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cDNA-Microarrays sind in der Lage, tausende von Genexpressionsanalysen in einem einzigen Experiment durchzuführen. Dazu wird DNA auf einem Glasslide verankert und mit fluoreszenz- oder radioaktiv markierter cDNA hybridisiert.

2 Prinzipien und Entwicklung von cDNA-basierten Arrays

2.1 Unterschiede zu herkömmlichen Methoden

Konzeptionell besteht kein Unterschied zwischen herkömmlichen Hybridisierungsexperimenten wie Southern Blotting (DNA-Proben werden dabei auf einem Filter von bekannten Sequenzen aufgetrennt) oder Northern Blotting (RNA-Proben werden auf einem Filter aufgetrennt).

Bei Microarrayexperimenten wird die Sonde direkt mit dem Trägermaterial verbunden und die Informationsmenge, die in einem einzigen Experiment gesammelt werden kann, ist wesentlich grösser.

Weitere Vorteile der Microarraytechnologie liegen in der Verwendung von durch Fluoreszenzfarbstoffe markierter Proben, wohingegen bei klassischen Blotting-Versuchen

meist radioaktiv markierte Proben verwendet werden ¹ . Des weiteren bedarf es nicht der aufwendigen Herstellung per Hand im Labor, sondern eine vollautomatisierte Herstellung durch Roboter ist möglich.

Obwohl die cDNA-Technologie sehr ähnlich zur Oligonukleotidarraytechnologie ist, bringt die Verwendung von cDNA Microarrays einige Vorteile mit sich, die in der technischen Unabhängigkeit der sie verwendenden Labors liegt.

¹ Auch beim Blotting können heute UV-absorbierende Farbstoffe zur Markierung verwendet werden.

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2.2 Wahl der Objektträger

Neben der Verwendung von Nylonobjektträgern spielt das Trägermaterial Glas eine besondere Rolle in der cDNA-basierten Microarraytechnologie. DNA-Proben können mit der behandelten Glasoberfläche kovalent verbunden werden. Weiterhin ist Glas ein beständiges Material, das hohen Temperaturen und Waschen mit stark sauren oder basischen Substanzen widersteht. Ausserdem ist es unporös, so dass die zu hybridisierende cDNA-Menge auf ein Minimum reduziert werden kann, was wiederum die Kinetik der anzulagernden Probes an die Targets verbessert.

Wegen seiner geringen Fluoreszenz trägt es auch nicht zum Hintergrundrauschen bei, und zwei Proben können mit unterschiedlichen Farbstoffen markiert werden und gleic hzeitig auf das Microarray gebracht werden. Nylon-Arrays hingegen sind meist auf eine serielle oder parallele Hybridisierung beschränkt [CHEUN99].

3 Herstellungsprozess und Phasen eines cDNA-Arrayexperimentes

3.1 Chip-Design

Eine herausragende Rolle spielt die Bioinformatik, wenn es darum geht, Probes für ein Microarrayexperiment zu designen und diese aufeinander abzustimmen, um ein sinnvolles Ergebnis ableiten zu können.

Bei der Verwendung kommerzieller Systeme lässt sich die meist aufwendige Konstruktion solcher Chips vernachlässigen, da man hier auf bereits vorgefertigte Komponenten zurückgreifen kann. Die Entwicklung von Chips für ein spezifisches Experiment kann jedoch mehrere Monate dauern, es existieren hunderttausende potentieller Sonden. Der Chip-Entwickler muss eine Teilmenge des Genoms auswählen, die einen informativen Zusammenhang ergeben, wenn sie zusammen auf einen Chip gebracht werden. Jede verankerte cDNA-Sonde sollte eine Einzigartigkeit besitzen, so dass sie auch wirklich nur mit der Zielsequenz hybridisieren kann, die von Interesse ist. Andernfalls wird die Menge an Signalen, die an jeder Bindungsstelle gemessen werden können, quantitativ nicht korrekt sein.

Eine geeignete cDNA darf nicht mit sich selbst hybridisieren oder Dimere und Haarnadelschleifen formen.

In der Praxis bedeutet dies eine aufwendige Sequenzanalyse: Auffinden der Gene von Interesse und die Auswahl sowie Gewinnung entsprechender Proben. Sobald die Proben ausgewählt wurden, müssen ihre Sequenzen mit verfügbarer Hinter-grundinformation für jeden Spot auf dem Array in einer Datenbank festgehalten werden, damit diese Daten auch zur Verfügung stehen, sobald die Ergebnisse ausgewertet sind. Schliesslich müssen die Datenbanken auch robust genug sein, um geänderte Annahmen und Informationen in den öffentlichen Datenbanken zu verkraften, um eine inkorrekte Interpretation der Ergebnisse zu vermeiden. So kann es sein, dass sich die Referenznummer eines bestimmten Gens in einer öffentlichen Datenbank ändert ohne aber einen Hinweis über die neu zugewiesene Nummer zu erhalten.

3.2 Herstellung

Als Trägermaterialien finden Glas oder Nylon Verwendung. Für das Spotten werden dabei werden im wesentlichen 3 Technologien unterschieden:

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1. Fotolithographische Verfahren

2. Microspotting 3. Microspraying (bubble jet technology)

Beim fotolithographischen Verfahren wird DNA in situ auf dem Glasträger synthetisiert (siehe Vortrag zu oligonukleotidbasierten Microarrays). Beim Microspotting werden hingegen Oligos oder PCR-Produkte von einigen hundert Nukleotiden Länge zunächst synthetisiert, dann mittels einer Mikrokapillare direkt auf den Glasträger gesetzt und mit UV-Licht immobilisiert. Der Nachteil dieser Printing-Methode liegt im unmittelbaren Kontakt zur Trägeroberfläche, welcher bei jedem Spot einen sichtbaren Rand hinterlässt und ungleichmässige Spots erzeugt, die ein Problem für das anschliessende Gridding darstellen können.

Eine Alternative zum Microspotting ist das Microspraying. Hierbei wird ohne Berührung des Trägers aus einer Mikrodüse das Trägermaterial aufgesprüht. Nach der Fixierung werden Aminoresiduen auf der Trägeroberfläche mit Succinylanhydriden weggespült, um positive Ladungen zu verringern. Ein Problem der Bubble-Jet-Technik stellen jedoch die hohen Temperaturen dar, der die DNA ausgesetzt ist (200°C) und die hohen

Scherkräfte (10 m s ^-1 ) ⁴ , welche die DNA oder den Druckkopf beschädigen können [OKAMO00].

3.3 Target-Gewinnung und Hybridisierung

Ein klarer Vorteil der cDNA-Microarrays gegenüber oligonukleotidbasierten Techniken liegt in der Verwendung der 2-Farben-Fluoreszenz, da hierdurch 2 Versuche in einem Experiment unter identischen Bedingungen durchgeführt werden können. Die aus Test- und Referenzzellen extrahierte Gesamt-RNA wird mit Hilfe von fluoreszenzmarkierter oligo dT-primierter reverse Transkriptase durch die Verwendung von Nukleotiden, die mit dem Farbstoff Cy3 oder Cy5 verbunden sind, markiert. Hierbei ist es möglich, Test- und Referenzzellen gleichzeitig auf das Array zu bringen, was bei radioaktiv markierten Proben nicht der Fall ist. In diesem Fall wird eine serielle oder parallele Hybridisierung nötig, die jedoch eine höhere Varianz im Vergleich der Expressionsdaten mit sich bringt. Die benötigte DNA-Menge jedes Spots des Microarrays kann folgendermassen geschätzt werden:

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Das kleine Volumen des Spots bedeutet, dass die Probe-Menge für die Hybridisierung auch gering ist, selbst wenn die Konzentration der Targets gross ist (siehe Tabelle 1) [CHEUN99].

Um diese Beschränkung zu umgehen, ist einiger Aufwand nötig. Zusätzlich zur Probe-Menge beeinflusst die DNA, die komplementär zum Target ist, die Länge, und die spezifische Aktivität des Targets sowie die Sensitivität der Methode, die zur Erkennung des Signals eingesetzt wird, die Signalintensität [CASEY77].

Die Stärke des Hybridisierungssignals ist proportional zur spezifischen Aktivität des Targets und umgekehrt proportional zu dessen Länge, so dass es wichtig ist, Targets mit hoher Spezifität zu verwenden.

Nach der Fluoreszenzmarkierung werden nichtbeteiligte Fluor-UTPs entfernt, die mit Cy3 und Cy5 markierten Proben vermischt und diese mit Blockern aus Poly(dA), tRNA und Cot1 DNA gemischt. Anschliessend wird das Gemisch auf dem Array bei einer Temperatur von 65°C und einer Dauer von 16-24h hybridisiert (siehe Abbildung 2). Nach dem Waschvorgang erfolgt dann der Scan des Microarraybildes.

3.4 Bildanalyse und Datengewinnung

Die Fluoreszenz der immobilisierten Proben wird dann mit einem Scanner, eine Art konfokales Mikroskop mit einer Photomultiplizierröhre, gemessen. Dabei werden 2 Bilder generiert, eines, welches die Extinktion und Filterstrahlung von Cy3 enthält, das andere von Cy5.

Sobald das Arrayexperiment beendet ist, werden eine Menge an TIFF-Dateien vorliegen, die die gescannten Bilder der durchgeführten Microarrayexperimente beinhalten. Zur Analyse dieser Bilder kann ein von der Stanfort University entwickeltes Programm-Paket mit dem Namen ScanAlyze verwendet werden. Es ist weit verbreitet und unterstützt Mehrkanalpixelauswertung. TIFF-Dateien und das Stanford SCN-Format werden unterstützt.

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Da jede Probe an einer festgelegten Position immobilisiert wurde, kann das gescannte Bild gerastert und in Segmente unterteilt werden, die jeweils einen Spot enthalten. Im darauffolgenden Schritt werden nun alle Informationen wie Gen-Name und Ursprungsarray für jeden Spot hinzugefügt.

Jedem Bild wird daraufhin eine Pseudofarbe zugewiesen (rot für Cy5 und grün für Cy3) und das Target innerhalb jedes Segmentes identifiziert und die Fluoreszenz für jede Farbe berechnet, indem man die Intensität jedes Pixels innerhalb eines Spot-Segments bestimmt und die Hintergrundstrahlung berücksichtigt wird, die dann von der durchschnittlichen Fluoreszenz des Spots abgezogen wird. Näheres wird man dem Vortrag von Tobias Thierer am 23.05.2002 über Low-Level-Datenanalyse entnehmen können. Daraufhin wird eine Normalisierung durchgeführt, um die Unterschiede zwischen den beiden Bildern zu kompensieren bzw. daraus die durchschnittliche Fluoreszenz zu berechnen. Dies erreicht man z.B. mit einem Satz von Kontrollgenen (sogenannte „hous ekeeping genes“, das sind Gene, die in jeder Zelle zu jedem Stadium exprimiert vorliegen), die ebenfalls auf dem Array verankert wurden und nun ausgewertet werden können. Diese Kontrollgene wurden nach dem Kriterium ausgewählt, dass sie eine rot-grün-Sättigung von 1,0 aufweisen. Daraus kann ein Normalisierungsquotient ermittelt werden, um die Sättigung jedes cDNA-Spots innerhalb des Bildes zu berechnen. Eine Abweichung von 1% des Normalisierungsquotienten entspricht dabei noch einer vollständigen Sättigung.

Die Sensitivität dieser Methode erlaubt das Detektieren von einer aus zehntausend

mRNAs aus einem Satz von poly(A) ⁺ . Ein Vergleich von Array- mit Blottingexperimenten hat dabei ergeben, dass diese Methode sehr zuverlässig ist [KHAN99]. Die bis hierhin erwähnten Teilschritte eines cDNA-Microarrayexperimentes sind nochmals zur Übersicht in Abbildung 3 dargestellt.

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3.5 Visualisierung der gewonnenen Daten

Die Ergebnisse einer Microarrayanalyse sind schwer visualisierbar. Man muss also eine für den Menschen geeignete Darstellung wählen, die ihn auf Auffälligkeiten und Gene, die von Interesse sein könnten, hinweist.

Es werden also Werkzeuge benötigt, die in der Lage sind, Informationen aus höherdimensionalen Datensätzen zu extrahieren und diese in einem gewünschten Bildformat auszugeben. Abbildung 4 zeigt einen Screenshot der Software Arrayplot, die für eine Analyse von Arraydaten verwendet werden kann.

3.6 Data Management und Data Mining

Der Einsatz der Microarraytechnologie ist stark mit dem Einsatz von Rechnern und Datenbanken verbunden. Jede Arraymethode benötigt Datenbanken, mit deren Hilfe die Daten des Chips mit Gendaten abgeglichen und ausgewertet werden können. Des weiteren bietet sich hier ein Vergleich mit bereits durchgeführten Arrayexperimenten an, um so viel Information wie möglich aus den oft teuren und aufwendigen Experimenten schöpfen zu können. Hier werden in Zukunft verstärkt Mathematiker und Statistiker gefordert sein, die in der Lage sind, effiziente Algorithmen zum Datenabgleich zu implementieren und einen Standard zu entwickeln, um unterschiedliche Experimente vergleichbar zu machen. Weiteres wird dem Vortrag am 27.06.2002 über „Bemühungen zu Standardisierungen“ von Class Eggert zu entnehmen sein.

Die am weitesten verbreitete Laborausstattung für Arrayexperimente stammt von Affymetrix (jedoch für oligonukleotidbasierte Array) eng gefolgt von selbstgebauten Microarraystationen. Der Vorteil eines kommerziellen Arrayers liegt in der oft mitgelieferten Software, was es relativ einfach gestaltet, die aus dem Experiment gewonnenen Daten auch zu analysieren bzw. auszuwerten. Selbstgebaute Arrayer jedoch geben Datensätze unterschiedlicher Grösse aus, und eine Standardisierung scheint hier äusserst schwierig. Ein selbstgebauter Arrayer bedeutet, dass man Software finden oder selbst entwickeln muss, die Unterstützung bei den unterschiedlichen Schritten eines Experiments und zusätzliche Funktionalitäten zur Datenanalyse bietet. Hier existieren aber bereits einige öffentliche Ansätze wie NCGR GeneX und EMBL-EBI Arrayexpress. Das NHGRI

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(National Human Genome Research Institute) bietet ebenfalls eine Demoversion eines Array-Datenmanagementsystems mit dem Namen ArrayDB [NHGRI02] an, welches Werkzeuge zur Analyse und relationale Datenbankanbindung leistet.

4 Anwendungsgebiete der Arraytechnologie

4.1 Expressionsanalyse

Mit einem DNA-Chip lassen sich sehr komplexe Proben untersuchen. So kann man z.B. der Frage nachgehen, welche der 6.200 Gene von S. cerevisiae unter bestimmten Bedingungen exprimiert werden, indem man die gesamte mRNA-Population als Target verwendet [DERIS97, WODIC97]. Näheres wird dem Vortrag von Stefan Waldert über experimentelle Microarrays am 04.07.2002 zu entnehmen sein. Dazu werden alle Gene des Arrays (die sogenannten Probes) mit cDNA, den sogenannten Targets, die aus Gesamt-mRNA des untersuchten Organismus (also seinem Transkriptom) synthetisiert wurden, hybridisiert. Zunächst verwendet man hierzu Ta rget cDNA, die einem Normalzustand des untersuchten Organismus entspricht. Da man davon ausgehen kann, dass physiologische Änderungen einer Zelle, die durch Differenzierung, Erkrankung oder Einfluss exogener Substanzen bewirkt werden, jeweils eine spezifische Auswirkung auf das Expressionsmuster dieser Zelle haben, wird eine Hybridisierung mit cDNA aus diesem veränderten Zustand des Targets andere Hybrid isierungssignale mit dem konstanten Chip ergeben. Beide cDNAs sind mit Fluoreszenzlabeln unterschiedlicher Farbe markiert und hybridisieren mit ihrem spezifischen Probe. Die mit einem Laser gemessenen Hybridisierungssignale in jeder Position des Arrays geben exakt Aufschluss darüber, um welchen Grad sich die Expression des zugehörigen Gens verändert hat und wie sich dies in der veränderten mRNA-Gesamtmenge ausdrückt. So lässt sich auch die Expression von unterschiedlichen Genen zu unterschiedlichen Zeitpunkten untersuchen. Die Möglichkeit, auf relativ einfache Art die simultane Expression tausender Gene qualitativ und quantitativ zu erforschen, bietet ein ungehe ures Potential, wenn es darum geht, die äusserst hohe Komplexität des Metabolismus und der Regulation eines so einfachen Organismus wie E. coli mit seinen 4.000 Genen zu verstehen oder eines weitaus komplizierteren wie den Menschen mit seinen rund 75.000 Genen.

4.2 Identifizierung von Organismen

DNA-Chips lassen sich auch zur Identifizierung von Organismen verwenden. Man kann die fragmentierte genomische DNA eines bestimmten Organismus als Sonde benutzen, um über die Unterschiede im Hybridisierungsmuster nahe verwandte Stämme zu differenzieren. Das erlaubt eine schnelle Identifikation von pathogenen Viren oder Bakterien und die rasche Erkennung spezifischer Stämme oder Mutanten dieser Organismen. Die Technik ist auch nützlich, wenn es darum geht, bestimmte Organismen in mikrobiellen Lebensgemeinschaften unter natürlichen Umweltbedingungen zu bestimmen und zu quantifizieren, ein häufiges Ziel der mikrobiologisch orientierten Ökologen [BROCK00].

4.3 Identifizierung von Geweben und Krebstypen in der Histopathologie Expressionschips wurden unter anderem bereits zur Klassifizierung histopathologisch oder immunhistologisch schwer differenzierbarer maligener Melanome [BITT00], zur molekularen Klassifizierung von distinkten Formen akuter Leukämie [GOLUB99] und

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zur Unterscheidung klinisch heterogener diffuser grosser B-Zell Lymphome eingesetzt [ALIZA00]. Im letzterem Beispiel wurde ein besonderer „Lympho-Chip“ verwendet. Dieser Chip trägt nahezu 18.000 cDNA probes, zwei Drittel davon stammen aus einer cDNA-Bibliothek, die aus B-Zellen hergestellt wurden. Die übrigen probes entsprechen cDNA von Genen, die in Lymphozyten- und Tumorbiologie impliziert sind. Die Hybridisierung des Array erfolgt mit fluoreszenzmarkierter cDNA, die mit der aus Patienten B-Zellen isolierten mRNA hergestellt wurde. Anhand des Expressionsmusters liessen sich so zwei genetisch unterschiedliche Formen des Lymphdrüsenkrebs bestimmen, die unterschiedlich therapiert werden müssen.

Solche cDNA Arrays sind besonders bei höheren Eukaryonten ein wichtiger Ansatz, genomische Probes für die Immobilisierung auf Chip herzustellen [GRIFF99].

5 Nachteile der cDNA-basierten Technik

Wenn cDNAs im grossen Stil über bakterielle Plasmide amplifiziert werden, besteht die Gefahr der Kontamination. Bei der Synthese von Oligos für Chipzwecke ist die Qualität der hierfür verwendeten Datenbanksequenzen ein Faktor.

Des weiteren ist die Reinheit der RNA ein weiterer nicht zu vernachlässigender Faktor, von der ebenfalls eine grosse Menge für die Hybridisierung benötigt wird. Um ein an-ständiges Ergebnis zu erzielen, wird eine Menge von 50-200 µg pro Target und Array benötigt. Die Reinheit des Ausgangsmaterial ist entscheidend, jedoch hat man oft nur wenig Ausgangsmaterial, wenn man an Anwendungen wie die Tumorklassifizierung denkt.

Die im Gegensatz zu oligonukleotidbasierten Arrays nicht quadratischen Spots stellen eine hohe Anforderung an die dem Experiment folgende Image-Analyse.

6 Zusammenfassung

Nach Vorstellung der Grundlagen cDNA-basierter Microarraytechnologie sowie deren Herstellung und Anwendungen wird deutlich, dass sich diese als echte Alternative zur Affymetrix-Technologie durchgesetzt hat und auch weiterhin durch viele Labors unterstützt und unterstützt werden wird. Viele interessante Entwicklungen spielen sich zur Zeit in diesem Bereich ab, und eine fortschreitende technische Entwicklung eröffnet noch viele interessante Möglichkeiten.

Die Kosten für die Bauteile einer selbstgefertigten Microarraystation belaufen sich mit Steuerrechner, der hier natürlich auch ein ausgedienter PC der 386-Reihe sein kann, auf ca. 12.000US$ [BROWN02].

Eine komplette Ausstattung von Affymetrix ist für nichtakademische Labore ab 199.000US$ zu erwerben [AFFYM01], Institutionen aus Forschung und Lehre wird jedoch Rabatt gewährt. Zu den Hardwarekosten kommt dann aber auch noch die Software, die nochmals mit einem Preis von 24.000US$ für ein Data Mining Tool und 18.000US$ für eine 5-Benutzer-Lizenz einer Analyse-Software zu Buche schlägt. Weiterhin sind die Arrays ein kostspieliger Faktor, so bezahlt man für einen „Human Genome U95Av2 Array“ etwa 2.000US$.

cDNA-Microarrays sind also eine kostengünstige Variante zu kommerziellen Arraysystem, die sich preislich auf das 10- bis 100-fache belaufen, das „Linux der Arraytech- nologie“.

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Literatur

[AFFYM01] http://microarray.cpmc.columbia.edu/docs/us_pricing_oct_1_2001.pdf [ALIZA00] Alizadeh et al., Nature 2000, 403: 503-511 [BITT00] Bittner et al., Nature 2000, 406: 536-540

[BROCK00] Brock Biologie of Microorganisms 9/e, M.T. Madigan, J.M. Martinko, J. Parker. Prentice-Hall, Inc.

[BROWN02] http://cmgm.stanford.edu/pbrown/mguide/partslist.html [CASEY77] Rates of formation and thermal stabilities of RNA:DNA and DNA:DNA duplexes at high concentrations of formamide, J. Casey & N. Davidson, Nucl. Acid Res. 4, 1539-1545 (1977).

[CHEUN99] Making and reading microarrays, V.G. Cheung, M. Morley, F. Aguilar, A. Massimi, R. Kucherlapati, G. Childs. Nature Genetics Supplement Vol. 21, January 1999, p. 15 - 19.

[DERIS97] Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale, J.L. DeRisi et al., Science 1997, issue 278, p. 680 - 686. [DUG99] Expression profiling using cDNA microarrays, D.J. Duggan, M. Bittner, Y. Chen, P. Meltzer, J.M. Trent. Nature Genetics Supplement Vol. 21, January 1999, p.10 - 14.

[EKINS99] Microarrays: their origins and applications, Roger Ekins, Frederick W. Chu. Tibtech Vol. 17, June 1999, p. 217 - 218. [GOLUB99] Golub et al., Science 1999, 286: 531-537

[GRIFF99] Modern Genetic Analysis, Anthony J.F. Griffiths et al, W.H. Freeman and Company 1999.

[HARRI00] Injecting new ideas into microarray printing, T.M. Harris, A. Massimi, G. Childs, Nature Biotechnologie Vol.18 April 2000, p. 384 - 385. [KHAN99] Expression profiling in cancer using cDNA microarrays, J. Khan, L.H. Saal, M.L. Bittner, Y. Chen, J.M. Trent, P.S. Meltzer. Electrophoresis 1999, issue 20, p. 223 - 229. [NHGRI02] http://genome.nhgri.nih.gov/arraydb/

[OKAMO00] Microarray fabrication with covalent attachment of DNA using Bubble Jet Technology, T. Okamoto, T. Suzuki, N. Yamamoto. Nature Biotechnology Vol. 18, April 2000, p. 438 - 441.

[WODIC97] Genome-wide expression monitoring in Saccharomyces cervisiae, L. Wodicka et al., Nature Biotechnology Vol. 15, 1997, p. 1359 - 1367.