Formale Gleichung des Fluxes

Jp = Qpp_pp + + QprJr

J p : aktiver flux der Partikel p

_ pp : elektrochemischer Gradient der Partikel p

Q pp : Proportionalitätskoeffizient (Permeabilitätskoeffizient der einfachen physikalischen Diffusion) J q : Flux einer anderen Partikelspezies q

Q pq : Proportionalitätskoeffizient - abhängig von den Eigenschaften der Transportsysteme p und q

J r : Wirkung einer chemischen Reaktion r

Q pr : Proportionalitätskoeffizient der Wechselwirkungen zwischen J p und J r

I Q pq und Q pr = 0 · passiver Vorgang

II einer dieser Koeffizienten _ 0 · J p wird aktiver Flux

a Q pr _ 0 · primär aktiver Transport ,d.h. direkte

Wechselwirkung zwischen chemischer Reaktion r und

Transportsystem für p

b mindestens einer der Terme Q pq _ 0 · sekundär aktiver

Transport,

d.h. Flux J p gekoppelt an einen aktiven Transport o. schon bestehenden Gradienten einer anderen Partikelspezies q.

II PEP-Phosphotransferase-System

Dieses System der Bakterien (untersucht an E.Coli) ist ein Beispiel für eine Substratmodifikation. Es funktioniert ähnlich wie die cytoplasmatische Hexokinase-Reaktion, es handelt sich hierbei jedoch um eine vektorielle Phosphorylierung. Dabei dient PEP als Energielieferant und kann nicht durch ein anderes energiereiches Intermediat ersetzt werden. Der Vorteil dieses Transportsystem ist, dass die Substrate nach dem Transport schon phosphoryliert vorliegen. Jedoch liegen bei Bakterien neben diesem Transportsystem noch zahlreiche weitere vor.

Reaktionsschritte

1. PEP + HPr P~ HPr + Pyruvat

2. P~ HPr + Zucker Zucker - P + HPr

Mechanismus

PEP : Phosphoenolpyruvat ; Pyr : Pyruvat ; HK : Hexokinase

HPr : Hitzestabiles Protein des Systems ; HPr~P : Phosphorylierte Form des Proteins E I ,E II : Enzymkomplexe I,II (nur E II substratspezifisch) [ ] i , [ ] e : intra - bzw. extrazellulär Aufbau des Enzymkomplexes II:

E IIA , E IIB : Protein E IIA (für Substraterkennung verantwortlich), Protein E IIB

PG : Phosphatidylglycerin

III Na + - Pumpe

Die Na ⁺ - Pumpe ist das bei höheren Tieren am meisten verbreitetste Transportsystem und es erfüllt ein Fülle von Funktionen. Dieses Transportsystem transportiert im Antiport Na ⁺ aus der Zelle und K ⁺ in die Zelle und sorgt so außerhalb der Zell für eine 10 -20 * höherer Konz.

von Na ⁺ als innerhalb(umgekehrt bei K ⁺ ). Die Na ⁺ - Pumpe sorgt durch Bildung des Membranpotentials für die Erregbarkeit der Neurone, durch die osmotische Wirkung des Na +

- Gradienten wird das Zellvolumen bestimmt und der Gradient liefert die Energie für eine Fülle von sekundär aktiven Transportprozessen, wie z.B die Versorgung der Zellen mit Zuckern und Aminosäuren. Normale Zellen benötigen bis zu 1/3 ihrer Gesamtenergie für die Na ⁺ - Pumpe, die Neurone sogar bis zu 2/3. Die Energie liefert das ATP, das durch die NA ⁺ /K ⁺ -ATPase hydrolytisch

gespalten wird. Pro Molekül ATP werden 3 Na ⁺ und 2 K ⁺ transportiert und die ATPase spaltet pro sec. bis zu 100 Moleküle ATP.

Die ATPase kann auch umgekehrt werden: Erhöht man den Na ⁺ /K ⁺ -Gradienten so weit, dass die Energie dieses elektrochemischen Gradienten höher ist als die Energie der ATP-Hydrolyse, so folgen die Ionen dem Gefälle ihres Gradienten und die ATPpase bildet ATP aus ADP und P. Durch das Digitalis-Gift Ouabain wird die NA ⁺ /K ⁺ -ATPase gehemmt, da es mit K ⁺ um die Bindungsstelle konkurriert.

Die ATPase besteht aus einem grossen Multi-Pass Transmembranprotein, das die Bindungsstellen für Na ⁺ und K ⁺ trägt und die katalytische Untereinheit darstellt und einem kleinen damit assoziierten Glykoprotein.

IV H + - Pumpen in Tonoplast und Plasmalemma

Ein erster Hinweis auf das Vorhandensein von H ⁺ -Pumpen in pflanzlichen Membranen (außer Thylakoid - u. Mitochondrienmembran) war der Befund,dass verschieden Pilze (Hefen, Neurospora), ihr Außenmedium ansäuern, indem sie Protonen aus - u. K ⁺ einschleusen, was eine Hyperpolarisierung des Membranpotentials zur Folge hat. Der Zusammenhang zwischen H ⁺ -Transport und Hyperpolarisation wurde gezeigt mit Versuchen mit protonophoren Entkopplern ( Bsp. DNP):Dies sind lipidlösliche ,schwache Säuren, die als H ⁺ -Carrier wirken und eine alternative Bahn durch die Membran bilden, wodurch die Protonen wieder durch passive Diffusion in die Zellen gelangen und der Gradient verloren geht.

In der inneren Mitochondrienmembran hat dies die Vergeudung der protonen-motorischen Kraft zur Folge, so dass kein ATP mehr gebildet werden kann. Dies, sowie Versuche mit ATPase-Inhibitoren zeigte zudem, dass die Energie für den Transport durch das ATP bereitgestellt wird und eine ATPase erforderlich ist. Die ATPase wurde untersucht und zeigte bestimmte Eigenschaften:

- Spezifität für ATP*Mg ²⁺ (Co ²⁺ , Mn ²⁺ , Ni ²⁺ , Zn ²⁺ als Ersatz für Mg ²⁺ )

- Optimale Aktivität bei pH 5.5 - 6.5

- Aktivierung durch einwertige Kationen, bevorzugt K ⁺ , Rb +

- Hemmung durch Vanadiumoxid, DES, DCCD,

- Unempfindlich gegen Azide, Oligomycin, Nitrat

- Stöchiometrie: 1 H ⁺ / 1 ATP - 2 H ⁺ / ATP bei ATP-Knappheit

Es handelt sich bei dem Austausch von H ⁺ und K ⁺ ume eine rein elektrische Kopplung, d.h. nur die Protonen werden direkt über diese Pumpe transportiert.

Der Hinweis auf das Vorhandensein einer H ⁺ -Pumpe im Tonoplasten, war die Messung eines pH - und elektrochemischen Gradienten ( innen positiv !) über dieser Membran. Dies konnte bestätigt werden durch Versuche an isolierten Vakuolen: Es wurde eine ATP- abhängige Protonenpumpe gefunden, die H ⁺ importiert und sich von der Protonenpumpe des Plasmalemmas in einigen Punkten unterscheidet:

- ATP wird bevorzugt, kann aber durch andere Nucleosid-Triphosphate ersetzt werden

- Hemmung durch Nitrat

- Unempfindlich gegen Vanadiumoxid

Auch in höheren Pflanzen wurden H ⁺ -Pumpen in Plasmalema und Tonoplast gefunden: Bei der Aufnahme von Salzen ,etwa K ⁺ , wurden H ⁺ ausgeschleust, was zu einer Hyperpolarisierung des Membranpotentials führte.

Die Alkalisierung des Cytoplasmas wird durch die Fixierung von CO 2 durch PEP verhindert, denn dabei entsteht zunächst Oxalacetat und daraus wiederum Malat, welches dissoziiert vorliegt (C 4 -Pflanzen).

Durch Versuche mit ATPase Inhibitoren und dem Welketoxin Fusicoccin konnte schließlich gezeigt werden, dass der Ionen-Austausch eine Hyperpolarisation des Membranpotentials verursacht ,abhängig vom intakten Stoffwechsel und somit vom Vorhandensein von ATP ist. Durch Messung des Membranpotentials über Plasmalemma uns Tonoplast, Messung des pH-Wertes in Zellsaftvakuole und Cytoplasma, sowie durch Überprüfung der Affinität zu FC wurde gezeigt, dass sich diese H ⁺ -Pumpe im Plasmelemma befinden muss. Die ATPase zeigt die gleichen Eigenschaften wie die Plasmallema-ATPase der Pilze. Ebenso wie in Pilzen ist die Kopplung zwischen H ⁺ /Kation rein elektrisch. Anhand von Versuchen mit Vesikeln aus verschiedenen Membranen wurde eine weitere protonenpumpende ATPase gefunden, die sich im Tonoplasten befindet, H ⁺ -Einschleust , zur Depolarisierung des Membranpotentials führt und gleiche Eigenschaften wie die Tonoplasten-ATPase der Pilze zeigt.

In verschiedenen Pflanzenzellen konnte eine Redox-getriebene H ⁺ -Pumpe gefunden werden, bei der Elektronen von NADH auf O 2 als finalen Akzeptor übertragen werden. Das Produkt der H ⁺ -Pumpen ist ein elektrochemischer Protonengradient über Plasmalemma und Tonoplast. Die daraus resultierende protonen-motorische Kraft wird für eine Fülle sekundär aktiver Transporte genutzt.

Die Änderung der H ⁺ -Pumpen -Aktivität und somit die pH-Wert- Änderung haben großen Einfluss auf die molekulare Zusammensetzung:

a) Zellsaftvakuole

b) Cytoplasma

c) interzellulären Raum

Durch die molekulare Zusammensetzung (Ionen , Säuren, Hormone...)

werden der Stoffwechsel und die Wachstumsprozesse entscheidend beeinflusst.

Auch die Stomata werden durch den H ⁺ /K ⁺ -Transport geöffnet oder geschlossen, indem die K ⁺ -Konz. Den Turgor der Schließzellen beeinflusst.

Die Aktivität der Protonenpumpen wird beeinflusst von:

- Membranpotential

- pH - Wert

- Hormonen ( vor allem wichtig bei Wachstumsprozessen)

- Stoffwechselprodukten

Die obige Abbildung zeigt den allgemeinen Mechanismus der H ⁺ -Pumpe.

V Purpurmembran

Die Arten der Archaebakteriengattung Halobacterium haben eine besondere Art der Protonenpumpe entwickelt:

In die Cytoplasma-Membran sind dunkelrote Flecken eingelagert: die Purpurmembran. Die Farbe beruht auf dem Gehalt an Bacteriorhodopsin, ein Molekül, das eine Protonenpumpe mit Photonenantrieb darstellt. Durch Absorption von Licht werden Protonen aus der Zelle transportiert und so ein elektrochemisches Potential über der Membran aufgebaut. Die protonen-motorische Kraft kann dann z.B. für die ATP-Synthese genutzt werden. Der Mechanismus des Bacteriorhodopsins beruht auf lichtabhängigen Konformationsänderungen , die die Wechselwirkungen zwischen Retinal und Proteinumgebung ändern.

Literatur:

HÖFER : Transport durch biologische Membranen ,Verlag Chemie , 1977 ALBERTS et al.: Molekularbiologie der Zelle 3.Auflage , Verlag Chemie , 1995 MARRE & BALLARIN-DENTI :The Proton Pumps in the Plasmalemma and the Tonoplast of Higher Plants in : Journal of bioenergetics , Vol. 17 , 1985 SCHLEGEL: Allgemeine Mikrobiologie, Thieme Verlag , 1992

BÜLDT: Bacteriorhodopsin - Mechanismus einer Protonenpumpe mit Photonenantrieb in: Biologie in unserer Zeit 6/2000