In dieser Studienarbeit sollte versucht werden das Plasmid pBR322 mit Glasmilch aufzureinigen. Um jedoch vorher die Effektivität dieser Methode zu ermitteln, sollte Lambda-DNA mit einer genau bekannten Konzentration aufgereinigt werden. Weiterhin sollte die Methode der Glasmilchaufreinigung mit der Methode der Affinitätssäule verglichen werden.
Schon in den 70er Jahren wurden die ersten DNA-Aufreinigungsversuche mit Glasmilch durchgeführt. Sie hat ihre Bedeutung aber größtenteils verloren, als Affinitätssäulen in Kits auf den Markt kamen, welche zwar teuerer sind, aber höhere Ausbeuten und schnellere Durchführung versprechen.
Glasmilch ist eine Suspension von Glas in Wasser. Die DNA bindet unter Anwesenheit des Bindungs-Puffers, welcher ein chaotropes Salz (z.B. NaI) enthält, an die Glaspartikel. Danach wird mit einem Waschpuffer, bestehend aus Tris, NaCl und EDTA, gewaschen. Im letzen Schritt kann die DNA mit Wasser oder TE-Puffer eluiert werden.
Heutzutage arbeitet man meist mit Silicamembranen anstelle von Glasmilch, was die Handhabung erheblich erleichtert. Auf dem Markt gibt es je nach aufzureinigendem Ausgangsmaterial spezielle Aufreinigungskits, wie z.B. kleine, mittlere oder große Fragmente. Auch der Begriff „Glasmilch“ wird heutzutage nur noch selten verwendet, meist findet man „silica gel based DNA purification“
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
2 Material und Geräte
2.1 Organismen und Plasmide
2.2 Chemikalien und Lösungen
2.3 Geräte
3 Durchführung
3.1 Transformation aus Übernachtkultur Escherichia coli DH5α
3.2 Plasmidisolierung durch Minipräpäration
3.2.1 Isolierung von Plasmid pBR322
3.2.2 Plasmidisolierung von pUC18
3.3 Herstellen eigener Glasmilch
3.4 Aufreinigung
3.4.1 Aufreinigung von Lambda-DNA mit Glasmilch von Fermentas
3.4.2 Aufreinigung von Plasmid pBR322 mit Glasmilch von Fermentas
3.4.3 Aufreinigung von Plasmid pUC18 mit Glasmilch von Fermentas
3.4.4 Aufreinigung von Lambda-DNA mit eigener Glasmilch
3.4.5 Aufreinigung von Plasmid pBR322 mit eigener Glasmilch
3.4.6 Aufreinigung von Plasmid pUC18 mit eigener Glasmilch
3.4.7 Aufreinigung mit Affinitätssäule
3.5 Restriktionsverdau
3.5.1 Restriktionsverdau von pBR322 mit FastDigest™ HindIII ohne RNase
3.5.2 Restriktionsverdau von pBR322 mit FastDigest™ HindIII mit RNase
3.5.3 Restriktionsverdau von pUC18 mit FastDigest™HindIII mit RNase
3.5.4 Restriktionsverdau von pUC18 mit HindIII mit RNase
3.6 Gelelektrophorese
3.6.1 Durchführung der Gelelektrophorese
3.6.2 Gelelektrophorese mit höherer Spannung
3.7 Konzentrationsbestimmung
4 Ergebnisse
4.1 Transformationseffizienz
4.2 Wiederfindung der λ-DNA mit Glasmilch der Firma Fermentas
4.3 Vergleich λ-DNA- & Plasmid pBR322-Aufgereinigt mit Glasmilch
4.4 Vergleich von Fermentas- und Brillenglas-Glasmilch
4.5 Vergleich von Fermentas- und Fensterglas-Glasmilch
4.6 Vergleich der Elutionsmittel und Elutionsmittelmenge
4.7 Aufreinigung von DNA mit Glasmilch auf Mikro-Zentrifuge
4.8 Aufreinigung mit Affinitätssäulen
4.9 Gesamtvergleich aller Aufreinigungsmethoden
4.10 Vergleich der Konzentrationsbestimmungsmethoden
4.10.1 Vergleich von Hoefer DQ 300 und Fluostar
4.10.2 Gelelektrophorese
4.10.3 Farbstoff-Wahl
5 Diskussion
5.1 Transformationseffizienz
5.2 Glasmilchaufreinigung
5.2 Affinitätssäulenaufreinigung
5.3 Vergleich von Glasmilch und Affinitätssäulen
5.4 Vergleich von Hoefer DQ 300 und Fluostar
5.6 Gelelektrophoresen
6 Ausblick
7 Literatur
8 Anhang
8.1 Zusammensetzungen von Medien und Lösungen
8.2 Abkürzungen
Zielsetzung & Themen
Die vorliegende Arbeit untersucht die Wirksamkeit der DNA-Aufreinigung mittels Glasmilch und vergleicht diese Methode mit moderneren Affinitätssäulen. Dabei wird insbesondere evaluiert, ob selbst hergestellte Glasmilch aus Brillenglas oder Fensterglas als kostengünstige Alternative zu kommerziellen Produkten dienen kann und welche Parameter die Ausbeute beeinflussen.
- Vergleich von DNA-Aufreinigungseffizienz zwischen kommerzieller Glasmilch und selbst hergestellten Glas-Suspensionen.
- Untersuchung des Einflusses von Elutionsmitteln und Zentrifugationsbedingungen auf die DNA-Ausbeute.
- Benchmarking von Glasmilch-Aufreinigung im Vergleich zu kommerziellen Affinitätssäulen.
- Evaluation verschiedener Methoden zur DNA-Konzentrationsbestimmung (Fluoreszenzmessung vs. Gelelektrophorese).
Auszug aus dem Buch
3.3 Herstellen eigener Glasmilch
Für die Herstellung der eigenen Glasmilch wurde ein bereitgestelltes Brillenglas zuerst mit dem Hammer grob zerkleinert. Dazu wurde das Brillenglas in eine Plastiktüte gesteckt, um Glassplitter am Flug zu hindern. Anschließend wurde das grob zerkleinerte Glas in einen Porzellanmörser überführt und ungefähr 2 h mit dem Pistill gemörsert. Der feine Glasstaub wurde in Falconröhrchen überführt. Ein Teil des Glaspulvers wurde zur Herstellung einer eigenen Glasmilch eingesetzt. Hierzu wurden 4 Volumenteile Glaspulver in 3 Volumenteilen bidest. Wasser suspendiert.
Bei der Herstellung der Glasmilch aus dem bereitgestellten Fensterglas wurde gleichermaßen verfahren.
Zusammenfassung der Kapitel
1 Einleitung: Beschreibt das Ziel der Arbeit, DNA mittels Glasmilch aufzureinigen und die Methode mit Affinitätssäulen zu vergleichen.
2 Material und Geräte: Listet alle verwendeten Organismen, Chemikalien, Lösungen sowie die für die Experimente benötigte technische Laborausstattung auf.
3 Durchführung: Detaillierte Darstellung der experimentellen Protokolle für Transformation, Plasmidisolierung, Aufreinigung, Restriktionsverdau, Elektrophorese und Konzentrationsbestimmung.
4 Ergebnisse: Präsentation der Daten zur Transformationseffizienz, Wiederfindungsraten verschiedener Glasmilch-Arten und Vergleich der Messmethoden für DNA-Konzentrationen.
5 Diskussion: Interpretation der Ergebnisse hinsichtlich der Eignung von Glasmilch, Optimierungsmöglichkeiten der Aufreinigung und Analyse der Diskrepanzen bei Messmethoden.
6 Ausblick: Zusammenfassende Einschätzung des Anwendungspotenzials von selbst hergestellter Glasmilch und Identifikation von Punkten für zukünftige Forschungsarbeiten.
Schlüsselwörter
DNA-Aufreinigung, Glasmilch, Affinitätssäule, pBR322, pUC18, Plasmidisolierung, Transformationseffizienz, Gelelektrophorese, Fluoreszenzmessung, Hoefer DQ 300, Fluostar, Silica-gel, DNA-Ausbeute, Restriktionsverdau, Laborpraktikum.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Studienarbeit grundsätzlich?
Die Arbeit befasst sich mit der Aufreinigung von DNA-Proben unter Verwendung von Glasmilch im Vergleich zu kommerziellen Affinitätssäulen.
Was sind die zentralen Themenfelder der Untersuchung?
Zentrale Themen sind die Herstellung und Evaluierung eigener Glasmilch-Suspensionen, die Optimierung von Aufreinigungsparametern und der Vergleich analytischer Messmethoden zur Konzentrationsbestimmung.
Welches primäre Ziel verfolgt die Forschungsfrage?
Das Ziel ist es, die Effizienz der Glasmilch-Methode zu bestimmen und zu prüfen, ob selbst hergestellte Glasmilch aus Altglas eine valide, kostengünstige Alternative zu kommerziellen Kits darstellt.
Welche wissenschaftlichen Methoden werden angewendet?
Zum Einsatz kommen mikrobiologische Kultivierung (Transformation), chemische Plasmidisolierung (Minipräparation), DNA-Aufreinigung, enzymatischer Restriktionsverdau sowie analytische Verfahren wie Gelelektrophorese und fluorometrische Konzentrationsbestimmung.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Der Hauptteil dokumentiert die detaillierte Durchführung der Experimente, die tabellarische Auswertung der Aufreinigungsergebnisse und die methodische Gegenüberstellung der Messergebnisse.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
DNA-Aufreinigung, Glasmilch, Affinitätssäule, Plasmidisolierung, Transformationseffizienz, Gelelektrophorese und Fluoreszenzmessung.
Welche Rolle spielen Brillenglas und Fensterglas in der Studie?
Diese dienen als Ausgangsmaterial für die selbst hergestellte Glasmilch, deren Bindungseffizienz für DNA im Vergleich zu einer industriellen Referenz (Firma Fermentas) untersucht wurde.
Warum konnte bei der Gelelektrophorese teilweise keine Konzentration bestimmt werden?
Die Konzentration der aufgetragenen Proben war oft zu gering im Vergleich zu den verwendeten DNA-Markern, was die Identifikation und Auswertung der Banden erschwerte.
- Quote paper
- Maik Lander (Author), Maik Bultmeyer (Author), 2008, Vergleich von DNA-Aufreinigung mittels Glasmilch und Affinitätssäule, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/112872
