigs eingesehen werden konnten.

Die Kamera wurde bereits 24 Stunden vor der Aufzeichnung am Käfig montiert, da Vorversuche gezeigt hatten, dass nach dieser Zeit der Gewöhnung ein unbeeinflusstes Verhalten der Tiere zu beobachten ist.

2.4.2 Verhaltensaufnahme in den Versuchsräumen

Die Versuchsräume waren durch eine Trennwand mit einer verspiegelten Einweg- scheibe in einen eigentlichen Versuchsraum, in dem sich der Beobachtungskäfig be- fand, und einen Beobachtungsraum getrennt. Im Beobachtungsraum wurde eine Videokamera mit Stativ eingesetzt, um das Verhalten der Tiere auf Videoband aufzu- zeichnen.

2.4.3 Aufgenommene Verhaltensweisen

Bei der Auswertung mittels point-sampling wurden die unterstrichenen Verhaltensweisen aufgenomen, die übrigen Verhaltensweisen wurden nur bei der detaillierten continous-sampling Methode berücksichtigt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.4.4 Auswertung der Videoaufnahmen

Sowohl das Verhalten der Tiere in den Haltungsräumen (12 Stunden), als auch die Phase des „Umsetzens“ (2 Stunden) wurden auf Videoband aufgezeichnet und aus- gewertet.

Die Bestimmung von Verhaltensanteilen geschah mit einer Kombination aus „point- sampling“ für langandauernde- und „continuous-sampling für kurze Verhaltenswei- sen gewählt. Aufgrund von Erfahrungswerten wurde bei der „point-sampling“ Me- thode im Intervall von einer Minute während der gesamten Lichtphase vermerkt, welche Verhaltensweise die Tiere zu genau diesen Zeitpunkten zeigten. Die Anzahl der kurzen Verhaltensweisen (Turnen, Markieren) wurde über die gesam- te Lichtphase gezählt.

2.5 Aufnahmephysiologischer Daten

Die einzelnen Testverfahren und ihre Bedeutung werden im Folgenden beschrieben. Alle verwendeten Geräte werden im Anhang aufgeführt.

2.5.1 Körpermasse

Die Tiere wurden mit Hilfe einer elektronischen Waage auf ±1g gewogen.

2.5.2 Blutabnahme

Materialien

- Skalpellklingen (doppelseitig)
- Heparinlösung ( 620 IU in 0,9% NaCl-Lösung; Sigma)
- 5ml -Spritzen (Becton-Dickinson) mit 0,5 ml Heparinlösung
- Reaktionsgefäß (1,5ml; Eppendorf)
- K2-EDTA-Lösung (500mg/0,9%NaCl ml; Sigma)

Durchführung

Die Blutabnahmen für den 1. Versuchsteil erfolgten jeweils um 8 Uhr, d.h. zwei Stunden vor Beginn der Aktivitätsphase. Die Blutabnahmen für den 2. Versuchsteil erfolgten um 12 Uhr, also jeweils direkt nach der „Umsetzphase“, bzw als Ausgangswert 14 Tage vor Versuchsbeginn.

Die Tiere wurden in ihrem Schlafkasten eingesperrt und in ein Labor gebracht. Dort wurde der Schwanz mit Vaseline eingerieben und mit Hilfe einer doppelseitigen Skalpellklinge der Schwanzvenenplexus punktiert. Das austretende Blut wurde wie folgt verteilt:

Ca. 300µl in ein mit 10µl K2-EDTA-Lösung befülltes Reaktionsgefäß, zur Bestimmung der Leukozytenzahl,

ca. 200µl in ein leeres Reaktionsgefäß zur Bestimmung der Kortikosteroide und Östrogen-Konzentration,

ca. 50µl in ein Reaktionsgefäß ohne Antikoagulans zur Bestimmung der Komplementaktivität,

ca 500µl in eine mit 500µl Heparin-Lösung befüllte 5ml Spritze zur Bestimmung immunologischer Parameter.

Die Entnahme der Proben für die Hormon-Bestimmungen war stets innerhalb von drei Minuten nach Betreten des Haltungs- bzw. Versuchsraumes abgeschlossen (sie- he: 2.6.4)

2.5.3 Immunologische und hämatologische Untersuchungen

In dieser Untersuchung wurde die Zahl der Leukozyten im Blut, die in vitro Lymphozytenproliferationsfähigkeit und die in vitro Phagozytoseaktivität bestimmt. Zudem wurden Blutausstriche angefertigt, um Anhand von Differentialblutbildern die Zellpopulation bestimmen zu können.

2.5.3.1 Zellzahlbestimmung Materialien

- Coultergefäße (Coulter)
- Isoton Lösung (FACS-FlowTM, Becton Dickinson)
- Lysereagenz (ZAP-OGlobin®, Coulter Electronics Ltd.)

Durchführung

Zellzahlbestimmungen, wie z.B. die der Leukozyten oder der Zellzahl in der Lyphozytenbande (vgl. 2.6.3.3), wurden mit Hilfe eines elektronischen Partikelzählgerätes auf der Basis der Leitfähigkeitsänderung in Abhängigkeit von der Partikelgröße durchgeführt. Die Erythrozyten werden mittels Diskriminatoren, in dieser Untersuchung ein Lysereagenz , von der Zählung ausgeschlossen.

20µl der zu messenden Suspensionen (EDTA Blut, heparinisiertes Blut, Zellsuspension) wurden invers zu 10ml Isoton-Lösung pipettiert und vorhandene Erythrozyten durch Zugabe von vier Tropfen Lysereagenz diskriminiert. Anschließend wurden die Proben in den Meßbereichen 3.75-4,1µm und über 4,1µm ausgezählt; das Zählergebnis entspricht der Zellzahl pro Mikroliter Blut bzw. Medium.

2.5.3.2 Zellpopulationen des Vollblutes( Differentialblutbild) Materialien

- Objektträger
- May-Grünwald-Lösung (Merck)
- Giemsa-Lösung (Merck)
20ml Giemsa (filtriert) in 180ml Aqua bid.
- Aqua bidest.

Durchführung

Da für Tupajas keinerlei Antikörper gegen Membran-Marker erhältlich sind, wurden die Zellpopulationen aus dem Differentialblutbild nach einer vorhergehenden panoptischen Färbung nach Pappenheim (siehe RICK 1974) bestimmt.

Diese Färbemethode beruht auf dem Zerfall der Farbstoffe in wässrigen Lösungen in einen aktiven, den Farbstoffträger und einen inaktiven Teil. Der Farbstoffträger und die Zellinhalte bilden ein Farbsalz. Da saure Farbstoffe einen negativ geladenen aktiven Teil bilden, färben sie positiv geladene Eiweißstrukturen an. Basische Farbstoffe (Methylenblau) bilden positive aktive Farbstoffträger und färben demzufolge negativ geladene Eiweißstrukturen. Die Farbsalzbildung schafft somit die Grundlage der panoptischen Färbung (BAAKE & GILLES, 1994).

Die Blutausstriche wurden mit ca. 15µl des EDTA-Blutes angefertigt, einen Tag luftgetrocknet und anschließend für je 5 Minuten mit unverdünnter und 1:1 ver- dünnter (Aqua bidest.) May-Grünwald-Lösung gefärbt, anschließend wurden die Ausstriche in Aqua bidest. gespült. Danach wurden sie nochmals für 20 Minuten in frisch angesetzter Giemsa-Lösung gefärbt. Abschließend wurden die Objektträger noch zweimal mit Aqua bidest. gespült und dann bis zur mikroskopischen Auswer- tung lichtgeschützt gelagert.

Für die Färbung der Lymphozytenbanden-Ausstriche (vgl. 2.6.6) wurden die Färbe- zeiten wie folgt verändert: je 2 Minuten in unverdünnter und 1:1 verdünnter May- grünwald-Lösung und 5 Minuten in der Giemsa-Lösung. Ansonsten wurde wie bei der Färbung der Blutausstriche vorgegangen. Die Bestimmung der Anteile der ver- schiedenen Leukozytenpopulationen erfolgte unter dem Mikroskop bei 1250facher Vergrößerung. Pro Blut-Ausstrich wurden 100 Leukozyten anhand von Form, Farbe und spezifischer Anfärbbarkeit in segmentkernige, basophile und eosinophile Grano- lozyten, Lymphozyten und Monozyten differenziert. Um die Reproduzierbarkeit der Zählergebnisse sicherzustellen, wurden bei jeder Auszählung neuer Ausstriche zwei ältere nochmals gezählt. Bei den Lymphozytenbanden-Ausstrichen wurden ebenfalls 100 Zellen ausgezählt, um die Bestimmung des Reinheitsgrades der Lymphozyten- bande zu ermitteln.

2.5.3.3 Gewinnung Lymphozyten-Suspension (Dichtegradientenzentrifugation) Materialien

- Percoll Trennlösung® (Dichte 1,077g/ml, seromed)
- sterile Zentrifugenröhrchen
- Plastik Reaktionsgefäß (15m)l
- Medium RPMI-1640 (Sigma, Biochrom KG,
5,5g/l NaCl, w 5mg/l Phenol Red
w2,0g/l NaHCO3, w 25mM Hepes,
w 0,530 g/l N-Acetyl-L-alanyl-lglutamine)
- FKS: fetales Kälberserum hitzeinaktiviert (Sigma)

Durchführung

Aufgrund einer höheren Dichte der Erythrozyten, Granulozyten und Monozyten im vergleich zu den Mononukleiden (Lymphozyten) ist es möglich, diese durch die Dich- tegradientenzentrifugation zu isolieren. Die Lymphozyten akkumulieren sich auf- grund ihrer geringeren Dichte im Vergleich zum Trennmittel auf dessen Interphase zum Serum.

Die Aufarbeitung des Blutes erfolgte unter sterilen Bedingungen. Aus dem periphe- ren Blut der Versuchstiere wurden etwa 1 ml heparinisiertes Vollblut (Spritze) mit Medium RPMI auf ein Endvolumen von 4ml verdünnt und vorsichtig auf eine in Zent- rifugenglasröhrchen befindliche Percoll-Trennlösung im Verhältnis 1:1 überschichtet. Nach 20minütiger Zentrifugation (450g, Raumtemperatur, ohne Bremse) wurde die Lymphozytenbande vorsichtig mit einer Pipette abgezogen und in einem Plastikreak- tionsgefäß mit 4ml Medium RPMI 1640 gewaschen (Zentrifugation: 250g, 10 Min, Raumtemperatur). Anschließend wurde das Pellet in 100µl FKS und 400µl Medium++ resuspendiert.

Mit 15µl dieser Suspension wurde ein Ausstrich angefertigt, welcher über einer Bun- senbrennerflamme hitzefixiert wurde. Dieser Ausstrich diente der Bestimmung der tatsächlichen Lymphozytenkonzentration aus der Dichtegradientenzentrifugation, Diese kann bei Tupajas in einem Bereich von 60-90% schwanken. (Rest: Monozyten, Granulozyten).

20µl der Suspension wurden zur Bestimmung der Zellzahl in Coulter Gefäße pipettiert (vgl. 2.6.3.1 ).

Anschließend wurde durch Zugabe der entsprechenden Menge Medium++ ein Zelltiter von 10⁵ Zellen/150µl eingestellt.

2.5.3.4 Lymphozytentransformationstest (LTT) von isolierten Zellen Materialien

- Sterile Mikrotiterplatten mit Rundboden

96 Well, U-shaped, Tissue.culture treated (TPP )

- Medium RPMI-1640 (Sigma, Biochrom KG,

5,5g/l NaCl, w 5mg/l Phenol Red W

2,0g/l NaHCO3, w 25mM Hepes, w 0,530

g/l N-Acetyl-L-alanyl-lglutamine)

- Medium++

50ml Medium RPMI-1640

5ml Penicilin (100IU/ml) + Streptomycin (100mg/l)- Solution 2%(Sigma)

5ml fetales Kälberserum hitzeinaktiviert (FKS; Sigma)

- Concanavalin A Gebrauchslösung (ConA; Sigma)

2,5µg/ml

- Methyl³ H-Thymidin Stammlösung

(spez Akt:1Ci/mmol;NEN)

Gebrauchslösung: 20mCi/ml

- Glasfiberfiltermatten (Skatron Instruments)

- Szintillationsröhrchen (Beckmann)

- Szintilationsmittel (Unisafe 1, Zinsser Analytic)

Durchführung

Im Lymphozytentransformationstest von isolierten Zellen wird eine durch polyklona- le Mitogene induzierte Proliferation von Lymphozyten gemessen. Die Bestimmung der Aktivierbarkeit erfolgt unabhängig von Mediatoren, die sich im Blut befinden. Das in diesem Versuch eingesetzte Mitogen Concanavalin A (ConA), ein Lectin aus der Schwertbohne (Canavalia ensiformes), stimuliert dabei vor allem in T- Lymphozyten die Teilung und damit auch die Neusynthese von DNA. Im Kulturmedi- um vorhandenes radioaktiv markiertes Thymidin (Methyl-³ H-Thymidin) wird in die neusynthetisierte DNA miteingebaut. Die Menge an eingebautem radioaktivem Thymidin wird anschließend in einem Beta-Counter bestimmt und stellt ein Maß für die Proliferationsfähigkeit der Lymphozyten dar. Der Test wurde nach einer Methode von GILMAN (1982) modifiziert nach SCHÜTT (1991) durchgeführt; alle Arbeitschritte fanden in einer Sterilbank statt. Pro Versuchstier wurden in fünf Vertiefungen (Wells) einer Rundboden-Mikrotiterplatte jeweils 10⁵ Zellen (150µl der auf 10⁵ /150µl ein- gestelleten Suspension; siehe 2.6.3.3) eingesät:

Vier Wells wurden durch die Zugabe von jeweils 25µl ConA-(2,5x10-³ mg/well) Gebrauchslösung stimuliert, in das fünfte Well (Leerwert) wurden 25µl Medium++ gegeben. Nach 24 Stunden Inkubation bei 37°C, 5% CO2 erfolgte die Zugabe von 25µl³ H-Thymidingebrauchslösung (0,5 mCi) pro Well und eine weitere Inkubation von 24 Stunden bei 37°C, 5% CO2.

Durch Ernten mit einem Cell-Harvester auf Glasfiltermatten wurden die Zellen lysiert und die DNA-haltigen Zellkernreste auf den Filterplättchen fixiert, während Zell- trümmer, Medium und unverbrauchtes³ H-Thymidin den Filter passierten. Nach über- führen der Filterplättchen in Szintillationsröhrchen und der Zugabe von 3ml Szintial- tionsmittel wurde die Menge an eingebauter Radioaktivität in einem Beta-Counter ermittelt.

2.5.3.5 Lymphozytentransformationstest mit Vollblut

Der Lymphozytentransformationstest mit Vollblut basiert auf den selben Mechanismen wie der LTT mit isolierten Zellen Der Test mißt die Fähigkeit der Lymphozyten in ihrem natürlichen Medium auf Antigene zu reagieren.

Materialien

- Sterile Mikrotiterplatten mit Rundboden

96 Well, U-shaped, Tissue culture treated

(TPP)

- Medium RPMI-1640 (Sigma, Biochrom KG,

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