Das lange QT-Syndrom (LQTS) ist eine lebensgefährliche Krankheit, die bei sonst völlig herzgesunden Menschen plötzlich zum Herztod führen kann. In der westlichen Welt stellt der plötzliche Herztod eine der häufigsten Todesursachen dar. In Deutschland sterben daran jährlich über 100 000 Menschen, in den USA geht man sogar von einer Inzidenz von über 1/1000 Einwohner pro Jahr aus (Priori S.G., 2001).
Das lange QT-Syndrom kann unter anderem durch pharmakologische Nebenwirkungen auf kardiale Ionenkanäle ausgelöst werden. Besonders häufig ist dabei der hERG-Kanal (human-ether-a-go-go-Related Gene) betroffen. Dieser ist für die schnelle Repolarisation des ventrikulären Aktionspotenzials verantwortlich.
Es bestehen Auflagen von den internationalen Zulassungsbehörden, Wirkstoffe grundsätzlich auf ihren Einfluss am hERG-Kanal zu testen. Die verschärften Anforderungen der Sicherheitspharmakologie erfordern schnelle und effiziente Testsysteme (Guenther E., BioPro, 2006). Die klassische Patch-Clamp-Technik, mit der Ionenkanäle auf ihre Funktion untersucht werden können, kann diesen Ansprüchen nicht mehr standhalten. Die sog. Patch-Automaten hingegen versprechen schnelle und kostengünstige Wirkstofftests.
In dieser Arbeit sollte eine Präparationsmethode für adhärent wachsende Zellen erarbeitet werden, mit der es möglich ist, diese bei gleich bleibenden passiven Membraneigenschaften für die Verwendung am Patch-Automaten in Suspension zu bringen.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1.1 Aufbau und Funktion des Herzens
1.2 Das ventrikuläre Aktionspotenzial
1.3 Angeborenes und erworbenes langes QT-Sydrom
1.3.1 Das kongenitale (angeborene) QT-Syndrom
1.3.2 Das erworbene QT-Syndrom
1.4 Der hERG-Kanal (human Ether-a-go-go-Related Gene)
1.5 Pharmakologie
1.5.1 Drug-Development-Pipeline
1.5.2 Sicherheitspharmakologie in Verbindung mit dem LQTS
1.5.3 Cisaprid
1.6 Effiziente Testsysteme
1.6.1 Konventionelle Patch-Clamp-Technik
1.6.2 Patch-Automat
1.7 Ziel der Arbeit
2 Material und Methoden
2.1 Zellkultur
2.1.1 Zellkultivierung
2.1.2 Auftauen der Zellen
2.1.3 Passagieren der Zellen
2.1.4 Zellpräparation
2.1.5 Viability-Test
2.2 Elektrophysiologie
2.2.1 Chemikalien und Geräte
2.2.2 Patch-Clamp-Messstand (Setup)
2.2.3 Durchführung der Patch-Clamp-Untersuchungen
2.2.4 Auswertung für die Untersuchungen für den Patch-Clamp-Automaten
2.2.5 Substanzapplikation
2.2.6 Statistische Auswertung hERG-Ströme
2.2.7 Statistische Auswertung der Messergebnisse des Wirkstofftests
3 Ergebnisse
3.1 Ergebnisse der Zellkultur
3.1.1 Zellwachstum
3.1.2 Viability-Test
3.2 Ergebnisse aus der Elektrophysiologie
3.2.1 Auswertung für adhärente Zellen
3.2.2 Auswertung accutasebehandelte Zellen
3.2.3 Auswertung versenebehandelte Zellen
3.2.4 Gegenüberstellung der Ausbeute für die drei Behandlungsmethoden
3.2.5 hERG-Ströme
3.2.6 Elektrophysiologische Eigenschaften von hERG-Strömen
3.2.7 Substanzapplikation (Cisaprid)
4 Diskussion
4.1 Diskussion der Ergebnisse aus der Zellkultur
4.2 Diskussion der Ergebnisse aus der Elektrophysiologie
4.2.1 Ausbeute und passive Membraneigenschaften der drei Behandlungsmethoden
4.2.2 hERG-Kaliumströme
4.2.3 Wirkstofftest
5 Zusammenfassung
Zielsetzung & Themen
Ziel dieser Bachelor-Thesis war die Identifikation einer optimalen Präparationsmethode für adhärent wachsende CHO-Zellen, um diese für automatisierte Patch-Clamp-Verfahren möglichst schonend in Suspension zu bringen, ohne deren elektrophysiologische Integrität zu beeinträchtigen.
- Vergleich von Accutase und Versene als Dissoziationsmedien für hERG-exprimierende CHO-Zellen.
- Untersuchung der passiven Membraneigenschaften (Seal-, Serien- und Membranwiderstand) nach unterschiedlichen Behandlungsmethoden.
- Analyse der Qualität und Stabilität von hERG-Kaliumströmen unter verschiedenen Dissoziationsbedingungen.
- Durchführung von pharmakologischen Wirkstofftests mit dem Prokinetikum Cisaprid zur IC50-Bestimmung.
- Evaluierung der Eignung suspendierter Zellen für automatisierte Patch-Automaten im Rahmen des "Aionas"-Forschungsprojekts.
Auszug aus dem Buch
1.6.2 Patch-Automat
Die konventionelle Patch-Clamp-Technik ist zeitaufwendig und erfordert erfahrene Anwender sowie gut ausgerüstete Messstände. Da die Sicherheitspharmakologie verschärfte Anforderungen stellt und nach schnellen, effizienten Testsystemen strebt, kann das klassische Patch-Clamping diesen Ansprüchen nicht mehr standhalten.
Man hat mit der automatisierten Patch-Clamp-Technik ein System gefunden, das einen sehr viel höheren Durchsatz von Wirkstofftests mit pharmazeutischen Substanzen bietet und mit dem zusätzlich viele Kosten eingespart werden können.
Beim automatisierten Patchen ist die konventionelle Patch-Pipette in der Regel durch einen planaren Chip ersetzt. Die Firma Cytocentrics z.B. setzt einen planaren Glaschip mit zwei konzentrischen Mikroöffnungen ein (Abbildung 10). Die Zelle wird also nicht manuell mit einer Glaspipette aufgesucht, sondern automatisch vom System angesaugt. Eine kleine zentrale Öffnung stellt die Patch-Öffnung dar, eine große umgebende Öffnung dient der Positionierung (www.cytocentrics.com).
Zusammenfassung der Kapitel
1 Einleitung: Diese Einleitung erläutert die klinische Relevanz des langen QT-Syndroms und die Notwendigkeit effizienter Wirkstofftests am hERG-Kanal für die Sicherheitspharmakologie.
2 Material und Methoden: Hier werden die Zellkulturbedingungen, die Patch-Clamp-Messtechnik sowie die statistischen Verfahren zur Auswertung der hERG-Ströme und Dosis-Wirkungskurven detailliert beschrieben.
3 Ergebnisse: In diesem Kapitel werden die Wachstumsdaten der CHO-Zellen präsentiert sowie die Auswirkungen verschiedener Dissoziationsmedien auf die Zellvitalität und die elektrophysiologischen Messparameter gegenübergestellt.
4 Diskussion: Die Ergebnisse werden kritisch bewertet, wobei die Eignung von Accutase gegenüber Versene für die Zellpräparation und die Stabilität der gewonnenen Messdaten diskutiert wird.
5 Zusammenfassung: Die Arbeit fasst zusammen, dass Accutase eine hervorragende Methode zur Zellpräparation für Patch-Automaten darstellt, da sie eine hohe Zellausbeute mit stabilen hERG-Strommessungen ermöglicht.
Schlüsselwörter
langes QT-Syndrom, hERG-Kaliumkanal, Pharmaka, Patch-Clamp-Technik, automatisiertes Patch-Clamping, suspendierte CHO-Zellen, Accutase, Versene, Cisaprid, Wirkstofftest, IC50-Wert, Sicherheitspharmakologie, Elektrophysiologie, Zellkultur, Membranwiderstand
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?
Die Arbeit untersucht, wie adhärent wachsende CHO-Zellen (die den hERG-Kaliumkanal exprimieren) für den Einsatz in automatisierten Patch-Clamp-Systemen optimal in Suspension gebracht werden können.
Welche zentralen Themenfelder werden bearbeitet?
Die Schwerpunkte liegen auf der Sicherheitspharmakologie, der Zellbiologie im Kontext von Patch-Clamp-Experimenten und dem Vergleich verschiedener enzymatischer Zell-Dissoziationsmethoden.
Was ist das primäre Ziel der Untersuchung?
Das Ziel war die Identifikation eines geeigneten Dissoziationsmediums (Versene oder Accutase), das die Zellen schonend ablöst, ohne die Qualität der elektrophysiologischen Daten oder die Integrität der Ionenkanäle negativ zu beeinflussen.
Welche wissenschaftliche Methode wird verwendet?
Es wurde die Patch-Clamp-Technik in der "Whole-Cell"-Konfiguration eingesetzt, ergänzt durch Vitalitätsprüfungen mit Trypanblau und statistische Analysen der Strom-Spannungs-Beziehungen.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Der Hauptteil umfasst den methodischen Aufbau der Experimente, die detaillierte Auswertung der Zellpräparation, die Messung von hERG-Strömen und die anschließende pharmakologische Charakterisierung durch Wirkstofftests mit Cisaprid.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Wesentliche Begriffe sind: Langes QT-Syndrom, hERG-Kaliumkanal, automatisierte Patch-Clamp-Technik, Accutase, Versene, Cisaprid und Zellpräparation.
Warum ist Accutase laut der Autorin für die Verwendung am Patch-Automaten besser geeignet als Versene?
Die Versuche zeigten eine signifikant höhere Zellausbeute und stabilere Messwerte bei der Verwendung von Accutase, während die Messerfolgsrate bei der Behandlung mit Versene deutlich geringer ausfiel.
Wie stabil erwiesen sich die Messungen im Zeitverlauf?
Sowohl bei adhärenten als auch bei accutasebehandelten Zellen konnte eine Abhängigkeit der Stromamplitude von der Zeit nach der Dissoziation beobachtet werden, während die mit Versene behandelten Zellen zwar stabilere, aber insgesamt deutlich kleinere Ströme zeigten.
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- Karin Sandmaier (Author), 2007, Die funktionelle Untersuchung von Arzneistoffen auf die Aktivität kardialer Ionenkanäle, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/114125
