Ziel des Versuches ist es, die Konzentration einer DNA-, RNA- und Proteinstocklösung durch Photometrie zu bestimmen. Außerdem soll noch die Reinheit ausgerechnet werden.
Inhalt:
Konzentrationsbestimmung von DNA-, RNA- und Proteinlösungen
Versuchsabsicht
Materialien und Methoden
Ergebnisse & Fragen
Diskussion
Plasmididentifizierung: Grundlegende molekularbiologische Methoden
Versuchsabsicht
Materialien und Methoden
Ergebnisse
Diskussion & Fragen
Klonierung von GFP in E. coli
Versuchsabsicht
Materialien und Methoden
Ergebnisse
Diskussion & Fragen
Retrovirale Transduktion von CHO-Zellen
Versuchsabsicht
Materialien und Methoden
Ergebnisse
Diskussion & Fragen
cDNA-Produktion aus mRNA von HeLa-Zellen und Klonierung in E.coli
Versuchsabsicht
Materialien und Methoden
Ergebnisse
Diskussion & Fragen
RNA-Interference mittels siRNA in HeLa-Zellen
Versuchsabsicht
Materialien und Methoden
Ergebnisse
Diskussion & Fragen
Anhang
Inhaltsverzeichnis
Konzentrationsbestimmung von DNA-, RNA- und Proteinlösungen
Versuchsabsicht
Materialien und Methoden
Ergebnisse & Fragen
Diskussion
Plasmididentifizierung: Grundlegende molekularbiologische Methoden
Versuchsabsicht
Materialien und Methoden
Ergebnisse
Diskussion & Fragen
Klonierung von GFP in E. coli
Versuchsabsicht
Materialien und Methoden
Ergebnisse
Diskussion & Fragen
Retrovirale Transduktion von CHO-Zellen
Versuchsabsicht
Materialien und Methoden
Ergebnisse
Diskussion & Fragen
cDNA-Produktion aus mRNA von HeLa-Zellen und Klonierung in E.coli
Versuchsabsicht
Materialien und Methoden
Ergebnisse
Diskussion & Fragen
RNA-Interference mittels siRNA in HeLa-Zellen
Versuchsabsicht
Materialien und Methoden
Ergebnisse
Diskussion & Fragen
Zielsetzung & Themen
Das Hauptziel dieses Praktikumsprotokolls ist die praktische Anwendung und Dokumentation grundlegender molekularbiologischer und zellbiologischer Methoden zur Analyse von Nukleinsäuren, der Klonierung von Genen in Bakterien sowie der retroviralen Transduktion und RNA-Interferenz in eukaryotischen Zelllinien.
- Photometrische Konzentrationsbestimmung und Reinheitsanalyse von Nukleinsäuren und Proteinen.
- Identifizierung und Restriktionsanalyse von Plasmiden sowie Agarosegelelektrophorese.
- Klonierung von GFP-Genen in E. coli mittels Präparation, Ligation und Transformation.
- Retrovirale Transduktion von CHO-Zellen zur Untersuchung der Genexpression.
- Durchführung von RNA-Interferenz (Gene-Knockdown) mittels siRNA in HeLa-Zellen.
Auszug aus dem Buch
Plasmididentifizierung: Grundlegende molekularbiologische Methoden
In diesem Versuch wurde ein unbekanntes Plasmid identifiziert und die Identität eines anderen überprüft, die in den nächsten Versuchen verwendet wurden. Dafür dienten grundlegende molekularbiologische Methoden wie Restriktionsreaktionen mittels Endonukleasen, Agarosegelelektrophorese (AGE), Ansetzen von Bakterienkulturen und Herstellen von Midi-Preps (Mini- und Maxi-Preps basieren auf ähnliche Verfahren).
Es wurde 2 unbekannten Plasmide identifiziert. Für das erste Plasmid wurde eine Restriktionsreaktion mit zugehöriger Gelanalyse angesetzt. Hier wurden auch genomische Lachs-DNA und Phagen-DNA analysiert.
Zusammenfassung der Kapitel
Konzentrationsbestimmung von DNA-, RNA- und Proteinlösungen: Bestimmung der Konzentrationen mittels Photometrie und Berechnung der Reinheit über das OD260/280-Verhältnis.
Plasmididentifizierung: Grundlegende molekularbiologische Methoden: Identifizierung unbekannter Plasmide durch Restriktionsverdau und Gelelektrophorese sowie Durchführung von Midi-Preps zur Plasmidaufreinigung.
Klonierung von GFP in E. coli: Durchführung einer molekularen Klonierung durch Restriktion, Gel-Extraktion, Ligation und anschließende Transformation von Bakterien.
Retrovirale Transduktion von CHO-Zellen: Untersuchung der Genexpression mittels retroviralem Gentransfer, induziert durch Doxyzyklin und analysiert via FACS und Mikroskopie.
cDNA-Produktion aus mRNA von HeLa-Zellen und Klonierung in E.coli: Synthese von cDNA aus isolierter HeLa-RNA mittels RT-PCR und deren Klonierung zur Analyse spezifischer Genfragmente.
RNA-Interference mittels siRNA in HeLa-Zellen: Untersuchung eines gezielten Gene-Knockdowns des FGF-2-GFP Gens mittels siRNA-Transfektion und anschließender RT-PCR-Analyse.
Schlüsselwörter
Nukleinsäuren, DNA-Konzentration, Photometrie, Plasmididentifizierung, Agarosegelelektrophorese, Restriktionsenzym, Klonierung, E. coli, Retrovirale Transduktion, CHO-Zellen, RNA-Interferenz, siRNA, Gene-Knockdown, RT-PCR, Genexpression.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?
Das Dokument ist ein detailliertes Praktikumsprotokoll eines Biologiestudiums, das verschiedene grundlegende Methoden der Molekularbiologie und Zellbiologie dokumentiert.
Was sind die zentralen Themenfelder?
Die Arbeit deckt die Aufreinigung von Nukleinsäuren, die Genklonierung, zelluläre Transfektions- und Transduktionsmethoden sowie Verfahren zur Gen-Interferenz ab.
Was ist das primäre Ziel der Arbeit?
Das Ziel ist die praktische Dokumentation und Durchführung molekularbiologischer Arbeitsschritte, um Proteine und Nukleinsäuren zu analysieren, genetisch zu modifizieren und in lebenden Zellen zu untersuchen.
Welche wissenschaftlichen Methoden werden primär verwendet?
Zu den Methoden gehören unter anderem die Photometrie, Agarosegelelektrophorese, Restriktionsanalyse, Plasmidisolierung (Midi/Mini-Preps), Ligation, bakterielle Transformation, RT-PCR und RNA-Interferenz.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Der Hauptteil gliedert sich in sechs Versuchsblöcke, die von der Konzentrationsbestimmung bis hin zur gezielten Gen-Ausschaltung (Knockdown) in HeLa-Zellen reichen.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Die zentralen Schlagworte sind Molekularbiologie, DNA, RNA, Klonierung, Restriktionsanalyse, Transduktion und RNA-Interferenz.
Welche Rolle spielt die Agarosegelelektrophorese in den Versuchen?
Sie dient in fast allen Abschnitten der qualitativen Analyse von DNA-Fragmenten, um die Effizienz von Restriktionsverdaus, Klonierungsschritten und PCR-Reaktionen zu überprüfen.
Warum wird im Abschnitt zur retroviralen Transduktion Doxyzyklin verwendet?
Doxyzyklin dient als Induktor für ein responsives Element, um die kontrollierte Expression des in das Genom integrierten GFP-Gens zu steuern.
Was ist die Schlussfolgerung bezüglich des Erfolgs der Versuche?
Die Versuche waren teilweise erfolgreich, wobei Fehlerquellen wie falsche Inkubationsbedingungen im CO2-Inkubator oder mangelnde Konzentration der isolierten DNA diskutiert wurden.
- Citar trabajo
- Student Arlie Zegarra Pumapillo (Autor), 2008, Nukleinsäuren, Konzentration einer DNA-, RNA- und Proteinstocklösung. Ein Praktikumsprotokoll, Múnich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/114073
