Mikrobiologische Übungen - Mikrobiologisches Praktikum

Inhaltsverzeichnis

1 Methoden der Keimisolierung/Keimzahlbestimmung
1.1 Lebendzählung
1.1.1 Koloniezählung nach dem Oberflächenausstrich
1.1.2 Koloniezählung nach dem Gussverfahren
1.2 Partikelzählung

2 Differenzierung von Bakterien
2.1 Morphologie
2.1.1 Bestimmung der Kolonie-Morphologie
2.1.2 Mikroskopische Bestimmung von Zellmorphologie und Be- weglichkeit
2.2 Die Bakterielle Zellwand
2.2.1 Gram-Färbung
2.2.2 Test auf extrahierbare DNA (KOH-Test)
2.3 Wachstum und Stoffwechsel von Bakterien
2.3.1 Aerobes/Anaerobes Wachstum
2.3.2 Test auf Cytochrom Oxidase
2.3.3 Katalase Test

3 Isolierung von Mikroorganismen
3.1 Enterobakterien und Coliforme Keime
3.1.1 Nachweis coliformer Keime durch Anreicherung in doppelt konzentrierter Laktose-Pepton Bouillon
3.1.2 Nachweis coliformer Keime durch Direktansatz auf VRB Agar
3.2 Sporenbildener
3.2.1 Endosporen aerober Sporenbildner
3.3 Schimmelpilze und Hefen
3.3.1 Isolierung von Schimmelpilzen und Hefen
3.4 Nachweis von Chlostridien
3.4.1 Nachweis von Chlostridien im Weinzierl-Test)

4 Identifizierungsmethoden für Mikroorganismen
4.1 Biochemische Identifizierung
4.1.1 Identifizierung von Gram-negativen (Entero) Bakterien mit dem Testsystem BBL Enterotube II
4.2 Immunologische Identifizierung

5 Bakterielle Viren
5.1 Isolierung von Bakteriophagen aus der Umwelt

6 DNA-Transfertechniken
6.1 Transduktion von Bioluminiszenz durch den modifizierten Liste- ria Bakteriophagen A511 : : luxAB
6.2 Transformation von E.coli mit pGreenTIR
6.3 Konjugation

7 Mikroorganismen als Modellorganismen
7.1 Mutation und Abtötung

8 Literatur

Kapitel 1 Methoden der Keimisolie- rung/Keimzahlbestimmung

Oftmals ist es nötig, die Keimzahl einer gegebenen Probe zu bestimmen. Hierzu stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung, die sich grob in Lebendzählung und Partikelzählung unterteilen lassen. Bei der Lebendzellzahlbestimmung wird davon ausgegangen, dass eine lebende Bakterienzelle zu einer zählbaren Kolonie auswachsen kann; da dies nicht immer richtig ist (z.B. bei Bakterien, die als Ag- gregate vorliegen, wie zum Beispiel Sarcina), werden colony forming units (cfu) ermittelt, die kleiner oder gleich der tatsächlichen Zellzahl sein können. Typische Verfahren der direkten Lebendzellzahlbestimmung sind Gussplattenverfahren, Oberflächenverfahren, Glasperlenverfahren bzw. mikroskopische Zählung fluo- reszenzmarkierter Zellen. Bei der indirekten Lebendzellzahlbestimmung werden Verfahren wie Mikrokalorimetrie, Messung der metabolischen Aktivität pro Zeit- einheit (über Änderung der Medienzusammensetzung) oder Bestimmung der Einbaurate isotopenmarkierter Vorstufen wie 3H-Thymidin eingesetzt. Bei der Partikelzählung besteht die Gefahr, dass tote Bakterien sowie Fremdpartikel mitgezählt werden. Zu den direkten Verfahren gehört hier die mikroskopische Zählung mit Hilfe geeigneter Zählkammern, zytometrische Verfahren sowie elek- tronische Zählung und Zellvolumenmessung. Indirekte Verfahren stützen sich auf die Messung der optischen Dichte im Photometer oder die Gewichtsbestim- mung.

1.1 Lebendzählung

Im Versuch sollte die Keimzahl einer Rohmilchprobe bestimmt werden. Hierfür wurden zwei unterschiedliche Verfahren, das Oberflächenausstrichverfahren so- wie das Gussverfahren eingesetzt. Um auszählbare Platten zu erhalten, wurde eine Verdünnungsreihe der zu untersuchenden Suspension mit den Verdünnungsstufen -2 bis -5 angesetzt.

1.1.1 Koloniezählung nach dem Oberflächenausstrich

Durchführung

Von den jeweiligen Verdünnungen wurden jeweils 100µl möglichst gleichmäßig auf Agarplatten ausgestrichen, die über Nacht aerob bei 37◦C inkubiert wurden. Nach der Inkubationsphase wurden die Platten ausgezählt und die Zahl der koloniebildenden Einheiten (cfu) ermittelt.

Daten und Ergebnisse

Beim Auszählen werden eigentlich nur die Platten gewertet, auf denen zwischen 20 und 300 Kolonien gewachsen sind. Deswegen wurden hier nur die Platten der Verdünnungen -2 und -3 gewertet, auch wenn die Koloniezahl bei Verdünnung -2 etwas darüber hinaus geht.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1.1: Ergebnisse der Auszählungen

1.1.2 Koloniezählung nach dem Gussverfahren

Durchführung

Es wurden jeweils 1000µl der Verdünnungsreihe in leere Petrischalen pipettiert und mit noch flüssigem Agar gemischt. Nach Erstarren des Agars wurden die so erhaltenen Platten aerob bei 37◦C über Nacht inkubiert. Anschliessend wurden die Platten ausgezählt.

Daten und Ergebnisse

Beim Gussverfahren haben wir die Verdünnungsstufen -4 und -5 ausgewertet.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1.2: Auszählung Gussverfahren

Auswertung

Zur Berechnung der Koloniebildenden Einheiten wurde folgende Formel verwen- det:

Gewichtetes Mittel:[Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten]

n = Summe aller Kolonien auf den ausgezählten Platten

fa = Zahl der Platten der niedrigsten Verdünnungsstufe, die zur Berechnung herangezogen wird

fb = Zahl der Platten der nächsthöheren Verdünnungsstufe

d = Faktor der niedrigsten ausgewerteten Verdünnungsstufe

Austrichverfahren

Für das Ausstrichverfahren ergab sich der Wert von[Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten]

Gussverfahren

Beim Gussverfahren ergab sich ein Wert von 1,43·10⁷ CbU/ml nach einem Tag:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Diskussion

Wie deutlich zu erkennen ist, unterscheiden sich die beiden Verfahren hinsicht- lich ihres Ergebnisses. Während sich beim Oberflächenausstrichverfahren ein Wert von 4, 2 · 10⁵ cfu/ml Suspension ergibt, liegt dieser beim Gussverfahren mit 1, 43 · 10⁷ cfu/ml Suspension deutlich höher. Allerdings wurden diese Plat- ten bei 37◦C ü.N. inkubiert (statt wie beim Oberflächenausstrichverfahren bei 30◦C ü.N). Desweiteren unterscheiden sich beide Verfahren deutlich in der Ko- loniegröße. Während beim Oberflächenausstrichverfahren nach kurzer Inkubati- onszeit bereits deutliche und auszählbare Kononien festgestellt werden dürften, war es mit erheblichen Schwierigkeiten verbunden, die mit dem bloßen Auge kaum erkennbaren Kolonien beim Gussverfahren auszuzählen. Der höhere cfu- Wert im Gussverfahren deutet auf einen höheren Anteil an mikroaerophilen bzw. anaeroben Keimen in der Suspension hin. Diese wachsen bevorzugt beim Gussverfahren, da die Sauerstoffkonzentration im Agar deutlich geringer ist als beim Wachstum an der Oberfläche. Ein weiterer Grund für die unterschiedli- chen Werte ist auch bei den Arbeitsschritten an sich zu suchen: während beim Gussverfahren die Temperatur des flüssigen Agars niedrig genug ist, um kei- ne Bakterien abzutöten, kann es beim Ausstreichen der Probe durchaus zum Absterben von Bakterien aufgrund zu hoher Temperatur des Drigalski-Spatels kommen.

1.2 Partikelzählung

Ziel war es, die Keimzahl einer Suspension von Sacceromyces cerevisiae zu be- stimmen, indem die Partikel direkt im Phasenkontrastmikroskop bei 40-facher Vergrößerung mit Hilfe einer Thoma-Zählkammer ausgezählt wurden. Die Be- stimmung der Hefekonzentration erfolgt unter Einbezug des definierten Kam- mervolumens und der bekannten Zahl vorhandener Zählquadrate. Um die sta- tistische Sicherheit zu erhöhen, wurden zwei Zählungen durchgeführt, bei denen jeweils 4 Gruppenquadrate (GQ) ausgezählt wurden. Beim Zählen wurde die Konvention befolgt, den linken sowie den oberen Rand in die Zählung mitein- zubeziehen.

Daten und Ergebnisse

Aus dem ermittelten Durchschnittswert von 484 Keimen lies sich die Gesamtkeimzahl der ausgegebenen Zellsuspension bestimmen:

1,952 · 10⁷ Zellen / ml

Der Referenzwert aller Gruppen wird im Mittel mit 2, 5 · 10⁷ Partikel/ml ange- geben.

Diskussion

Der Vorteil dieser Zählmethode ist die rasche Verfügbarkeit des Ergebnisses, ohne eine längere Inkubationszeit. Jedoch ist keine Selektion auf bestimmte ta- xonomische Gruppen oder Stämme möglich. Ferner besteht nicht die Möglichkeit bzw. es ist sehr schwierig tote Zellen von Lebenden oder anderen Partikeln zu differenzieren. Das von uns ermittelte Ergebnis entspricht in etwa dem Grup- penwert.

Kapitel 2 Differenzierung von Bakterien

Im Praktikum wurden zur Differenzierung verschiedener Mikroorganismen folgende gängige Testverfahren angewandt:

- Koloniemorphologie und Zellmorphologie
- Motilitätsbetrachtung
- Gramfärbung
- KOH - Test
- Sauerstoffeinfluss auf Wachstum
- Oxidase - Test
- Katalase - Test

2.1 Morphologie

2.1.1 Bestimmung der Kolonie-Morphologie

Wachsen Bakterien und Hefen untergünstigen Bedingungen auf Agarplatten, so bilden sie definierte Kolonien aus, die anhand einfacher Merkmale beschrieben bzw. identifiziert werden können. Folgende Merkmale werden zur Differenzie- rung herangezogen:

- Größe
- Form
- Randverlauf
- Farbe

Daten und Ergebnisse

Siehe Tabelle¹

Diskussion

Zwar ist durch die Koloniemorphologie eine grobe Differenzierung zwischen den Mikroorganismen möglich, jedoch sollte man dabei beachten, dass das Aussehen der Kolonien auch von den Bedingungen ihres Wachstums (Bebrütungsdauer, -temperatur, usw.) abhängt. So sind Kolonien z.B. nach zwei Tagen größer als nach einem oder sie würden bei höheren oder niedrigeren Temperaturen schnel- ler wachsen. Allerdings ist es schwierig, zwischen Mikroorganismen nur anhand ihrer Koloniemorphologie zu differenzieren. So kann man abschließend feststel- len, dass die Beschreibung der Koloniemorphologie nur ein erster Schritt bei der Identifizierung sein kann.

2.1.2 Mikroskopische Bestimmung von Zellmorphologie und Beweglichkeit

Zur weiteren Identifizierung wird die Zellmorphologie unter dem Phasenkontrastmikroskop bestimmt. Hierbei lassen sich grob die zwei typischen Grundformen, Kokken und Stäbchen, von Bakterienzellen unterscheiden.

Kokken

Als Kokken bezeichnet man kugel- oder eiförmige Bakterien. Sie können einzeln (Mikrokokken), in Zweierverbänden (Diplokokken), in Ketten (Steptokokken) oder in größeren Aggregaten (Staphylokokken) auftreten.

Stäbchen

Man unterteilt in gram-positive und gram-negative Stäbchen. Bei den Gram- nagativen treten relativ kleine Formen auf, die meist regulär gebaut sind. Da- neben treten auch gekrümmte (Vibrio) bzw. verdrehte (Spirillen) Stäbchen auf. Neben den gram-positiven, regulären Formen lassen sich auch coryneforme Stäbchen unterscheiden. Kennzeichnend hierfür sind die unregelmäßige Form und snapping devision.

Ein großer Teil der Bakterien ist in der Lage, sich gerichtet fortzubewegen. Bei den meist aktiv beweglichen Arten wird die Bewegung durch Rotation von Geißeln verursacht. Die Anordnung der Geißeln an der Zelle ist ein charakteris- tisches Merkmal und kann somit zur Klassifizierung verwendet werden.

Durchführung

Vor der Versuchsdurchführung muss das Phasenkontrastmikroskop geköhlert werden, um eine optimale Ausleuchtung und Kontrastierung zu erzielen. Zur Vorbereitung der Präparate wird ein Tropfen Wasser auf einen Objektträger aufgebracht. In diesen Tropfen wird mit einer sterilen Impföse das Probenmaterial eingebracht; im Anschluss daran wird der Tropfen mit einem Deckgläschen luftblasenfrei abgedeckt und unter dem Mikrokop untersucht.

Daten und Ergebnisse

Siehe Tabelle²

Diskussion

Wie im Skript angedeutet kann einem die Unterscheidung zwischen sehr kurzen Stäbchen und ovalen Kokken schwer fallen. Ansonsten waren die verschiedenen Formen der Mikroorganismen recht gut unterscheidbar. Auch das Auftreten der Zellen (einzeln, in Ketten, in Haufen) war erkennbar. Die Feststellung der jeweiligen Beweglichkeit der Mikroorganismen war jedoch um einiges schwieriger da man zwischen der Eigenbewegung der Zellen und einer Bewegung von außen unterscheiden muss. So könnten die jeweiligen Bewegungen der Zellen auch mit einer Strömung unter dem Deckglas verwechselt werden. Eine Beweglichkeit konnte von uns nur für E.coli gesichert festgestellt werden, da diese sich relativ schnell und vor allem in verschiedene Richtungen bewegt haben.

2.2 Die Bakterielle Zellwand

Die bakterielle Zellwand bewirkt Festigkeit und Form der Zellen. Bakterien be- sitzen eine nur ihnen eigene Wandstruktur, deren Festigkeitverleihende Kompo- nenete das Peptidoglykan oder Murein ist. Die Mureingrundstruktur wie auch der weitere Zellwandaufbau sind bei den einzelnen Bakteriengruppen verschie- den. Die Bakterien lassen sich in zwei Gruppen differenzieren: in die Gram- positiven und die Gram-negativen. Die Differenzierung beruht auf der von Gram 1884 eingeführten Färbung. Die Unterschiede im Wandaufbau bewirken, dass beim Färben mit Kristallviolett und anschliessender Jodfixierung ein Komplex entsteht, der bei den Gram-negativen mit Ethanol extrahierbar ist, bei den Gram-positiven jedoch nicht. Gram-negative Bakterien können bei einer Ge- genfärbung mit Safranin ebenfalls sichtbar gemacht werden. Die gram-positiven Bakterien haben einen vergleichsweise einfachen Wandaufbau; die Zellwand be- steht aus einer mehrschichtigen Peptidoglykanstruktur, in die Teichonsäuren eingelagert sind. Die gram-negativen Bakterien besitzen eine komplexere Wand- struktur; über der einschichtigen Mureinschicht liegt eine zweite, äußere Mem- bran, die durch das enzymhaltige Periplasma von der Mureinschicht getrennt ist. Die äußere Membran besteht zum Teil aus Lipopolysaccariden (LPS), die beim Menschen eine toxische Wirkung haben.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.1: Aufbau der grampositiven Zellwand

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.2: Aufbau der gramnegativen Zellwand

2.2.1 Gram-Färbung

Durchführung

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.3: Schritte der Gramfärbung

Die Bakterien werden auf dem Objektträger durch Hitzeeinwirkung fixiert (1). In diesem Zustand sind sie mikroskopisch noch nicht (gut) sichtbar. Danach er- folgt eine Färbung mir Kristallviolett (2), durch die alle vorhandenen Bakterien blau gefärbt werden (n.b. es gibt Ausnahmen, die den Farbstoff nicht oder nur schlecht aufnehmen, z.B. Mykobakterien). Nach Beizung mit Jod-Kaliumjodid und Entfärbung (Differenzierung) mit Alkohol halten nur die Bakterien mit mehrschichtigem Murein den Farbstoff zurück, die mit einschichtigem Murein geben ihn wieder ab (3). Um auch diese Bakterien sichtbar zu machen, verwendet man eine Gegenfärbung (Safranin, Fuchsin)(4).

Daten und Ergebnisse

Für diesen Versuch wurden Proben von Staphylococcus aureus, Arthrobacter nicotinae und Pseudomonas fluoreszens verwendet. Sowohl bei Staphylococcus aureus als auch bei Arthrobacter nicotinae ließ sich unter dem Mikroskop ein violett gefärbter Rand erkennen. Die Pseudomonas fluoreszens waren jedoch rot gefärbt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.4: Beispiel eines grampositiven Bakteriums

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.5: Beispiel eines gramnegativen Bakteriums

So ergibt sich folgendes Ergebnis:

- Staphyloccocus aureus : grampositiv
- Arthrobacter nicotinae : grampositiv
- Die Pseudomonas fluoreszens : gramnegativ

Die erhaltenen Ergebnisse der Gram-Färbung stimmen mit den Literaturwerten überein. Da die Gram-Färbung jedoch nicht immer aussagekräftig, ist werden auch andere Untersuchungsmethoden, wie der nachfolgend beschriebene KOH- Test, verwendet.

2.2.2 Test auf extrahierbare DNA (KOH-Test)

Auch dieser Test macht sich die Unterschiede in den Zellwänden von gramposi- tiven und gramnegativen Bakterien zunutze. So kann dieser Test das Ergebnis der Gram-Färbung absichern. Dieser Versuch beruht darauf, dass die Zellwand von gramnegativen Bakterien dünner ist als die der grampositiven. Sie lässt sich deswegen mit 3%iger Kalilauge hydrolysieren. Die Auflösung der Zellwand erkennt man daran, dass die DNA als schleimiger Faden erkennbar ist.

Durchführung

Für die Durchführung dieses Versuchs wird ein kleiner Klumpen Bakterienmaterial mit einer Impföse in 3% Kalilauge eingerührt. Wenn man die Impföse anschließend nach oben zieht und schleimige Fäden sichtbar sind, so ist der Test positiv und das Bakterium gramnegativ.

Daten und Ergebnisse

Für diesen Versuch wurden die gleichen Bakterien untersucht wie für die Gram- Färbung. Die Ergebnisse des KOH-Tests bestätigen die der Gram-Färbung. So ist Pseudomonas fluoreszens aufgrund seiner Fadenbildung gramnegativ während Staphylococcus aureus und Arthrobacter nicotinae grampositiv sind.

2.3 Wachstum und Stoffwechsel von Bakterien

Die Vermehrung der Bakterien verläuft in verschiedenen Wachstumsphasen. Nach Beimpfung erfolgt in der Anlauf- oder lag-Phase eine Anpassung an das Milieu. Daran schließt sich die exponentielle Wachstumsphase der Zellpopulati- on, auch als log-Phase bezeichnet, an. Durch Nährstoffverbrauch und Anhäufung hemmender Stoffwechselprodukte kommt es zur Verzögerung des Wachstums in der stationären Phase. In Abhängigkeit von Art, Medium und Umweltbedingun- gen setzt nach unterschiedlicher Dauer die Absterbephase ein. Das Wachstum von Bakterien ist von diversen Umweltbedingungen abhängig, zu denen auch der im Praktikum untersuchte Einfluss von Sauerstoff gehört.

2.3.1 Aerobes/Anaerobes Wachstum

Ziel des Versuches war es, die Sauerstofftoleranz bzw. - Abhängigkeit von Bacillus subtilis, E. coli und Clostridium Sporogenes zu untersuchen.

Durchführung

0,1 ml der Keimsuspension wurden mit 10 ml flüssigem Agar gemischt und in jeweils drei Reagenzgläser abgefüllt. Der Sauerstoffgehalt sinkt dabei im Agar nach unten hin ab. Während je eines dieser Röhrchen aerob und anaerob bebrütet werden, wird im dritten Röhrchen der normale Agar zusätzlich mit Wasseragar überschichtet Dies ermöglicht einen zusätzlichen Sauerstoffabschluss. Auch die überschichteten Röhrchen werden aerob bebrütet.

Daten und Ergebnisse

Diskussion

Bacillus subtilis als eindeutig strikt aerobe Bakteriengattung kann nur in An- wesenheit von Sauerstoff wachsen, weshalb man bei dem überschichteten, also fakultativ anaeroben, bzw. dem anaerob bebrüteten Ansatz keinerlei Trübung feststellen kann, die auf Wachstum schliessen lässt. Auch im unteren Bereich des aerob bebrüteten Röhrchens tritt keine Trübung auf, es diffundiert nicht ausrei- chend Sauerstoff durch den Agar. Es ist hier aber ein deutliches Wachstum auf der Oberfläche zu erkennen.

E. coli dagegen ist fakultativ anaerob, das Bakterium wächst in allen drei Röhrchen bei unterschiedlichen Sauerstoffpartialdrücken, was durch eine deutlich erkennbare Gasbildung unterstrichen wird.

Chlostridium sporogenes wiederum zeigt sich wie erwartet als strikt anaerob. In den aerob inkubierten Röhrchen ist kaum Wachstum und nur eine schwache Gas- bildung festzustellen. Im anaerob bebrüteten Zustand ist eine schwache Trübung erkennbar - ein Wachstum hat stattgefunden. Schwaches Wachstum allerdings, da die Bakteriensuspension bei den Versuchsvorbereitungen wahrscheinlich dem Luftsauerstoff zu lange ausgesetzt war, und dieser Umstand aufgrund fehlenden Cytochrom-Systems, bzw. Detoxifizierungssystems für Sauerstoff, zum Abster- ben des Bakteriums führen kann. Deshalb ist es auch seltsam, das sich auch im aerob beschichteten und unbeschichteten Röhrchen Gasbläschen gebildet haben. Zwar baut Chlostridium teilweise Aminosäuren ab, wobei gasförmige Produkte wie Ammoniak, CO2 oder Wasserstoff entstehen können. Die Sauerstoffkon- zentration im Agar sollte jedoch ausreichen, um ein Chlostridienwachstum zu verhindern. Eine mögliche Erklärung wäre eine Kontamination mit gasbildenden Bakterien.

2.3.2 Test auf Cytochrom Oxidase

Die aeroben Bakterien können in zwei Gruppen unterteilt werden, solche die Cytochrom (Cyt) c besitzen und solche, die kein Cyt c besitzen. Cyt c ist ein Protein und überträgt Elektronen auf das terminale Enzym der Elektronen- transportkette, Cytochrom c Oxidase. Beim Oxidase-Test wird auf das Vorhan- densein des Cytochrom c Oxidase-Systems getestet. Der Farbstoff Tetramethyl- p-phenylendiamin (TMPD), der in seiner reduzierten Form farblos ist, wird bei Anwesenheit von Cyt c oxidiert und ändert seine Farbe, er wird blau.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.6: Prinzip des Oxidase-Tests

Durchführung

Ein kleiner Teil der ausgewählten Kolonie von der Agarplatte wird auf ein TMPDgetränktes Filterpapier (Oxidase-Teststreifen) gerieben und die Farbbildung beobachtet.

Daten und Ergebnisse

Wir haben Listeria innocua, Staphylococcus aureus und Pseudomonas fluoreszens getestet. L. innocua und S. aureus waren negativ, die Testfelder verfärbten sich nicht. P. fluoreszens wurde eindeutig dunkelblau.

Diskussion

Die erhaltenen Ergebnisse stimmen mit den auf der Anleitung zu den Teststrei- fen angegebenen Erwartungen überein. Listeria innocua und Staphylococcus au- reus besitzen demnach im Gegensatz zu P. fluoreszens keine katalytisch aktive Cytochrom-Oxidase.

2.3.3 Katalase Test

Beim aeroben Stoffwechsel entstehen unausweichlich reaktive Sauerstoff-Spezies, wie das Superoxid-Anion (O2), Wasserstoffperoxid (H2O2) oder das Hydroxyl- Radikal (OH). Aerobe Organismen brauchen also auf der einen Seite O2 für die Atmung, auf der anderen Seite müssen sie mit der Reaktivität dieses Mo- leküls fertig werden. Dazu haben viele Bakterien Schutzmechanismen, wie De- toxifizierungsmechanismen, entwickelt. H2O2 kann durch enzymatische oder nicht-enzymatische Reaktionen entstehen. Das Enzym Katalase überführt H2O2 durch Dismutation in O2 und H2O:

2H2O2 ⇒ 2H2O + O2

Durchführung

Wasserstoffperoxid (10%ige Lösung) wird auf eine Kolonie getropft und beobachtet, ob es zu einer Gasbildung (Schäumen) kommt.

Daten und Ergebnisse

Wir haben Arthrobacter nicotianae, Staphylococcus aureus und Listeria inno- cua zur Untersuchung benutzt. Bei allen dreien war Bläschenbildung zu be- obachten. Dies stimmt mit der Tatsache überein, dass alle drei Sauerstoff zur Energiegewinnung benutzen (Listeria aerob, Staphylococcus fakultativ anaerob, Arthrobacter aerob) und damit eine Möglichkeit zur Entsorgung des Peroxids brauchen.

Kapitel 3 Isolierung von Mikroorganismen

Zur Isolierung oder Anreicherung von Mikroorganismen bestimmter Gruppen aus Mischkulturen macht man sich unter anderem die jeweiligen Stoffwech- seleigenschaften, Resistenzen oder andere spezifische Anpassungen zu Nutze. Bei den folgenden Versuchen wurden die verschiedenen selektiven Bedingungen durch den Einsatz spezieller Nährmedien mit geeigneten Zusätzen sowie un- terschiedlichen Inkubationstemperaturen geschaffen. Die Gesamtkeimzahl einer Probe wird auf dem nicht selektiven Vollmedium Plate Count-Agar (PC-Agar) bestimmt.

3.1 Enterobakterien und Coliforme Keime

Mit dem Überbegriff Enterobakterien fasst man eine große Gruppe gramnegativer, stäbchenförmiger Bakterien zusammen, die sich durch einen fakultativ anaeroben Stoffwechsel auszeichnen. Können sie zudem unter Gasbildung Lactose vergären, spricht man von coliformen Keimen, die als Indikator für Hygiene und technische Sorgfalt dienen.

Der Nachweis coliformer Keime erfolgt durch Anreicherung in doppelt konzen- tierter Lactose-Pepton-Bouillon und durch Oberflächenausstrich auf Kristallviolett- Galle-Laktose-Agar (VRB-Agar). Bei Kontamination der Probe mit colifor- men Keimen tritt in Laktose-Pepton-Bouillon Gasbildung (Nachweis: Durham- Röhrchen) sowie Farbumschlag durch Säurebildung auf. VRB-Agar hemmt das Wachstum grampositiver Bakterien durch Gallensalze und Kristallviolett. Zu- dem sind die Kolonien coliformer Keime an einer violetten Färbung und einem Hof von Gallensalzen zu erkennen.

Ziel der Versuche war die Überprüfung einer Hackfleischprobe auf Kontamination mit coliformen Keimen mit Hilfe der Anreicherung in doppelt konzentrierter Laktose-Pepton Bouillon sowie durch Direktansatz auf VRB-Agar.

3.1.1 Nachweis coliformer Keime durch Anreicherung in doppelt konzentrierter Laktose-Pepton Bouillon

Durchführung

In diesem Versuch sollte ermittelt werden, ob die vorliegende Hackfleischprobe coliforme Keime enthielt und somit vielleicht eine Fäkalkontamination vorlag. Die Hackfleischprobe wurde zunächst im Stomacher homogenisiert und 10g in 90 mL PBS verdünnt. Daraufhin wurde eine Verdünnungsreihe bis -6 erstellt. 5 mL der Verdünnungen wurden in 5 mL doppelt-konzentrierte Laktose-Pepton Bouillon in Reagenzgläser mit Durham Röhrchen gegeben. Die Röhrchen wurden 24 Stunden bei 37◦C bebrütet. Bei Gasbildung im Durham Röhrchen und einem Farbumschlag von violett nach gelb wird der Test als positiv bewertet.

Daten und Ergebnisse

Alle angesetzen Verdünnungsreihen konnten als positiv gewertet werden, da sowohl ein Farbumschlag von violett nach gelb als auch Gasbildung vorlag.

Diskussion

Der durchgehende Farbumschlag sowie die teilweise sehr starke Gasbildung zeugen von einer deutlich messbaren Kontamination der Hackfleischprobe mit coliformen Keimen. Angesichts der längeren Lagerung der Probe bei Raumtemperatur ist das Ergebnis nicht unbedingt außergewöhnlich.

3.1.2 Nachweis coliformer Keime durch Direktansatz auf VRB Agar

Aus einer homogenisierten Hackfleischprobe (vgl. 3.1.1.) soll die Zahl der coliformen Keime über den Selektivagar VRB in Relation zur Gesamtkeimzahl (PC) bestimmt werden. Die isolierten Enterobakterien werden in einem späteren Versuch (4.1.) biochemisch identifiziert.

Durchführung

Je 0,1 ml der Verdünnungen -1 bis -6 werden auf selektivem VRB-Agar (En- terobakterien) und auf PC-Agar (Gesamtkeimzahl) ausgestrichen. Die Platten werden bei 37◦C bebrütet und nach 24 bzw. 48h die Koloniezahl bestimmt.

Daten und Ergebnisse

Der ermittelte Wert für die Gesamtzellzahl beträgt 1, 04 · 10⁸ Cfu/ml. Auf dem VRB-Agar wuchsen zwei verschiedene Kolonietypen unterschiedlicher Morpho- logie. Der Großteil waren rot-violette Kolonien. Einen maßgeblichen Anteil, ca. 20%, nahmen aber auch weiße Kolonien ein. Die Keimzahl der dort gewachsenen Kolonien betrug 5,64 · 10⁶ cfu/ml.

Diskussion

Es ist deutlich zu erkennen, dass die Koloniezahlen auf PC-Agar deutlich höher liegen als auf VRB-Agar. Dies zeigt, dass auf VRB-Agar nicht alle Bakterien wachsen können, sondern nur ein geringer Anteil dessen. Es wachsen zwar auch einige Schimmel und Hefen recht gut auf VRB-Agar, hierfür ist die Inkubati- onszeit jedoch zu kurz. Die Kolonien auf PC-Agar waren durchwegs weißlich bis transparent und somit nicht unterscheidbar, während die auf VRB-Agar ge- wachsenen Kolonien deutlich in zwei Gruppen unterschieden werden konnten. Deutlich zu erkennen waren die violett gefärbten Kolonien, der Farbumschlag weist auf lokale Ansäuerung des Agars und somit auf Säurebildung durch Lac- tosevergärung hin. Im Gegensatz dazu weißliche Kolonien, bei denen kein Far- bumschlag und somit auch keine Säurebildung erfolgte; diese wären vermutlich als nicht coliforme Bakterien identifizierbar. Violett gefärbte Kolonien ließen zu- dem teilweise einen Hof, gebildet durch ausgefällte Gallensalze, erkennen. Eine der als coliform identifizierten, violett gefärbten Kolonien, wurde anschliessend mit dem BBL Enterotube weiter untersucht.

3.2 Sporenbildener

3.2.1 Endosporen aerober Sporenbildner

Manche Bakterien, darunter auch Vertreter der Bacillus cereus-Gruppe, können Sporen ausbilden. Sporen haben einen sehr geringen Wassergehalt, daher können sie auch sehr hohe Temperaturen überstehen. Aerobe Sporenbildner sind immer gram-positive Stäbchen. Da Endosporenbildner vor allem im Boden vorkommen, wird eine Bodenprobe auf aerobe Sporenbildner untersucht und diese isoliert.

Durchführung

Die Bodenprobe wird in PBS verdünnt und 10 Minuten bei 80◦C gehalten. Dadurch werden die Vegetativen Zellen abgetötet. Die Sporen bleiben aber, aufgrund ihrer hohen Hitzeresistenz, erhalten und können auf Agar wachsen. Somit dürften alle später wachsenden Kolonien aus Endosporen entstanden sein. Zum Nachweis von Bacillus cereus werden die Verdünnungsstufen -3 bis -6 auf dem selektiven Nährboden PEMBA ausgebracht. Zusätzlich werden die Stufen -3 bis -7 auf den nicht-selektiven PC Agar aufplattiert.

PEMBA steht für Polymyxin-Eigelb-Mannit-Bromthymolblau-Agar. Das Poly- myxin ist ein Antibiotikum gegen gramnegative Bakterien. Eine positive Eigel- breaktion zeichnet speziell die Bacillus cereus-Gruppe aus. Hierbei wird Lezi- thin zu 1,2-Diacylglycerid und Physphorylcholin hydrolysiert. Dies ergibt eine Eigelb-Präzipitation, die als Hof um die Kolonie erkennbar ist. Das Mannit wird von B. cereus nicht verstoffwechselt. B. cereus betreibt statt dessen Proteolyse, was zu einer Alkalisierung des Mediums führt und durch einen Farbumschlag des Bromthymolblau zu türkis angezeigt wird.

Daten und Ergebnisse

Nach 48 h wurde die von auswärts geholte und letztendlich ausgestrichene Bo- denprobe ausgewertet: es war nichts gewachsen, weder auf PC noch auf PEMBA - Agar. Möglicherweise waren die Bodenproben sporenfrei, vielleicht war auch der Verdünnungsansatz falsch gewählt. Jedenfalls wurde der Versuch mit Ände- rungen wiederholt: diesmal wurde eine - neue - Bodenprobe von ausserhalb ohne vorherige Verdünnung bzw. Vorbehandlung auf PEMBA-Agar ausgestri- chen. Bereits nach einem Inkubationstag zeigten sich auf den Platten ineinander verwachsene hell- und dunkelgrüne Kolonien, teilweise mit weißen Schlieren an der Oberfläche.

Diskussion

Die Kolonien waren leider nicht auszählbar, allerding erhielten wir so einen Eindruck davon, wie Sporenbildner auf PEMBA-Agar aussehen.

Nach Auskunft unserer Betreuer handelt es sich bei den hellgrünen Kolonien um Kolonien des Bacillus cereus. Die dunkelgrünen mycelartigen Kolonien werden durch Bacillus mycoides hervorgerufen

3.3 Schimmelpilze und Hefen

Bei diesem Versuch werden Schimmel und Hefen aus einem Blauschimmelkäse isoliert. Um Sporen und Keime zu erhalten, müssen diese aus dem Käse gewon- nen werden. Dazu wird der Käse mit Citratpuffer aufgeschlossen. Schimmel und Hefen sind Eukaryonten und gehören zu der Gruppe der Pilze. Wie alle anderen Pilze sind auch Hefen und Schimmel weit verbreitet. Das besondere an ihnen ist, dass sie ganz im Gegensatz zu Bakterien auch bei einem pH-Wert von 3-4 überleben und wachsen können.

3.3.1 Isolierung von Schimmelpilzen und Hefen

Zur genauen Bestimmung der Hefen- und Schimmelzahl wird die Suspension auf YGCB-Agar (Hefeextrakt-Glucose-Chloramphenicol-Bromphenolblau-Agar) aus- gestrichen. YGCB-Agar wird deshalb verwendet, da Chloramphenicol als Breit- bandantibiotikum sowohl gegen gram-positive, als auch gram-negative Bakterien wirkt. Unter dem Oberbegriff Hefen sind mehrere Arten zusammengefasst, die jedoch unterschiedlich in der Umsetzung verschiedener Stoffe sind. Einer dieser Stoffe ist Bromphenolblau, der zur Differenzierung der unterschiedlichen Hefear- ten herangezogen wird. Die aus Blauschimmelkäse und Citratpuffer bestehende Suspension wurde im Stomacher homogenisiert. Danach wird eine Verdünnungsreihe angelegt. Die Verdünnungen -2 bis -5 werden auf YGCB-Agar ausplattiert. Die Platten werden danach für 3-5 Tage bei 27◦ C aerob bebrütet.

Daten und Ergebnisse

Die erste Auszählung fand nach 48 Stunden statt. Die Kolonien auf den Plat- ten waren noch sehr klein, Hefe- und Schimmelkolonien waren klar zu trennen. Die Auszählung am ersten Tag (Verdünnungsstufen -3/-4 waren auszählbar) er- gab eine Gesamtkeimzahl von 2050 KbE/Probe und damit 102,5 KbE/g Käse. Nach dem dritten Tag wurden erneut die Kolonien ausgezählt, wobei nur eine geringe Zunahme der Kolonien zu verzeichnen war. Dabei wurde eine Gesamt- keimzahl von 2600 KbE/Probe und somit 130 KbE/g Käse ermittelt, allerdings hatten sich die Schimmelkolonien schon so sehr ausgebreitet, dass z.T. nicht mehr alle Hefekolonien erkannt und gezählt werden konnten. Am vierten Tag war daher keine weitere Auszählung mehr möglich, auch nicht bei der höchsten Verdünnungsstufe.

Diskussion

Dieser Versuch veranschaulicht, dass die Inkubationsdauer von der Art der Kei- me abhängt. Will man die Gesamtkeimzahl ermitteln, so muss man die Inkuba- tionsdauer so wählen, dass alle Keime genügend Zeit hatten sichtbare Kolonien zu bilden. Hier sind die Hefekulturen schneller als die Schimmelkolonien gewach- sen, die nach 24 Stunden nur bei genauem Hinsehen zu erkennen waren.

Ebenfalls hängen die ermittelten Keimzahlen sehr von der Entnahmestelle der Probe ab. Sie ist somit nur als Anhaltspunkt und nicht als Absolutwert zu betrachten

3.4 Nachweis von Chlostridien

Chlostridien sind strikt anaerobe Bakterien, die vor allem im Boden vorkom- men. Die Gattung Chlostridium wird nach Art des umgesetzten Substrats wei- ter unterteilt; es gibt Arten, die Kohlenhydrate als Substrat nutzen können, andere nutzen Aminosäuren, wieder andere können beide nutzen. Da dabei Gas entsteht, kann Gasbildung bei anaerober Inkubation nach Hitzedeaktivierung vegetativer Zellen als Indikator für die potentielle Anwesenheit von sporenbil- denden Chlostridien verwendet werden. Hinzu kommt, dass starkes Erhitzen die vorhandenen Sporen hitzeaktiviert.

3.4.1 Nachweis von Chlostridien im Weinzierl-Test)

Der Weinzierl-Test, bei dem die zu untersuchende Rohmilchprobe in mit Paraffin gefüllte Röhrchen gefüllt wird, kann diese vorhergehenden Bedingungen erfüllen.

Das Röhrchen wird für 15 min auf 85◦C erhitzt, wobei das Paraffin schmilzt, an die Oberfläche steigt und so einen luftdichten Verschluss bildet. Entsteht während der Inkubation Gas unter dem Paraffinpfropfen, so deutet dies auf die Anwesenheit von Chlostridien hin. Ziel dieses Versuches ist es also, eine Umweltprobe, in unserem Fall Rohmilch, mit einfachen Mitteln auf Befall mit Chlostridium zu untersuchen.

Durchführung

Von der zu untersuchenden Umweltprobe, in diesem Fall Rohmilch, wurde eine Verdünnung bis -3 hergestellt. Je 5 ml dieser Verdünnung wurden in Paraffin enthaltene Reagenzgläser gegeben und bei 85◦C für 15 Minuten erhitzt. Ansch- liessend wurden die Proben bei 37◦C für mehrere Tage inkubiert und fortlaufend die Gasbildung kontrolliert.

Daten und Ergebnisse

In allen Reagenzgläsern war letztendlich eine Gasbildung zu erkennen, wobei sie sich in der Stärke unterschied: Die Probe zeigte mittlere bis starke, die Verdünnungen nur leichte bis wenige Gasbildung. Diskussion Das Ergebnis ist kein eindeutiger Beweis für die Anwesenheit von Chlostridien, es kann sich auch um gas- und sporenbildende, fakultativ anaerobe Bacillus- Arten handeln. Der Verdacht auf Chlostridien ist in jedem Fall bestätigt, um einen eindeutigen Nachweis zu erbringen, müssen andere Methoden angewendet werden.

Kapitel 4 Identifizierungsmethoden für Mikroorganismen

Die taxonomische Identifizierung von Mikroorganismen erfolgt mittels genetischer, biochemischer oder immunologischer Methoden. Die beiden letzteren werden im Praktikum durchgeführt.

4.1 Biochemische Identifizierung

Bei der biochemischen Identifizierung von Mikroorganismen macht man sich die art- und gattungsspezifischen Stoffwechseleigenschaften, die genetisch determiniert sind, zu nutze. Die Indikation erfolgt anhand von Farbstoffbildung oder Farbumschlag in geeigneten Medien.

4.1.1 Identifizierung von Gram-negativen (Entero) Bak- terien mit dem Testsystem BBL Enterotube II

Ziel des Versuches ist die Identifizierung von gram-negativen Enterobakterien mit dem kommerziellen Testsystem BBL Enteotube II. Untersucht wurden die violetten Kolonien aus Versuch 3.1, die auf VRB-Agar gewachsen sind.

Durchführung

Eine der erwähnten Einzelkolonien aus Versuch 3.1 wird mittels der Impfna- del des Testsystems aufgenommen und in alle Kammern des Enterotube einge- bracht. Vorraussetzung für die Identifizierung sind gram- und oxidase-negative Keime, darauf wurde vorher noch einmal getestet. Nach einer Inkubationszeit von 24h und Zugabe von Kovacs-Reagenz in die Indol-Kammer wurde das Ergebnis abgelesen, wobei jede Kammer einzeln auf eine Farbänderung geprüft wurde. Die Einzelreaktionen werden in der Beschreibung des Testsystems detailliert beschrieben. Anhand der positiven Ergebnisse wurde ein fünfstelliger Zahlencode, der den Organismus identifiziert, ermittelt.

Auswertung

Die Identifizierung ergab folgende Ergebnisse für die Einzelreaktionen und den fünfstelligen Schlüsselcode:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 4.1: Enterotube - Testauswertung

Der ermittelte Bakterienstamm zeigt ein sinnvolles Ergebniss. Das identifizierte Bakterium hafnia alvei ist ein E.Coli-verwandter Mikroorganismus und ein- deutig coliform. Ein von uns ermitteltes Vorkommen an Salmonellen in der Hackfleischprobe ist zwar unerfreulich, aber durchaus denkbar. Durch die nicht eindeutige Färbung der Lysinkammer war jedoch keine genaue Auswertung möglich.

4.2 Immunologische Identifizierung

Mittels des Latex-Agglutinationstests soll ein isolierter staphylococcus Stamm aus der Mundschleimhaut näher charakterisiert werden. Der immunologische Nachweis ermöglicht die spezifische Abgrenzung des gesuchten staphylococcus aureus von anderen Stämmen wie beispielsweise dem Kontrollstamm staphylo- coccus epidermis. Der Test auf staph. aureus basiert auf drei Reaktionen der mit Antikörpern gecoateten Latexpartikel. Die Antikörper binden bei Präsenz von Protein A auf der Bakterienhülle bzw. von Coagulase bzw. von Kapselpo- lysacchariden. Es entstehen sichtbare ”Klumpen“.

Bei einem Mund- oder Nasenschleimhautabstrich entnommene Keime wurden im Versuch nach Inkubation auf Baird-Parker-Agarplatten mittels Latex-Agglutinationstest auf Staphylococcus aureus getestet. Durchführung Man verreibt Material der fraglichen Kolonie mit einem Tropfen Plasma auf ei- nem Objektträger. Im positiven Fall tritt sehr schnell, meist schon während des Verreibens, Klumpenbildung infolge Bindung von Fibrinogen an den Fibrino- genrezeptor der Keime ein. Zum Ausschluß einer ”Spontanagglutination“wird als negative Kontrolle physiolog. Kochsalzlösung anstelle von Plasma mit etwas Keimmaterial verrieben. Diese Kontrolle muß eine homogene Trübung zeigen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 4.2: Latex - Agglutinationstest

Daten und Ergebnisse

Die Reaktion auf die Kontrollsubstanz verlief bei beiden Ansätzen negativ. Eine mögliche Autoagglutination der Kolonien konnte somit ausgeschlossen werden. Der Kontrollstamm rief erwartungsgemäß keine Reaktion mit dem Agenz hervor, wohl aber die Testkolonie. Es war eine eindeutige Verklumpung im angegebenen Zeitrahmen erkennbar.

Diskussion

Anhand der Ergebnisse lässt sich der isolierte Stamm anschaulich als Staphylo- coccus aureus einstufen. Teilweise tauchten schwarze Teilchen in den Lösungen auf, die aber auf Rußpartikel, die sich von der Impföse gelöst hatten, zurück- zuführen waren und sich deutlich von der eindeutigen Verklumpungsreaktion unterscheiden ließen.

Kapitel 5 Bakterielle Viren

Bakteriophagen sind Viren, die ausschließlich Bakterien als Wirtszellen befal- len und sich in diesen vermehren. Der Wirtsbereich eines Phagen ist sehr be- schränkt, da auf Grund spezifischer Rezeptoren auf der Bakterienoberfläche je- der Phage nur bestimmte Bakterienspezies infizieren kann. Diese Phagenrezep- toren sind sogar innerhalb einer serologischen Gruppe einer Bakterienspecies unterschiedlicher Natur. Mit Hilfe der Bakteriophagen lassen sich die Seroty- pen der Bakterienspezies in weitere Untertypen unterteilen (Phagentypisierung, Lysotypie). Nach Infektion der Bakterienzellen mit einem Phagen findet inner- halb der Bakterien eine Synthese neuer Phagen statt und die Wirtszelle wird anschließend lysiert. Es entsteht dadurch im Bakterienrasen ein makroskopisch sichtbares Loch, ein sogenannter Plaque.

5.1 Isolierung von Bakteriophagen aus der Um- welt

Aus einer Wasserprobe werden Bakteriophagen isoliert. Diese werden mit Wirtsbakterien vermischt und danach über die Anzahl der gebildeten Plaques, die Gesamtzahl der Bakteriophagen in der Probe berechnet.

Durchführung

Die Wasserprobe war bereits steril filtriert, als wir sie bekommen haben. An- schließend wurden jeweils 0,1 ml der vorher bis -4 verdünnten Proben mit 0,2 ml Wirtsbakterienlösung in einem Reaktionsgefäß gemischt und für 15 min in- kubiert. Dem Gemisch wurde dann Weichager zugegeben, gemischt und auf eine PC - Agarplatte gegossen. Nach Erkalten wurden die Platten über Nacht bei 37◦C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Phagen ausgezählt und die Anzahl an den Wirt lysierende Phagen in der Probe berechnet.

Daten und Ergebnisse

Es war nur eine Auszählung der Verdünnung -4 möglich. Dort haben wir 1,05 · 10⁷ PfU/ml festgestellt.

Diskussion

In unserer Probe waren geeignete Phagen vorhanden. Wahrscheinlich ist die angenomme Anzahle der PfU/ml noch viel höher, denn es können während des Versuchsablauf Fehler auftreten:

- Die Differenz könnte durch schlechtes Vermischen der Verdünnungen bei verursacht werden.
- Bei den Proben könnte der Weichagar bei Zugabe der Phagen noch zu heiß gewesen sein, somit wären einige Bakterien und Phagen abgestorben.

Kapitel 6 DNA-Transfertechniken

Die Rekombination bei prokaryotischen Organismen findet durch die parase- xuellen Vorgänge Transduktion, Transformation und Konjugation statt. Dabei findet auf jeweils unterschiedliche Weise die Übertragung von DNA auf einen Rezipienten statt.

6.1 Transduktion von Bioluminiszenz durch den modifizierten Listeria Bakteriophagen A511 : : luxAB

Unter Transduktion versteht man die Übertragung genetischen Materials auf eine Rezipientenzelle durch Bakteriophagen. Eingesetzt wird der gentechnisch konstruierte Listeria - Phage A511::luxAB. Er zeichnet sich durch ein breites Ly- sespektrum aus. Zusätzlich besitzt das Phagengenom die Luciferase-Gene lux A und lux B als Fusionsprodukt, die in einen Bereich starker Exprimierung eingeführt worden sind. Im Verlauf der Phageninfektion kommt es zunächst zur Transduktion des lux-AB-Gens und in der Folge zur Exprimierung der Luciferase. Das Enzym Luciferase katalysiert die im Skript wiederzufindende Bioluminiszenz-Reaktion der Oxidation eines langkettigen Aldehydes und eines Flavinmononukleotides. Bei der Reaktion wird Licht der Wellenlänge 495 nm emittiert, was man sich für den Nachweis der Transduktion im Luminometer zu Nutze macht. Ein Gemisch der Phagensuspension und der Bakterienkultur wird bei 20◦C inkubiert. Im Luminometer kommt es zur Injektion von Nonanal und anschließend zur Messung der ausgesandten Photonen.

Durchführung

Auf 100 µl Phagenlösung werden 1 ml frisch gezogener Listeria-Suspension ge- geben und über einen Zeitraum von 0-160 min alle 40 min die Zeitwerte aufgenommen. Die Inkubation erfolgt bei 20◦C. Die Messung der emittierten Lichtwellen wurde in einem Photomultiplier, der das Aldehyd Nonanal automatisch hinzufügt, durchgeführt.

Daten und Ergebnisse

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 6.1: Tabellarische Auswertung

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 6.2: Graphische Auswertung

Diskussion Die Kurve im Diagramm entspricht unseren Erwartungen. Nach- dem in den ersten 45 min kaum Veränderungen zu messen sind, kommt es ab diesem Zeitpunkt zunächst zu einer exponentiellen Zunahme derLichtemission. Dann steigt die Lichtemission weiter an, wächst jedoch nicht mehr exponentiell.

Der Grund für die nur geringe Änderung der Biolumineszenz zu Beginn ist die Latenzzeit der Phagen. Erst nach Ende der Latenzzeit ist eine richtige Erhöhung der Biolumineszenz zu beobachten. Diese Zunahme steht in direktem Zusam- menhang mit der Expression von Phagengenen. Der Befall der Bakterienzellen mit Phagen geschieht sehr schnell. Die Gene der Phagen werden jedoch zunächst stark in ihrer Stückzahl vermehrt bevor sie exprimiert werden, d.h. bevor u.a. Luciferase produziert wird. Liegt das fertige Enzym, also die Luciferase, vor, so steigt die Biolumineszenz stark an. Nach Ende der Latenzzeit werden zu- dem die infizierten Zellen lysiert und Phagen freigesetzt. Diese Phagen können weitere Zellen infizieren, wodurch es schließlich zu einem weiteren Anstieg der Biolumineszenz kommt.

Das Abflachen des Anstiegs ist wohl darauf zurückzuführen, das bereits die Mehrzahl an Bakterien zerstört wurde, und daher nur wenige Bakterien neu infiziert werden können.

Ein Abfallen der Kurve würde erst bei einer deutlich längeren Messung sichtbar werden.

6.2 Transformation von E.coli mit pGreenTIR

Der Vektor pGreenTIR soll in CaCl2-kompetente E.coli transformiert werden. Der Expressionsvektor besteht aus einem pUC18 backbone und beinhaltet ein Ampicillin-Resistenzgen, sowie das gfp-Gen (gfp = green fluoreszenz protein). Die Fluoreszenz nach einer erfolgreichen Transformation kann unter UV-Licht sichtbar gemacht werden.

Durchführung

200 µl eines CaCl2-kompetenten Glycerinstocks werden vorsichtig auf Eis aufge- taut, mit 1µl der gewünschten Plasmid-DNA versetzt, vorsichtig gemischt und für 30 min auf Eis inkubiert. Der Ansatz wird für 90 sec. einem Temperatur- schock von 42◦C ausgesetzt, 800 µl nicht selektives SOC-Medium hinzugefügt und zur Ausbildung der Antibiotikaresistenz bei 37◦C inkubiert. Nach 45 min Inkubation wird eine Verdünnungsreihe bis 10−⁶ in 900 µl LB erstellt. Je 0,1 ml der Verdünnungen 10−¹ und 10−² werden auf LBAmp bzw. 10−⁵ nd 10−⁶ auf LB ausgespatelt.

Daten und Ergebnisse

Die LBAmp-Platten wurden im Dunkelraum unter UV-Licht betrachtet. Keine der Platten zeigte Fluoreszenzeigenschaften, es konnte daher keine Berechnung der Transformationshäufigkeit stattfinden.

Diskussion

Es hat keine Transformation stattgefunden. Entweder waren die Zellen nicht kompetent, und haben somit den Vektor nicht aufnehmen können, oder aber es waren einfach zu wenige, die aufgrund der Verdünnung nicht auf der ausgestrichenen Platte berücksichtigt wurden.

6.3 Konjugation

Der Versuch ist eine Kombination aus Konjugation und Transposon-Mutagenese. Zur Konjugation befähigte Zellen besitzen Transfergene und können Kontakt zu anderen Zellen aufnehmen und DNA (im vorliegenden Fall das Plasmid pUT- Km2-lux) auf sie übertragen. Die Konjugation ist die effizienteste Methode der DNA- Übertragung. Das Plasmid pUT-Km2-lux besitzt jedoch keinen eigenen ORI, sondern ist zur Replikation auf die Existenz des -Gens angewiesen. Dafür besitzt es aber das Tn5-Transposon, das eine Integration des Plasmids in das Bakteriengenom des Wirtes ermöglicht (Transposon-Mutagenese). Ferner trägt es eine Resistenz gegen das Antibiotikum Kanamycin und die komplette lux- Einheit (A-E Untereinheiten vorhanden). Das luxAB-Gen besitzt keinen eige- nen Promotor und ist daher nur bei einem Einbau nach einer Promotorsequenz in richtiger Leserichtung aktiv. Die CDE-Untereinheiten (bei der Transduktion nicht vorhanden vgl. 6.1.) codieren für einen Fettsäure-Reduktase-Komplex der die Synthese langkettiger Aldehyde bewirkt, die als Substrat für die Luciferase zur Verfügung stehen.

Durchführung

5 Kolonien Donorstamm (Km-Resistenz) werden mit ca. 20 Kolonien Akzeptor- stamm (Tet-Resistenz) auf einem etwa Euro-großen Bereich einer PC-Agarplatte vermischt. Nach einer Inkubationszeit von 6h bei 37◦C wird der entstandene Rasen aufgenommen und in 1 ml LB resuspendiert. 100 µl der unverdünnten Lösung und 10−⁴ − 10−⁶ Verdünnungen werden auf LB Tet/Kan ausplattiert und kultiviert. Der Zusatz beider Antibiotika gewährleistet, das nur Zellen mit eingebautem Transposon bis zu stationären Phase wachsen.

Daten und Ergebnisse

Bei der Lumineszenzmessung ergab sich eine sehr starke Leuchtkraft einer Ko- lonie, von der ein Reinigungsausstrich angefertigt wurde. Eine erneute Mes- sung des Einzelausstrichs zeigte gar eine subjektiv noch verstärkte Luciferase- Aktivität.

Diskussion

Die im Vergleich mit anderen Gruppen extrem hohe Luciferaseaktivität lässt auf die Insertion der lux-Einheit nach einem starkem Promotor schließen. Die auf- genommene Lumineszenz ist jedoch auch abhängig von der Dichte des Bewuchs. Bei zu dichtem Bewuchs fehlen Nährstoffe, dies resultiert in einer Abnahme der Lumienszenz . Ansonsten summiert sich die Lumineszenz benachbarter Koloni- en. Eine Berechnung der Effizienz war, aufgrund der gewählten Versuchspara- meter nicht möglich.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 6.3: Leuchtende Bakterien auf einer Agarplatte

Kapitel 7 Mikroorganismen als Modellorganismen

7.1 Mutation und Abtötung

Wenn Mikroorganismen UV-Strahlung ausgesetzt werden, wird der Zellkern so verändert, dass eine Zellteilung unmöglich wird, was folglich die Reproduktion verhindert oder die Zellen bei zu hoher Strahlendosis aufgrund der zahlreichen DNA-Defekte absterben lässt. Im folgenden Versuch sollen die Auswirkung von UV-Strahlung anhand der zeitlich unterschiedlichen Bestrahlung von E. coli veranschaulicht werden.

Durchführung

20 ml Bakteriensuspension wird mit doppelter Menge PBS vermischt, davon werden jeweils 1 ml in zwei Petrischalen gegeben. Nun werden die Bakterien mit UV-Licht bestrahlt, in unserem Fall für 10, bzw. 17 sec. Anschliessend werden die davon erzeugten Verdünnungreihen bis -5 entsprechend der Vorschrift ausplattiert. Nach Inkubation werden die Kolonien ausgezählt.

Daten und Ergebnisse

Es war keine der Platten auszählbar, es befanden sich zu viele Bakterienkolonien auf ihnen.

Diskussion

Wir haben in unserem Versuch leider kein Ergebniss erzielen können, da so viele Bakterien gewachsen sind, das sie nicht mehr auszählbar waren. Der Grund dafür war der vergessene Deckel auf der Petrischale bei der UV-Bestrahlung. So haben die Bakterien anscheinend keinen Schaden genommen. In der Gruppe ist jedoch aufgefallen, das die Bakterien mit hoher UV-Bestrahlung wesentlich weniger gut gewachsen sind, als die, die nur kurz der Strahlung ausgesetzt waren. Das bestätigt die vorher getätigten Erwartungen.

Kapitel 8 Literatur

- Brock Mikrobiologie; Madigan, Martinko, Parker; Spektrum Akademischer Verlag; 2000
- Allgemeine Mikrobiologie; Schlegel; Georg Thieme Verlag; 1985; 6., überarbeitete Auflage
- Mikrobiologisch-Biochemisches Praktikum; Süßmuth, Eberspächer, Haag, Springer; Georg Thieme Verlag; 1999; 2. Völlig überarbeitete Auflage
- Skript zu den ”MikrobiologischeÜbungen“