In dieser Studienarbeit sollte versucht werden das Plasmid pBR322 mit Glasmilch aufzureinigen. Um jedoch vorher die Effektivität dieser Methode zu ermitteln, sollte Lambda-DNA mit einer genau bekannten Konzentration aufgereinigt werden. Weiterhin sollte die Methode der Glasmilchaufreinigung mit der Methode der Affinitätssäule verglichen werden.
Schon in den 70er Jahren wurden die ersten DNA-Aufreinigungsversuche mit Glasmilch durchgeführt. Sie hat ihre Bedeutung aber größtenteils verloren, als Affinitätssäulen in Kits auf den Markt kamen, welche zwar teuerer sind, aber höhere Ausbeuten und schnellere Durchführung versprechen.
Glasmilch ist eine Suspension von Glas in Wasser. Die DNA bindet unter Anwesenheit des Bindungs-Puffers, welcher ein chaotropes Salz (z.B. NaI) enthält, an die Glaspartikel. Danach wird mit einem Waschpuffer, bestehend aus Tris, NaCl und EDTA, gewaschen. Im letzen Schritt kann die DNA mit Wasser oder TE-Puffer eluiert werden.
Heutzutage arbeitet man meist mit Silicamembranen anstelle von Glasmilch, was die Handhabung erheblich erleichtert. Auf dem Markt gibt es je nach aufzureinigendem Ausgangsmaterial spezielle Aufreinigungskits, wie z.B. kleine, mittlere oder große Fragmente. Auch der Begriff „Glasmilch“ wird heutzutage nur noch selten verwendet, meist findet man „silica gel based DNA purification“
Inhaltsverzeichnis
- Einleitung
- Material und Geräte
- Organismen, Plasmide und Enzyme
- Chemikalien und Lösungen
- Geräte
- Durchführung
- Transformation aus Übernachtkultur Escherichia coli DH5α
- Plasmidisolierung durch Minipräpäration
- Herstellen eigener Glasmilch
- Aufreinigung
- Restriktionsverdau
- Gelelektrophorese
- Konzentrationsbestimmung
- Ergebnisse
- Transformationseffizienz
- Wiederfindung der λ-DNA mit Glasmilch der Firma Fermentas
- Vergleich λ-DNA- & Plasmid pBR322-Aufgereinigt mit Glasmilch
- Vergleich von Fermentas- und Brillenglas-Glasmilch
- Vergleich von Fermentas- und Fensterglas-Glasmilch
- Vergleich der Elutionsmittel und Elutionsmittelmenge
- Aufreinigung von DNA mit Glasmilch auf Mikro-Zentrifuge
- Aufreinigung mit Affinitätssäulen
- Gesamtvergleich aller Aufreinigungsmethoden
- Vergleich der Konzentrationsbestimmungsmethoden
- Vergleich von Hoefer DQ 300 und Fluostar
- Gelelektrophorese
- Farbstoff-Wahl
- Diskussion
- Transformationseffizienz
- Glasmilchaufreinigung
- Affinitätssäulenaufreinigung
- Vergleich von Glasmilch und Affinitätssäulen
- Vergleich von Hoefer DQ 300 und Fluostar
- Gelelektrophoresen
- Ausblick
- Literatur
- Anhang
- Zusammensetzungen von Medien und Lösungen
- Abkürzungen
Zielsetzung und Themenschwerpunkte
Die Studienarbeit befasst sich mit der Aufreinigung von Plasmid-DNA mittels Glasmilch und Affinitätssäulen. Ziel ist es, die Effektivität der Glasmilchaufreinigung im Vergleich zur Affinitätssäulenmethode zu untersuchen. Dazu wird zunächst die Aufreinigung von Lambda-DNA mit bekannter Konzentration durchgeführt, um die Effizienz der Glasmilchaufreinigung zu ermitteln. Anschließend wird die Aufreinigung von Plasmid pBR322 mit beiden Methoden verglichen. Die Arbeit untersucht außerdem die Herstellung eigener Glasmilch aus Brillenglas und Fensterglas und vergleicht die Ausbeute mit gekaufter Glasmilch.
- Vergleich der Effizienz von Glasmilchaufreinigung und Affinitätssäulenmethode
- Herstellung eigener Glasmilch aus Brillenglas und Fensterglas
- Optimierung der Glasmilchaufreinigung durch Variation von Elutionsmittel und Elutionsmittelmenge
- Vergleich verschiedener Konzentrationsbestimmungsmethoden
- Bewertung der Ergebnisse und Ableitung von Schlussfolgerungen für die praktische Anwendung
Zusammenfassung der Kapitel
Die Einleitung führt in die Thematik der DNA-Aufreinigung ein und erläutert die Bedeutung der Glasmilchaufreinigung im Vergleich zu Affinitätssäulen. Kapitel 2 beschreibt die verwendeten Materialien und Geräte, einschließlich der Organismen, Plasmide, Enzyme, Chemikalien und Lösungen. Kapitel 3 erläutert die Durchführung der Experimente, einschließlich der Transformation, Plasmidisolierung, Herstellung eigener Glasmilch, Aufreinigung, Restriktionsverdau, Gelelektrophorese und Konzentrationsbestimmung. Kapitel 4 präsentiert die Ergebnisse der Experimente, einschließlich der Transformationseffizienz, der Wiederfindung von Lambda-DNA, des Vergleichs von Glasmilch und Affinitätssäulen, der Analyse verschiedener Glasmilchtypen und der Bewertung der Konzentrationsbestimmungsmethoden. Kapitel 5 diskutiert die Ergebnisse und zieht Schlussfolgerungen aus den Experimenten. Der Ausblick gibt einen Ausblick auf zukünftige Forschungsarbeiten und Anwendungen. Der Anhang enthält die Zusammensetzungen von Medien und Lösungen sowie eine Liste der verwendeten Abkürzungen.
Schlüsselwörter
Die Schlüsselwörter und Schwerpunktthemen des Textes umfassen die DNA-Aufreinigung, Glasmilch, Affinitätssäulen, Plasmid pBR322, Lambda-DNA, Transformation, Restriktionsverdau, Gelelektrophorese, Konzentrationsbestimmung, Vergleich von Methoden, Herstellung eigener Glasmilch, Elutionsmittel, Elutionsmittelmenge, Transformationseffizienz, Wiederfindung, Ausbeute, Effizienz, Optimierung, Bewertung, Schlussfolgerungen, Ausblick.
- Citation du texte
- Maik Lander (Auteur), Maik Bultmeyer (Auteur), 2008, Vergleich von DNA-Aufreinigung mittels Glasmilch und Affinitätssäule, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/112872
