Nukleinsäuren, Konzentration einer DNA-, RNA- und Proteinstocklösung. Ein Praktikumsprotokoll

Inhaltsverzeichnis

Konzentrationsbestimmung von DNA-, RNA- und Proteinlösungen
Versuchsabsicht
Materialien und Methoden
Ergebnisse & Fragen
Diskussion

Plasmididentifizierung: Grundlegende molekularbiologische Methoden
Versuchsabsicht
Materialien und Methoden
Ergebnisse
Diskussion & Fragen

Klonierung von GFP in E. coli
Versuchsabsicht
Materialien und Methoden
Ergebnisse
Diskussion & Fragen

Retrovirale Transduktion von CHO-Zellen
Versuchsabsicht
Materialien und Methoden
Ergebnisse
Diskussion & Fragen

cDNA-Produktion aus mRNA von HeLa-Zellen und Klonierung in E.coli
Versuchsabsicht
Materialien und Methoden
Ergebnisse
Diskussion & Fragen

RNA-Interference mittels siRNA in HeLa-Zellen
Versuchsabsicht
Materialien und Methoden
Ergebnisse
Diskussion & Fragen

Anhang

Konzentrationsbestimmung von DNA-, RNA- und Proteinlösungen (7. Januar)

Versuchsabsicht

Ziel des Versuches ist es, die Konzentration einer DNA-, RNA- und Proteinstocklösung durch Photometrie zu bestimmen. Außerdem soll noch die Reinheit ausgerechnet werden.

Materialien und Methoden

Es wurden 3 Verdünnungen (1:10, 1:100 und 1:1000) von jeder der drei Stocklösungen vorbereitet, indem 100µl der Probe und 900µl aq. dest. angesetzt wurde. Der OD-Wert der Verdünnungen wurde in für UV-Licht durchlässige Küvetten am Photometer bei 260nm und 280nm gemessen. Aus den OD-Werten bei 260nm wurde die Konzentration von DNA und RNA, bei 280nm die Proteinkonzentration berechnet. Als Nullwert diente Wasser.

Ergebnisse

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tab.1: OD-Werte aus der photometrischen Messung.

Äquivalenzen:

DNA: OD260nm = 1 entspricht einer DNA Konzentration von 50 µg/ml

RNA: OD260nm = 1 entspricht einer RNA Konzentration von 42 µg/ml

Protein: OD280nm = 1 entspricht einer Protein Konzentration von 1,6 mg/ml

Mit den OD-Werten aus der 1:100 Verdünnung und die o.g. Äquivalenzen ergibt sich die Konzentration der Stocklösungen folgendermaßen:

[DNA] = 0,535·100·50 µg/ml = 2675 µg/ml = 2,675 mg/ml

[RNA] = 1,592 mg/ml

[Protein] = 83,76 mg/ml

Die Reinheit von DNA und RNA ist wie folgt definiert:

reine DNA: OD 260/280 = 1.8 (100% rein)

reine RNA: OD 260/280 = 2.0 (100% rein)

Aus den erhaltenen OD-Werten bei der 1:100 Verdünnung folgt:

DNA: OD260/280= 1,45 Entspricht eine Reinheit von 80,5%

RNA: OD260/280= 1,56 Entspricht eine Reinheit von 78,0%

Diskussion & Fragen (werden auch im Text geantwortet)

Die DNA- und RNA-Stocklösungen sind nicht komplett rein. Proteinverunreinigungen beeinflussen die Absorption von UV-Licht von DNA und RNA im Photometer. Dies kann man besser verstehen, indem man die Absorptionsspektren von DNA, RNA und Protein in einer Grafik zeichnet. Die Absorptionskurve von Protein erhöht den Absorptionswert bei dem Absorptionsbereich, wo DNA und RNA ihr Maximum haben.

Die erhaltene Konzentration von DNA und RNA stimmt sehr nah mit den Ergebnissen anderer Gruppen überein (2,5mg/ml-2,6mg/ml). Die Äquivalenz für die Berechnung der Proteinkonzentration (1,6 mg/ml für BSA bei OD_280nm) kann nicht für alle Proteine verwendet werden. Proteine haben unterschiedliche Absorptionsvermögen: Proteine mit hohem Anteil an Tryptophan und Tyrosin absorbieren stärker im Vergleich zu anderen mit weniger oder gar keine Anwesenheit dieser Aminosäuren.

Plasmididentifizierung: Grundlegende molekularbiologische Methoden (8.-10.Januar)

Versuchsabsicht

In diesem Versuch wurde ein unbekanntes Plasmid identifiziert und die Identität eines anderen überprüft, die in den nächsten Versuchen verwendet wurden. Dafür dienten grundlegende molekularbiologische Methoden wie Restriktionsreaktionen mittels Endonukleasen, Agarosegelelektrophorese (AGE), Ansetzen von Bakterienkulturen und Herstellen von Midi-Preps (Mini- und Maxi-Preps basieren auf ähnliche Verfahren).

Materialien und Methoden

Es wurde 2 unbekannten Plasmide identifiziert. Für das erste Plasmid wurde eine Restriktionsreaktion mit zugehöriger Gelanalyse angesetzt. Hier wurden auch genomische Lachs-DNA und Phagen-DNA analysiert.

1.Plasmid - Restriktionsreaktion

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tab. 2: Restriktionsanalyse von genomischer, Phagen- und Plasmid-DNA. In kursiver Schrift die Restriktionsenzyme; in kursiven, eckigen Klammern die (zu verdauende) DNA-Menge. Die ausgewählte Puffernummer entspricht dem für das Restriktionsenzym geeigneten Puffer. Reihenfolge beim Pipettieren: 1. aq. dest., 2. DNA, 3. 10x Restriktionspuffer und 4. Enzym.

Allg. Anmerkungen (werden in den nächsten Versuchen nicht mehr erwähnt!)

Bei dieser Restriktionsreaktion und andere Methoden, wo auch DNA-modifizierende Enzyme angesetzt wurden, ist zu beachten, dass sie 50% Glycerin enthalten und bei -20°C aufbewahrt werden müssen. Beim Ansetzen der Enzymlösung muss diese eine Glycerinkonzentration von max. 5% besitzen, für eine ausreichende Enzymaktivität. Die Enzymlösung muss daher 10mal im Endvolumen des Reaktionsansatzes verdünnt sein (z.B. 1µl Enzymlösung in 10µl Endvolumen).

Für Berechnung der zum ansetzenden Volumen von Enzymlösung wurde berücksichtigt, dass eine Unit (U) ein 1µg Substrat (hier DNA) umsetzt. Um eine vollständige Restriktion zu sichern, wird das Enzym in 5-fachem Überschuss appliziert.

Angesetzte DNA-Volumina ergeben sich aus den unterschiedlichen DNA-Konzentrationen: z. B. mit einer genomischen DNA-Konzentration von 0,25 µg/µl braucht man 20µl für einen gewünschten Verdau von 5µg genomischer DNA. Dem gewählten Volumen für 10x Restriktionspuffer entspricht ein 1/10 des Endvolumens (daher 10x).

Tab. 3: Liste der verwendeten Restriktionsenzyme:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

AGE-Analyse

Dann folgte eine Agarosegelelektrophorese (AGE) der Restriktionsreaktionen und ihrer unverdauten Varianten. Pipettierschema:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tab.4: Pipettierschema der AGE-Analyse. Reihenfolge beim Pipettieren: 1. aq. dest., 2. DNA, 3. 10x Restriktionspuffer und 4. Enzym. In kursiver Schrift die Restriktionsenzyme, mit der die Probe verdaut wurde.

Allg. Anmerkungen (werden in den nächsten Versuchen nicht mehr erwähnt!)

Die mit Hind III verdaute l-Phage-DNA (dient als Marker auch) wurde vor Auftragen auf das Gel 5‘ bei 65°C inkubiert, dann auf Eis gestellt. Elektrophorese erfolgte bei 140 V für ca. 45 min. AGE-Dokumentationen erfolgte durch Ausdrucken eines Gelfotos unter UV-Licht. Der Rest von mit Hind III verdautem l-DNA wurde für nächste Experimente bei -20°C gelagert.

Die Konzentrationen der verdauten DNA stammen aus den Endvolumina der Restriktionsreaktionen (z. B. 0,1 µg/µl für verdaute lDNA mit Hind III). Als Marker diente der 1kb DNA-Leiter.

2.Plasmid

Aus Bakterienkulturen mit dem 2.Plasmid (pGEX-2T) wurden Midi-Preps hergestellt, um die Identität des Plasmids zu identifizieren. Aus den Midi-Preps wurde die DNA-Konzentration photometrisch bestimmt, und anschließend eine Restriktionsanalyse mit AGE-Analyse durchgeführt, um den Plasmid zu identifizieren. Plasmididentifizierung bei beiden Versuchen erfolgte mithilfe einer Plasmidkarte.

Ansetzen von Bakterienkulturen

Für das 2. Plasmid wurden flüssige Bakterienkulturen mit E.coli Bakterien, die das 2. Plasmid enthalten, angesetzt. Zu einem 250ml Erlenmeyerkolben mit 100ml LB-Medium wurde Ampicillin mit einer Endkonzentration von 100µg/ml zugegeben (0,1ml aus der Stocklösung mit 100mg/ml). Ca. 200µl Bakterien wurden zugegeben und der Erlenmeyerkolben in den Kolbenschüttler bei 37°C nachtsüber gestellt.

Midi-Prep und photometrische Bestimmung der DNA-Menge

Herstellen von Midi-Preps erfolgte nach dem Qiagen-Protokoll für das Qiagen Plasmid Midi Kit (Originaltext im Protokoll), bis auf einige Abweichungen wie im Schritt Nr.11. Prinzipiell sind die Schritte bei der Plasmidisolierung: Lyse der Bakterien mit NaOH/SDS und dabei die Denaturierung der DNA; Neutralisation und dabei die Renaturierung der Plasmid-DNA (topologisch bleiben beide Stränge zusammen). Genomische DNA und ausgefällte Proteine bleiben in Klumpen und werden durch Zentrifugation getrennt. Im Überstand bleibt die Plasmid-DNA, die in den letzten Schritten mit einer QIAGEN-tip Säule weiter gereinigt wird, bis man möglichst reines Plasmid-DNA aus der Säule eluiert und nach Austrocknen ein Pellet als Produkt erhält:

1)Es wurde 50ml der Übernachtkultur für den Midi-Prep verwendet und der Rest bei 4°C gestellt. Die Bakterien wurden in einem Falcongefäß durch Zentrifugieren mit 6000rpm für 15min bei 4°C geerntet.
2)Das Pellet wurde dann in 4ml P1-Puffer (Resuspensionspuffer, enthält RNase A) durch Ein- und Absaugen mit der Pipette sorgfältig resuspendiert.
3)Es wurde 4ml P2-Puffer (für die alkalische Zelllyse, Lysepuffer) zugegeben und durch Umkehren des Falcongefäßes (4 bis 6mal) gemischt, was eine blaue Färbung der Suspension aufgrund des LyseBlue Reagens ergab. Anschließend wurde für 5‘ bei Raumtemperatur inkubiert.
4)4ml von eisgekühltem P3-Puffer (Neutralisationspuffer) wurde dann addiert, durch Umkehren des Falcongefäßes (4 bis 6mal) gemischt (4-6 Male), und in Eis für 15min inkubiert.
5)Nun wurde die Suspension mit 14000rpm für 30min bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand mit Plasmid-DNA wurde entnommen.
6)Der Überstand wurde wieder bei 14000 rpm und 4°C für 15min zentrifugiert und der Überstand wieder entnommen. Aus diesem Überstand wurde 240µl Probe (1. Probe) abgenommen, um später in Gel analysiert zu werden (Untersuchung der Effizienz der Zelllyse in den o.g. Schritten).
7)Nun wurde eine QIAGEN-tip 100 Säule äquilibriert, indem 4ml QBT-Puffer durch die Säule nach der Gewichtskraft durchlief.
8)Der Überstand aus Schritt 6) wurde jetzt auf die Säule aufgetragen. 240µl des durchgelaufenen Überstands (2. Probe) wurde für spätere Gelanalyse entnommen (Untersuchung der Bindungseffizienz von Plasmid-DNA im Harz der Säule).
9)Die QIAGEN-tip Säule wurde 2mal mit 10ml QC-Puffer (Waschpuffer) gewaschen. Nach Durchlaufen wurde hiervon 400µl (3. Probe) für Gelanalyse abgenommen (Untersuchung der ausgewaschenen Kontaminationspartikel).
10)Jetzt wurde die DNA, die in der Säulenmembran enthalten ist, mit 5ml QF-Puffer (Elutionspuffer) eluiert. Von dem Eluat wurde 100µl (4. Probe) für spätere Gelanalyse entnommen.
11)Dem Eluat mit DNA wurde nun 3,5ml RT-Isopropanol (RT=Raumtemperatur) zugegeben und das gesamte Volumen in mehreren Eppendorfgefäßen (6) aufgeteilt. Die Eppi‘s wurden gemischt und mit 14000rpm für 30min bei 4°C zentrifugiert. DNA fiel aus.
12)Die Überstände wurden dekantiert. Das DNA-Pellet in den Eppi‘s wurde mit 2ml 70%iges RT-Ethanol (für alle Eppi‘s) gewaschen, und bei 14000rpm für 15min zentrifugiert. Überstände wurden sorgfältig dekantiert.
13)Das DNA-Pellet in den Eppi’s wurden für 5 Minuten mit Luft getrocknet, und dann in 400µl TE-Puffer aufgelöst (6 Eppi’s mit jeweils 66,6µl).Am Schluss wurde das gesamte Volumen in einem neuen Eppendorfgefäß gesammelt.

Die Menge und die Reinheit der erhaltenen DNA-Lösung wurden dann photometrisch bei 260nm und 280nm bestimmt, indem man 40µl der DNA-Lösung mit 760µl aq. dest. in einer Küvette angesetzt wurde. Nullwert wurde mit sterilem Wasser festgelegt.

Restriktionsreaktion von Midi-Prep

Zur Überprüfung der Identität des Plasmids pGEX-2T wurden 3 Verdaus (Nco I, Pst I und Bam HI) und einem Doppelverdau des Plasmids (Pst I + EcoRI) angesetzt :

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tab.5: Restriktionsreaktion aus dem Midi-prep. Reihenfolge beim Pipettieren: 1. aq. dest., 2. DNA, 3. 10x Restriktionspuffer und 4. Enzym. Konzentration des Plasmids pGEX-2T: 35ng/µl (Ergebnis aus der photometrischen Messung des Midi-Preps)

AGE-Analyse

Die Verdaus wurden dann im Agarosegel analysiert. Die 4 gesammelten Proben (zur Untersuchung der Effizienz bei der Plasmidisolierung nach Qiagen) aus dem Protokoll für die Midi-Preps wurden auch analysiert. Außerdem wurde der mit Hind III verdautem [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten]Phagen-DNA nochmals analysiert, um die Banden besser zu erkennen (in der ersten AGE nicht richtig gelungen):

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tab.6: Pipettierschema für das Agarosegel aus der vorigen Restriktionsreaktion. Reihenfolge beim Pipettieren: 1. aq. dest., 2. DNA, 3. 10x Restriktionspuffer und 4. Enzym.

Ergebnisse & Fragen

1.Plasmid

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

In der ersten Spur ist eine Bande zu erkennen, ihr entspricht wie erwartet die ungeschnittene lDNA. Die 2. Spur hat 4 Banden (Bp-Größe -aus der Literatur- von oben nach unten: 23130, 9416, 6557 und 4361, die letzte im Foto kaum sichtbar). Hind III schneidet aber das lPhagen-DNA in 8 Fragmenten auf einem 1% Agarosegel. Die unteren Banden sind nicht zu sehen. Es ist sehr wahrscheinlich, dass die Konzentration vom verdautem lPhagen-DNA zu niedrig war, damit die Menge an den kleineren Fragmenten (mit 2322, 2027, 564 und 125bp) in Banden auf dem Gel sichtbar werden.

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