GFP (grün fluoreszierendes Protein) - Erstellung eines Workshopprogrammes

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Erstellung eines Workshopprogrammes

Projekt von Nicole Remesch und Regina Zimmer

1.) Zielsetzung:

Das Ziel unseres Projektes war es, ein neues Workshopprogramm für nachfolgende Klassen zu erstellen. In der Aufgabenstellung sollte eine DNA-Isolierung, eine Transformation und, sofern am Ende genügend Zeit verbleiben würde, eine PCR vorhanden sein. Als in die Zellen einzubringendes Protein wurde GFP gewählt, welches die Eigenschaft hat, unter UV-Bestrahlung grün aufzuleuchten.

2.) Theoretische Grundlagen:

2.1) GFP

GFP (grün fluoreszierendes Protein) ist ein von der Qualle Aequoria Victoria gebildetes Protein, das 238 Aminosäuren lang ist. Seine Aufgabe ist die Umwandlung der blauen Chemilumineszenz eines anderen Proteins, des Aequorin, in grün fluoreszierendes Licht. Der Wildtyp des Proteins absorbiert bei 395 nm am stärksten, weist aber auch einen geringeren Peak bei 475 nm auf. Die Emission liegt bei 508 nm. Die Fluoreszenz erfolgt durch eine interne Ser-Tyr-Gly- Sequenz, die mittels Ringbildung eine 4-(p-hydroxybenzyliden)- imidazolidin-5-eins Struktur bildet.

In der Gentechnik wird GFP als ,,Reporterprotein" aufgrund seiner Eigenschaften verwendet:

- geringe Toxizität
- einfache Detektion ohne Reagentien durch die Fluoreszenz
- gute Löslichkeit
- nicht invasiv
- als ,,Anhängsel" an Proteine verwendbar ( da N- und C- terminale Fusionen mit anderen Proteinen in einem weitem Spektrum möglich sind)

GFP wurde bereits in Bacterien, Hefe, Pflanzen, Drosophila, Zebrafische und in Säugetierzellen eingebracht und zur Beobachtung von Protein/Protein Interaktionen und Genproduktion, zur intrazellulären Lokalisation von Zellorganellen oder zur Ermittlung von Eigenschaften verschiedener Promotoren eingesetzt werden.

Physikalische und chemische Studien haben einige wichtige Eigenschaften des GFP ermittelt: · die Dentaurierung ist relativ schwer:

es wurde 6 M Guanidinhydrochlorid verwendet, bei 90 °C und einem pH von unter 4 oder über 12; ansonsten erfolgt nur eine Verschiebung des Absorptionsmaximums von 395 auf 475 nm

- 2-Mercaptoethanol stört die Fluoreszenz nicht
- Dithiobisnitrobenzoesäure hingegen zerstört sie ganz

2.2 Alkalische Lyse:

The minipreparation is a simple and efficient procedure for isolating plasmid DNA. You should be familiar with the molecular and biochemical effects of each reagent used in the protocol:

- GlucoselTrisIEDTA: Glucose functions to maintain osmotic pressure, while the Tris buffers the cells at pH 8.0. EDTA binds divalent cations in the lipid bilayer, thus weakening the cell envelope. Following cell lysis, EDTA limits DNA degradation by binding Mg² + ions that are a necessary cofactor for bacterial nucleases.
- SDS/sodium hydroxide: This alkaline mixture lyses the bacterial cells. The detergent SDS dissolves the lipid components of the cell envelope and the cellular proteins. Sodium hydroxide denatures the chromosomal and plasmid DNA into single strands; the intact circles of plasmid DNA remain intertwined.
- Potassium acetate/acetic acid: The acetic acid brings the pH to neutral, allowing the DNA strands to renature. The large, disrupted chromosomal strands cannot rehybridize perfectly but instead collapse into a partially hybridized tangle. At the same time, the potassium acetate precipitates the SDS from the cell suspension, along with the associated proteins and lipids. The renaturing chromosomal DNA is trapped in the SDS/lipid/protein precipitate. Only smaller plasmid DNA, fragments of chromosomal DNA, and RNA molecules escape the precipitate and remain in solution.
- Isopropanol: The alcohol rapidly precipitates nucleic acids but precipitates proteins slowly. Thus, a quick precipitation preferentially brings down nucleic acids.
- Ethanol: A wash with ethanol removes some remaining salts and SDS from the preparation.
- Tris-EDTA: Tris buffers the DNA solution. EDTA protects the DNA from degradation by DNases by binding the divalent cations (especially Mg² +) that are necessary cofactors for DNase activity

2.3 E.Coli Transformation:

Most transformation protocols can be divided into these four major steps.

1. Preincubation: The cells are suspended in a solution of cations and incubated at 0°C. The cations are thought to complex with negatively charged phosphates of lipids in the E. coli cell membrane. The low temperature congeals the cell mernbrane, stabilizing the distribution of charged phosphates and allowing them to be more effectively shielded by the cations.
2. Incubation: DNA is added, and the cell suspension is further incubated at 0°C. The cations are thought to neutralize negatively charged phosphates in the DNA and the cell membrane.
3. Heat shock: The cell/DNA suspension is briefly incubated at 42°C and then returned to O°C. The rapid temperature change creates a thermal imbalance on either side of the E. coli membrane, which is thought to create a draft that sweeps plasmids into the cell.
4. Recovery: LB broth is added to the DNA/cell suspension and incubated at 37°C (ideally with shaking) before plating on selective media. Transformed cells recover from the treatment, amplify the transformed plasmid, and begin to express the antibiotic-resistance protein.

3. ) Prinzip:

Die erhaltene DNA wird in vorbereitete kompetente E.Coli eingebracht und auf ampicillinhaltigem Medium angezüchtet. Durch Lysispufferbehandlung wird die Zellwand geschwächt, anschließend werden die Bakterien mit NaOH und SDS (Sodeumdodecylsulfat) lysiert. Die chromosomale DNA wird durch diese Behandlung denaturiert. Durch Neutralisation mit saurem Natriumacetat renaturiert die chromosomale DNA. Gleichzeitig fallen Protein-SDS-Komplexe und hochmolekulare RNA durch die hohe Konzentration an Natriumacetat aus, während die Plasmid-DNA im negativen Zustand in Lösung bleibt. Die chromosomale DNA wird durch Zentrifugation abgetrennt. Eine Konzentrierung der Plasmid-DNA erfolgt durch Alkoholfällung.

Die Plasmid-DNA wird mittels Gelelektrophorese aufgetrennt und ausgewertet.

4.) Durchführung:

4.1 Geräte:

- Eppendorf-Kolbenhubpipetten mit Spitzen
- Vortex
- Autoklav
- Laminar-Flow · Photometer · Brutschrank
- Vakuumzentrifuge · Wasserbad

4.2 Stämme :

- ES 33 (Amp-sensitiv und Tet-restistent)
- YepubiL-MLS1 (als Plasmid)
- PJR 232
- PUC 19
- E.coli JM 101
- pFA6A v. 7.12

4.3 Reagentien:

1. Nährböden:

- Herstellung von LB-Medium:
- 10g Trypton
- 10g NaCl
- 5g Hefeextrakt
- 1g Glucose
- mit H2O auf 1000 ml
- mit NaOH auf pH=7.2 einstellen
- einen Teil des Nährmediums portionieren (100 ml, 50 ml)
- einem Teil der Lösung für Platten 15 g Agar zugeben
- autoklavieren
- Herstellung von LB-Amp, LB-Tet und LB-Platten:
- Nährboden temperieren, 100 mg/l Ampicillin (steril eingewogen!) zugeben, Platten gießen
- Nährboden temperieren, 20,8 mg/l Tetracyclin (steril eingewogen!) zugeben, Platten gießen
- Nährboden temperieren, Platten gießen

Hierbei ist zu beachten, dass die Platten nicht zu dünn gegossen werden sollten (mind. 15 ml pro Platte), da der Nährboden sonst eintrocknet. Nach dem Ausgießen wurden die Platten getrocknet (im Labor für 2-3 Tage stehen gelassen) und anschließend in einem Plastiksack in den Kühlschrank gestellt.

2. Reagentien für die Schnelltrafo

- CaCl2-Lösung, 100 mM
- Ethanol (zum Abflammen)

3. Reagentien für die Herstellung kompetenter E.Coli

- 85 % Glycerin
- flüssiger Stickstoff

4. Reagentien für die Miniprep

- Lysispuffer:

1% Glukose

10 mM EDTA.Na2

25 mM Tris.HCl pH=8.0

- NaOH/SDS-Lösung

0.2 N NaOH

1% Natriumdodecylsulfat (SDS)

Immer frisch aus höher konzentrierten Stammlösungen (z.B.: 1N NaOH, 10% SDS) zubereiten

- Na-Acetat:

40.8 g Na-Acetat.3H2O in 40 ml Wasser lösen, mit konz. Essigsäure auf pH=4.8 einstellen und mit Deionat auf 100 ml auffüllen (die Lösung ist 5 M an Acetat).

- 2.5M Ammoniumacetat

5. Elektrophorese

- Gel:

1,05 g Agarose mit 1x TBE auf 150 ml auffüllen und 5 l Ethidiumbromid zusetzen. (= 8 % oder 0,8?????????????)

· TBE (Tris/borate/EDTA) electrophoresis buffer

10 x stock solution, 1 liter:

108 g Tris base (890 mM)

55 g boric acid (890 mM)

40 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0 (20 mM)

4.4 Durchführung:

4.4.1. Schnelltrafo:

- 300 l CaCl2-Lösung in ein Eppi pipettieren
- mittels Impföse E.coli von der Platte aufnehmen und in das Eppi überführen
- per Hand homogenisieren
- auf 3 Eppis aufteilen und 30 min in Eiswasser stehen lassen
- Beschriftung der Eppis:
- Blindwert
- 1 l DNA · 5 l DNA
- in Blindwert-Eppi keine DNA zugeben, in Eppi 2) 1 l und in Eppi 3) 5 l der in sterilem Wasser suspendierten DNA zugeben, mit der Hand homogenisieren · Eppis 10 min in Eiswasser stehen lassen
- Hitzeschock der Zellen durch 2 minütiges Eintauchen der Eppis in das 42°C heisse Wasserbad
- Ausplattieren der Lösungen auf 3 LB-Tet Platten und Bebrüten (24 h bei 37°C) · Auswertung

Ergebnis der Schnelltrafo:

Bei unserem Ansatz (1 bzw 5 l der gelieferten DNA) zeigte sich kein Bewuchs der LB-Tet Platten. Einzig auf der Blindwertplatte wuchs eine gelbgefärbte Kolonie, die durch eine Verunreinigung entstanden sein dürfte. Dadurch wurde in der nächsten Laboreinheit eine ,,lange Trafo mit Herstellung kompetenter E.coli" begonnen.

2. Herstellung kompetenter E. Coli

- Eine einzelne E.coli Kolonie mittels einer Impföse in 100 ml LB suspendieren und über Nacht bebrüten (bei 37 °C am Schüttler, in unserem Fall von Do bis Mo) · Am nächsten Arbeitstag am Vormittag 1 bzw 2 ml der Übernachtkultur entnehmen und je zwei Erlenmeyerkolben mit 100 ml LB damit inokulieren · 4 Kolben · bis zu einem OD590 von 3,75 bebrüten (bei 37 °C am Schüttler)

Anmerkung: Unser OD590 betrug beim ersten Versuch unter 290 · Versuch wurde in der nächsten Woche erneut angesetzt, hier betrug der OD590 von 2 Kolben 0,440

- Kultur in sterile, verschließbare Zentrifugenbecher füllen und 5-10 min auf Eis stehen lassen
- Bei 7000 rpm und 4°C 10 min zentrifugieren und den Überstand entfernen

Anmerkung: Ein Niederschlag war selbst bei diesen

Zentrifugationsbedingungen nur sehr schlecht zu sehen!

- Pellet in 10 ml eisgekühlter CaCl2-Lösung resuspendieren
- Zellen 10 min bei 7000 rpm und 4°C zentrifugieren
- Überstand entfernen (Pellet noch immer schlecht bis gar nicht sichtbar)
- In 10 ml eisgekühlter CaCl2-Lösung aufnehmen und 30 min auf Eis stehen lassen Anmerkung: Aufgrund eines Zeitproblems standen die Zellen von Mo Abend bis Di Früh (18.00-08.30) auf Eis im Kühlschrank
- Zellen 10 min bei 7000 rpm und 4°C zentrifugieren
- Überstand entfernen und Pellet in 2 ml eisgekühlter CaCl2-Lösung aufnehmen
- In Eppis zu je 100 l portionieren
- Glycerin zugeben, sodass eine Endkonzentration von 10 % Glycerin erreicht wird
- Schockfrieren der Zellen mit flüssigem Stickstoff bei -70 °C

Trafo:

- Zur Überprüfung werden 300 l der Lösung nicht eingefroren.
- Je 100 l werden in ein Eppi portioniert:

E 1 (der Blindwert)

E 2 (1 l DNA) E 3 (5 l DNA)

- Es wurde vom Professor DNA zur Verfügung gestellt, die eine Amp-Resistenz der Zellen bei gelungener Trafo bewirken sollte
- 0, 1, 5 l DNA zugeben und per Hand homogenisieren
- Hitzeschock der Zellen bei 42 °C im Wasserbad für 2 min
- Ausplattieren auf LB-Amp Platten
- Bebrütung über Nacht bei 37 °C

Auswertung:

Die Trafo zeigte einen von der DNA-Konzentration abhängigen Bewuchs, die Blindwertplatte war nicht bewachsen.

3. Plasmidisolierung nach Miniprep Methode 1
- 5 ml LB-Medium mit Antibiotikumzusatz mit einer E. coli -Einzelkolonie inokulieren. Über Nacht bei 37 °C anzüchten.
- 1.5 ml Zellkultur in ein Eppendorfgefäß transferieren und 30 Sekunden in einer Eppendorfzentrifuge zentrifugieren. Überstand entfernen.
- Schritt 2 wiederholen. Überstand sorgfältig mit einer Pasteurpipette entfernen.
- Zellpellet in 200 µl Lysispuffer suspendieren, mit Vortex mischen und 30 Minuten auf Eis stehen lassen.
- 400 µl NaOH/SDS-Lösung zugeben, OHNE VORTEX durch mehrmaliges Umdrehen des Eppendorfgefäßes mischen und 5 Minuten auf Eis stehen lassen.
- 300 µl eisgekühlte Na-Acetat-Lösung zugeben, mit Vortex mischen und 5 Minuten auf Eis stehen lassen.
- 5 Minuten abzentrifugieren (7000 rpm und 4°C). Niederschlag mit Zahnstocher entfernen.
- 600 µl Isopropanol zugeben, mischen und 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen.
- 5 Minuten abzentrifugieren. Überstand sorgfältig mit einer Pasteurpipette entfernen und verwerfen.
- Zum Niederschlag 500 µl 2.5 M Ammoniumacetat zugeben. Das Pellet mit Hilfe einer 1 ml-Plastik-Pipettenspitze homogenisieren. 30 Minuten stehen lassen.

Anmerkung: Bei diesem Schritt wurde jede der Minipreps abgebrochen und im Kühlschrank bis zur nächsten Unterrichtseinheit verwahrt.

- Nicht gelöstes Material 5 Minuten abzentrifugieren und Überstand vorsichtig in ein neues Eppendorfgefäß transferieren. Altes Eppendorfgefäß mit Niederschlag verwerfen.
- 300 µl Isopropanol zugeben, mischen und 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen.
- 5 Minuten abzentrifugieren. Überstand sorgfältig abgießen und gut abrinnen lassen.
- 1 ml 70 % tiefgekühlten (-20 °C) Ethanol zugeben und einigemale mit der Hand schütteln.
- 5 Minuten zentrifugieren, den Überstand ausgießen und gut abrinnen lassen.
- Pellet 5-10 Minuten im Vakuum (Speedvac) trocknen.
- DNA in 40 µl sterilem Deionat aufnehmen und für weitere Verwendung im Kühlschrank (4 °C) aufbewahren.

Auswertung:

Die Minipreps wurden 3x durchgeführt:

1.) Miniprep mit den Stämmen PJR 232, PUC 19 sowie ES 33
2.) Miniprep des in die E.coli gebrachten YepubiL-MLS1
3.) Miniprep des in die E.coli gebrachten YepubiL-MLS1

4. Restriktionsverdauung

Stamm 1 (ES 33) · PvU II · Puffer: G+

Stamm 2 (PJR 232) · Hind III + BAM HI · Puffer: Reak2 Stamm 3 (PUC 19) · EcoRI R · Puffer: Reak 3 Stamm 4 (YepubiL-MLS1) · Pst I · Puffer: Reak 2 Stamm 4 (YepubiL-MLS1) · PvU II · Puffer: G+

-Marker :

2µl -Hind III.

13µl steriles Deionat 3µl Stopplösung

10 x loading buffer (= STOPP-Lösung)

4M Urea

50%w/v Saccharose

50mM EDTA.Na2 pH=7.0

0.1%w/v Bromphenol blue

Durchführung:

1. Pipet the following into a clean microcentrifuge tube:

10 µl DNA (0.1 to 4 µg DNA in H2O or TE buffer)

2 µl 10x restriction buffer (according to manufacturer specifications) 7,5 µl H2O

A 20 µ l reaction is convenient for analysis by electrophoresis in polyacrylamide or agarose gels. The amount of DNA to be cleaved and/or the reaction volume can be increased or decreased provided the proportions of the components remain constant.

2. Add restriction endonuclease (1 l or 0,5 l if you have to add two restricton endonucleases) and incubate the reaction mixture 1 hr at the recommended temperature (in general, 37°C).

In principle, 1 U restriction endonuclease completely digests 1 µ g of purified DNA in 60 min using the recommended assay conditions. However, crude DNA preparations, such as those made by rapid procedures, often require more enzyme and/or more time for complete digestion. The volume of restriction endonuclease added should be less than 1/10 the volume of the final reaction mixture, because glycerol in the enzyme storage buffer may interfere with the reaction.

3. Stop the reaction and prepare it for agarose or acrylamide gel electrophoresis by adding 4 µl (20% of reaction vol) 10x loading buffer.

The reaction can also be stopped by chelating Mg ² + with 0.5 µ l of 0.5 M EDTA (12.5 mM final concentration). If the digested DNA is to be used in subsequent enzymatic reactions (e.g., ligation or "filling-in" reactions), addition of EDTA should be avoided. Alternatively, many enzymes can be irreversibly inactivated by incubating 10 min at 65 ° C. Some enzymes that are partially or completely resistant to heat inactivation at 65 ° C may be inactivated by incubating 15 min at 75 ° C. When the enzyme(s) is completely resistant to heat inactivation, DNA may be purified from the reaction mixture by extraction with phenol and precipitation in ethanol.

4. Für eine unverdaute Probe werden:

10 l DNa

10 l H2O

zusammenpipettiert und mit 4 l Färbestopplösung versetzt.

5. Gelelektrophorese

- Das bereits vorbereitete und temperierte Gel wird in die dafür vorgesehene Apparatur gegossen und der Probenkamm eingesetzt.

- Nach einer ½ Std Probenkamm entfernen und das Gel mit TBE Puffer überschichten · Proben mit einer Kolbenhubpipette vorsichtig in die Probenauftragstaschen pipettieren

- Elektroden anschließen · Einstellungen am Gerät:

50 V

(4 h)

30 mA

- Laufenlassen, bis die Banden das untere Drittel des Gels erreicht haben
- Abschalten der Apparatur
- Fotografieren des Gels unter UV-Licht