Institut für
Biologische Chemie und Ernährungswissenschaft
der Universität Hohenheim

Diplomarbeit des Studiengangs Ernährungswissenschaft

Einfluss von Ethanol auf die Aufnahme von Cyanidin-3-O-ß-D-Glucosid (Weininhaltstoff) am isoliert perfundierten Rattendünndarm
Vorgelegt von Konstanze Frank

2001

Table of Contents

1 EINLEITUNG ... 2
1.1 Einordnung der Anthocyane ... 2
1.2 Vorkommen und tägliche Aufnahme von Flavonoiden ... 3
1.3 Strukturen ... 3
1.4 Wirkung ... 4
1.5 Absorption und Metabolismus von Flavonoiden/ Anthocyanen/ Cyanidin-3-O-β-D-Glucosid ... 6
1.6 Zielsetzung ... 7

2 MATERIAL ... 8
2.1 Versuchstiere und Haltungsfutter ... 8
2.2 Arzneimittel und Geräte für die Perfusionen ... 8
2.3 Chemikalien ... 10
2.4 Geräte ... 12

3 METHODEN ... 14
3.1 Die Dünndarmperfusion ... 14
3.1.1 Einführung und Technik ... 14
3.1.2 Perfusionsmedien ... 17
3.1.3 Apparativer Aufbau des Perfusionsmodells ... 18
3.1.4 Versuchsdurchführung ... 20
3.2 Analytische Methoden ... 22
3.2.1 Bestimmung der Viabilitätsparameter ... 22
3.2.2 Bestimmung von Cyandin-3-Glucosid mittels RP-HPLC ... 23
3.2.3 Enzymatische Umsetzung der Glucuronide und Sulfate ... 28
3.2.4 Überprüfung der Methode der Glucuronid- und Sulfatspaltung mittels p-Nitrophenol und dessen Konjugate ... 29
3.3 Aufarbeitung der Proben und Gewebe ... 33
3.3.1 Aufarbeitung der venösen Perfusionsproben ... 33
3.3.2 Aufarbeitung der luminalen Perfusionsproben ... 33
3.3.3 Aufreinigung des perfundierten Darmgewebes ... 34
3.3.4 Aufreinigung der Mesenterialgefäße ... 35
3.4 Vorversuche/ Zusatzversuche ... 35
3.4.1 Stabilität von Cyanidin-3-O-β-D-Glucosid in luminaler Lösung ... 35
3.4.2 Stabilität von Cyanidin-3-O-β-D-Glucosid gegenüber den Enzymen für die Glucuronid- und Sulfatspaltung bei 37 °C ... 38
3.4.3 Wiederfindung von Cyanidin-3-O-β-D-Glucosid aus dem Darm ... 39
3.4.4 Überprüfung der Kontrollperfusionen auf Cyanidin-3-O-β-D-Glucosid-Freiheit ... 39
3.5 Berechnungen und Statistik ... 40
3.5.1 Berechnung der Fluxe ... 40
3.5.2 Berechnung der Substrat-Konzentrationen ... 41
3.5.3 Statistische Auswertung ... 41

4 Ergebnisse ... 42
4.1 Viabilität ... 42
4.2 Kontrollperfusionen ... 45
4.3 Cyanidin-3-O-β-D-Glucosid-Perfusionen ... 46
4.3.1 Darstellung der einzelnen C3G-Perfusionen ... 46
4.3.2 Darstellung der einzelnen C3G-EtOH-Perfusionen ... 50
4.4 Gesamtüberblick der Aufnahme an Cyanidin-3-O-β-D-Glucosid in allen Perfusionen ... 55
4.5 Gesamtüberblick der Wiederfindung an Cyanidin-3-O-β-D-Glucosid in allen Perfusionen ... 55
4.6 Gesamtaufnahme [%] aller Perfusionen mit Cyanidin-3-O-β-D-Glucosid ... 56
4.7 Ergebnisüberblick ... 57
4.8 Histologische Befunde ... 61

5 Diskussion ... 63

6 Zusammenfassung ... 67

Literaturverzeichnis ... 68

Anhang ... 75

Tabellen

[...]

Abbildungen

[...]

Anhang

[...]

1 EINLEITUNG
Was macht Blüten und Früchte so farbenfroh? Wer schon einmal mit Anthocyanen gearbeitet hat, kann dies leicht erkennen, (u. a. an seinen Fingern beim Versuch ein Vorratsgläschen von Cyanidin-3-O-ß-D-Glucosid zu öffnen). Anthocyane sind eine Gruppe von chemisch verwandten, wasserlöslichen, blauen, violetten und roten Farbstoffen, die neben anderen Substanzen (Betalaine, Carotinoide) diese charakteristischen Färbungen hervorrufen [8]. Sie sind im Pflanzenreich weit verbreitet. Ihr Name wurde vom griechischen: anthos = Blüte und kyanos = blau abgeleitet [8].

1.1 Einordnung der Anthocyane
Anthocyane zählen zu den Flavonoiden, also den polyphenolischen Verbindungen [44]. Derzeit sind mehr als 8000 dieser polyphenolischen Verbindungen bekannt [6]. Als eine der wichtigsten Untergruppen werden die Flavonoide angesehen [6]. Sie alle fallen unter den Begriff der sekundären Pflanzenstoffe. Das heißt, sie werden im Sekundärstoffwechsel der Pflanze gebildet im Gegensatz zu den primären Pflanzenstoffen wie Kohlenhydrate, Proteine, Fette und Ballaststoffe, welche Produkte des Primärstoffwechsels der Pflanzen sind [44].

Als wichtige der bisher 13 definierten Untergruppen der über 5000 Flavonoide lassen sich neben den Anthocyanen Flavone, Flavonole, Flavanole, Flavanone, Catechine und Isoflavone nennen [6,22,42].

Natürlicherweise liegen Anthocyane als Glykoside vor. In der Regel sind an die Aglykone Monosaccharide gebunden, die sich mit verdünnten Säuren oder enzymatisch abspalten lassen [8]. Die Verwandtschaft von Glykosid und Aglykon drückt sich zumeist auch in ihren Namen aus (z. B. Cyanidin und Cyanidin-3-O-ß-D-Glucosid).

1.2 Vorkommen und tägliche Aufnahme von Flavonoiden
Reich an Flavonoiden sind Nahrungsmittel wie z. B. Zwiebeln, Grünkohl, Bohnen, Broccoli, Johannisbeeren, Tee, Weintrauben und Wein [6].

Cyanidin-3-Glycosid ist das am weitesten verbreitete Anthocyan im Pflanzenreich [25] und somit in Feldfrüchten, Bohnen, Früchten, Gemüse und Rotwein zu finden [39]. Für einen italienischen Rotwein ermittelte Ghiselli et al einen C3G-Gehalt von 38 mg/ L [12]. In einem kalifornischen Rotwein wurden z.B. 2,8 mg/ L C3G gefunden [4]. Die Gesamtphenolgehalte von Weißweinen beliefen sich auf 199- 242 mg/ L, für Rotweine lagen die Werte um das zehnfache höher (2057- 2567 mg/ L) [4].

Über die tägliche Aufnahme lässt sich nur schwer eine verlässliche Aussage treffen. Die Literaturwerte variieren stark. Die Angaben reichen von 2,6 mg Flavonoiden pro Tag gemessen in Finnland [17] bis zu 1 g/d, was der von Kühnau in den 70er Jahren aufgestellten Schätzung für die Flavonoid-Aufnahme in den USA entspricht [22]. Allerdings ist man sich heute weitgehend einig, dass letzterer Wert zu hoch gegriffen ist und begründet das, mit den unzureichenden Analysenmethoden zur damaligen Zeit [6]. Des Weiteren findet sich bei Hertog et al ein Wert von 23 mg/d. Als Quellen für die Flavonoide werden hierbei vor allem Tee, Zwiebeln und Äpfel angegeben [16].

[...]

[4] Böhm,H. (2000) Das Französische Paradoxon- Gesundheit durch Phenole des Weins? Teil 1+2 Ernährungsumschau 47, Heft 2+3, 44-49, 92-100

[6] Bravo, L. (1998): Polyphenols: Chemistry, Dietary Sources, Metabolism, and Nutritional significance; Nutrition Reviews, vol. 56, 11, 317-333

[8] CD Römpp Chemie Lexikon- Version 1.0, Georg Thieme Verlag 1995, Stuttgart/ New York

[12] Ghiselli, A., Nardini, M., Baldi, A., Scaccini, C. (1998): Antioxidant activity of different phenolic fractions separarted from an Italian red wine; J. Agric. Food Chem. 46, 361-367

[16] Hertog, M. Hollmann, P., Martijn, K., Kromhout, D. (1993): Intake of Potentially Anticarcinogenic Flavonoids and Their Determinants in Adults in The Netherlands; Nutr. Cancer, 20, 21-29

[17] Hertog, M., Kromhout, D., Aravanis, C. et al (1995): Falvonoid Intake and Long-term Risk of Coronary Heart Disease and Cancer in the Seven Countries Study; Arch Intern Med, vol.155, 381-386

[22] Kühnau, J.(1976): The Flavonoids- A Class of Semi-Essential Food Components: Their Role in Human Nutrition; World Rev. Nutr. Diet, vol. 24, 117-191, Verlag Karger, Basel

[25] Miyazawa, T., Nakagawa, K., Kudo, M., Muraishi, K,. Someya, K (1999): Direct intestinal absorption of red fruit anthocyanins, cyanindin-3-glucoside and cyanidin- 3,5-diglucoside, ito rats and humans; J. Agric. Food Chem., 47, 1083-1091

[39] Tsuda, T., Horio, F., Kitoh, J., Osawa, T. (1999): Protective Effects of Dietary Cyanidin 3-O-b-D-Glucoside on Liver Ischemia-Reperfusion Injury in Rats; Archives of Biochemistry and Biophysics, vol.368, 2, 361-366

[44] Watzl, B., Leitzmann, C. (1995): Bioaktive Substanzen in Lebensmitteln; Hippokrates Verlag, Stuttgart