Experiment: Vitaminbestimmung durch Trübungsmessung

Einleitung

Konzentration bestimmter Stoffe lassen sich sowohl durch chemische Methoden (z.B. in der Industrie) als auch durch mikrobiologische Methoden bestimmen, z.B. durch Turbidimetrie (Messung des Wachstums des Mikroorganismus) oder Acidimetrie (Messung der vom Bakterium gebildeten Säure, meistens Milchsäure). Bei der Turbidimetrie nehmen Mikroorganismen die zu analysierende Substanz, ein für sie essentieller Nährstoff, und wachsen proportional zu dieser Substanzkonzentration. Diese Methode wird im vorliegenden Experiment verwendet, um die Konzentration von Nikotinsäure in Bier/Saft (Analysenlösung) zu bestimmen. Dazu wird das Bakterium Lactobacillus plantarum ATCC 8014 ausgewählt. Andere Mikroorganismen wie Proteus vulgaris, Leuconostoc mesenteorides, Acetobacter suboxydans, u.a. sind auch geeignet.

Relevante Materialien und Versuchsdurchführung

Flüssigkeitskultur von Lactobacillus plantarum ATCC 8014 (bei 37°C 24h bebrütet), Bier/Saft (Analysenlösung) bis pH 7 verdünnt, Nikotinsäure-Standardlösung, Testmedium. Es wird mit unterschiedlichen Konzentrationen der Standardlösung eine Standardkurve (Eichkurve) gebildet, mit der die Konzentration der Analysenlösung graphisch bestimmt wird. Es wird nach dem u.g. Pipettierschema vorgegangen. Röhrchen Nr. 1 dient als Nullwert.

Für die Trübung der Röhrchen und die photometrische Messung wird ca. 24h bei 37° C inkubiert.

Ergebnisse Tatsächliche OD- Werte der Trübung:

(Eichkurve und graphische Bestimmung der Lösung unbekannter Nikotinsäurekonzentration siehe Millimeterpapier)

Die OD-Werte von Röhrchen Nr.8-10 befinden sich nicht im linearen Bereich der Eichkurve und werden für die Bestimmung der Konzentration der Analysenlösung nicht berücksichtigt. Aus Röhrchen Nr. 11 ergibt sich eine Konzentration der Analysenlösung von 0,0065 µg/ml. In diesem Röhrchen wurden 4 ml der Analysenlösung verwendet, also 0,0065 µg Nikotinsäure in 4ml und unter Berücksichtigung der verwendeten Verdünnung für Herstellung der Analysenlösung (1:100, s. Skript) ergibt sich eine Nikotinsäurekonzentration von 0,1625 µg/ml in Bier/Saft: 0,0065µg/4ml·100= 0,1625 µg/ml in Bier/Saft

Diskussion

Die zu analysierenden Konzentration kann nur im linearen Bereich berechnet werden. Außerhalb des linearen Bereichs entspricht der Trübungsgrad von Lactobacillus nicht mehr der Aufnahme von Nikotinsäure.

Man muss im Experiment damit rechnen, dass andere äußere Faktoren das Wachstum des verwendeten Mikroorganismus nicht beeinträchtigt. Deswegen wurde das Bier bis auf pH 7 verdünnt und alle Materialien sterilisiert.

Turbidimetrie und andere mikrobiologische Methoden eignen sich besonders für Bestimmung sehr kleinen Konzentrationen (im µg-Bereich), wie die von Nikotinsäure im Bier (unsere Analysenlösung: 0,0065 µg/ml).

Experiment: Lokalisierung eines Biosyntheseblocks von Mangelmutanten durch einen Wachstumstest Einleitung

Bildet man in einem bestimmten Schritt innerhalb der Aromatenbiosynthese (s.u.) einen genetischen Block, so wird ein bestimmter Stoff in einem Mikroorganismus kumuliert. In diesem Experiment soll die Lage des genetischen Blocks innerhalb der Aromatenbiosynthese festgestellt werden.

Relevante Materialien und Versuchsdurchführung

Mutantenstämme von Saccharomyces cervisiae: HK11, HK 51, HK78 und HK 145 (Nur eine von diesen wird pro Gruppe untersucht). Zwischenprodukte der Aromatenbiosynthese, die als Wuchsstoffe dienen: Anthranilsäure, Indol, Phenylalanin, Shikimisäure, Tryptophan, Tyrosin, p-Aminobenzoesäure. Minimalmedium.

Um den genetischen Block im Biosyntheseweg zu finden, muss man folgendes wissen: Die Mutanten können nur weiter leben und sich vermehren, wenn sie die 4 Endprodukte Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan und p-Aminobenzoesäure zur Verfügung haben, entweder selbst synthetisiert oder vom Medium entzogen. Es werden verschiedene Kombinationen dieser Wuchsstoffe angesetzt, sodass die Lage des genetischen Blocks zu finden ist. Es ergibt sich 10 Kombinationen für dieses Experiment (s. Kombinationen im Abschnitt Ergebnis). Indikator ist der Wachstum oder Nichtwachstum der Mutante.

Ergebnisse

+,++,+++ = Grad Der Trübung; - = keine Trübung

Der Test wurde doppelt ausgeführt, inklusive Kontrolle (Röhrchen Nr. 1). Man kann feststellen, dass die Mutante in Röhrchen 3, 4 und 5 wachsen könnte. Wachstum in Röhrchen 5 war zu erwarten, es enthält alle zum Leben benötigten Aromaten. Mit Wachstum im Röhrchen 4 lässt sich vermuten, dass der genetischen Block entweder im Biosyntheseweg von Tyrosin oder Phenylalanin liegt. Mit Wachstum im Röhrchen 3 ist sicher, dass der Block in einem Syntheseschritt für Phenylalanin liegt, der die Synthese der anderen 3 Aromaten nicht stören soll. Dieser Schritt kann nur der Syntheseschritt zwischen Prephensäure und Phenylalanin sein. Das Nichtwachstum in den restlichen Röhrchen bestätigen, dass der genetische Block nur in den genannten Syntheseschritt liegt. Wäre z.B. bei Röhrchen 6 (Shikimisäure) Wachstum vorhanden, dann könnte man festgestellt haben, dass die Mutante keinen genetischen Block besitzt, was nicht der Fall ist.

Diskussion

Die Methode kann für das Finden solcher genetischen Blöcke in bereits aufgeklärten Biosynthesewegen angewendet werden. Wichtige Voraussetzung ist, dass der Mikroorganismus tatsächlich die in den Ansätzen verwendeten Wuchsstoffen problemlos aufnehmen kann, wie in diesem Fall (die verwendeten Metaboliten in dem Versuch können durch die Zellwand der Mutanten von S. cerevisiae durchgehen).

Eine andere Alternative für die Bestimmung des genetischen Blocks in dem Experiment wäre, wenn man Prephensäure statt Tyrosin zur Verfügung hätte. In einem Röhrchen mit Minimalmedium und Prephensäure wäre die Mutante auch nicht gewachsen, und mit dem Ergebnis des positiven Wachstums im Röhrchen mit Phenylalanin wäre man auch zum gleichen Schluss gekommen.