Identifizierung und Analyse der menschlichen cDNA. Überprüfung einer Umklonierung von 5 Klonpaaren mittels PCR und Restriktion

Inhaltsverzeichnis

1. Zusammenfassung / Abstract
1.1. Zusammenfassung
1.2. Abstract

2. Einleitung
2.1. Humangenomprojekt (HUGO)
2.2. Deutsches cDNA-Humangenomprojekt
2.3. Gateway-Cloning
2.4. Aufgabenstellung

3. Material und Methoden
3.1. Material
3.1.1. Geräte
3.1.2. Kits
3.1.3. Chemikalien
3.2. Methoden
3.2.1. Plasmid-Präparation
3.2.2. Qualitätskontrolle
3.2.3. Polymerase Chain Reaction (PCR)
3.2.4. Restriktionsverdau
3.2.5. Agarose-Gelelektrophorese

4. Ergebnisse
4.1. Plasmid-Präparation und Qualitätskontrolle
4.2. Gelelektrophoretische Analyse der PCR und des Restriktionsverdaus

5. Diskussion
5.1. Plasmid-Präparation
5.2. Analyse der Umklonierung
5.3. Ausblick

6. Literaturverzeichnis

7. Anhang

Abkürzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1. Zusammenfassung / Abstract

1.1. Zusammenfassung

In dem durchgeführten Praktikum ging es um die Überprüfung einer Umklonierung des deutschen cDNA-Humangenomprojektes. Dabei stammen die 5 zu überprüfenden Klone aus einem Biologisch-Medizinischen Forschungszentrums (BMFZ) der Universität Düsseldorf, welches Teil des deutschen cDNA-Konsortiums war. Ziel des Projektes war die Identifizierung und Analyse der menschlichen cDNA. Dazu wurde die cDNA in Vektoren eingebaut, welche anschließend in Bakterien transformiert wurden. Aus diesen Vektoren konnte die eingebaute cDNA in andere Vektoren (z.B. Expressionsvektoren) umkloniert werden. Die Umklonierung wurde über die Gateway-Methode durchgeführt. Dabei wurde jeweils das FoI aus einem S-Klon mit dem Vektor pUC19 in einen D-Klon mit dem Vektor pDONR221 umkloniert.

Im Praktikum wurde das FoI am Agarosegel analysiert. Dazu wurden zuvor die Vektoren aus der Zelle isoliert, präpariert und auf Reinheit getestet. Dann wurde das FoI sowohl aus den Vektoren mittels Restriktionsverdau herausgetrennt als auch über die PCR amplifiziert. Zuletzt wurden die beiden Ansätze auf einem Agarosegel analysiert. Die Analyse der 5 Klone hat ergeben, dass die Umklonierung bei 2 Klonen fehlgeschlagen ist und bei einem Klon funktioniert hat. Für die anderen beiden Klone muss das Praktikum wiederholt werden, damit eine eindeutige Aussage getätigt werden kann.

1.2. Abstract

At the practical exam was proved whether the Gateway cloning of the German Human cDNA Project was successful. Based on this, the group got five clones of the BMFZ of the university of Dusseldorf. Dusseldorf´s BMFZ was a part of the cDNA consortium with the goal to identify and analyse the Human cDNA. For that reason the cDNA was built into vectors and transformed in bacteria like E.coli. From this vectors it was possible to clonide the cDNA into expression vectors. This was made by Gateway Cloning. The FoI was transformed from pUC19 into pDONR221.

The FoI was analysed with an gelelectrophoresis. Before the analysis the cells were broken and the vectors prepared for the examination of the purity. The fragment was segregated by restriction and PCR. The analysis of the clone pairs has shown that the Gateway cloning hasn´t gone in two of them but in one. The other two pairs have to be analysed another time to give an exact result.

2. Einleitung

2.1. Humangenomprojekt (HUGO)

Das Humangenomprojekt war ein von den USA initiiertes Forschungsprojekt zur DNA Sequenzierung des menschlichen Genoms. Das Projekt startete im Jahr 1990 und wurde erfolgreich im Jahr 2003 beendet. (Science, 1998) Das allgemeine Ziel ist es durch die ermittelte Gensequenz einen besseren Aufschluss über die Humanevolution, die Physiologie des Menschen und biomedizinische Aspekte zu erhalten. Der erste Anreiz zu diesem Projekt kam von der Organisation „US Department of Energy“. Sie wollten eine Kartierung des Genoms von Mensch, Maus, Fliege, Bakterium und Hefe erstellen. Forscher aus vielen Ländern zeigten ein großes Interesse zu diesem Projekt und so wurde 1990 das internationale Projekt: „Human Genome Organization (HUGO)“ gegründet. Zunächst wurde mit dem menschlichen Genom begonnen. Im Jahr 1995 wurde die Forschung um das Genom der Hefe Saccharomyces cerevisiae (Nature, PubMed, 1992) und des Fadenwurmes Caenorhabditis elegans (Nature, PubMed, 1994) erweitert, während das menschliche und das Mäusegenom weiter untersucht wurden. Noch während der Humangenomsequenzierung entstanden weitere Tochterprojekte, die sich mit der Identifizierung einzelner Gene beschäftigten. (Consortium, 2001)

2.2. Deutsches cDNA-Humangenomprojekt

Eines der Projekte, die während des Humangenomprojektes gegründet wurden, war das deutsche cDNA Genomprojekt. In diesem Projekt wurden für unterschiedliche Transkripte (mRNA) mit dem Enzym reverse Transkriptase cDNAs transkribiert, welche im Weiteren sequenziert und analysiert wurden. Der Vorteil einer cDNA besteht darin, dass hier im Gegensatz zu der gDNA keine Exone mehr vorkommen. Dies entsteht dadurch, da beim Spleißen Exone entfernt wurden. So kann die cDNA zum Beispiel eine vollständige Kodierung für ein Protein beinhalten. Ein weiterer Vorteil der cDNA ist, dass anhand der Sequenzanalyse erkannt werden kann, welche Bereiche in der gDNA für dieses expremierte Proteine als Exone vorliegen. In dem Projekt wurden 500 neue cDNAs, welche jeweils die vollständige Proteinkodierung beinhalten, identifiziert und analysiert. Außerdem wurden 1000 bekannte vollkodierende cDNAs identifiziert. Zur Identifizierung wurde die cDNA zunächst über die PCR amplifiziert. Dann wurden Adapter blunt an die cDNA ligiert. Zuletzt wurde das amplifizierte Fragment als open reading frame (ORF) in einen Expressionsvektor eingebaut. Das überexpremierte Protein wurde aufgereinigt und analysiert. (GenomeResearch, 2001) Für dieses Projekt haben wir 5 Ursprungsklongruppen zusammen mit den passenden 5 Zielklongruppen des Biologisch-Medizinischen Forschungszentrums (BMFZ) der Universität Düsseldorf bekommen. Die Umklonierung am BMFZ lief im Rahmen des deutschen Humangenomprojektes.

2.3. Gateway-Cloning

Zur Umklonierung im cDNA Humangenomprojekt wurden cDNA Fragmente aus Ursprungsvektoren in Zielvektoren über das sogenannte Gateway Cloning umkloniert. In dieser Methode wird der Mechanismus der 𝜆-Phage ausgenutzt, die im lysogenen Zyklus ihre DNA in das Bakterienchrosom einbaut. Im Gegensatz zu der Umklonierung durch Restriktion und Ligation ist das Gateway Cloning schneller, günstiger und effizienter. Bei der traditionellen Klonierung über Restriktionsenzyme und Ligasen sind die Klonierungserfolge stark eingeschränkt, da z.B. viele Restriktionsenzyme nicht verwendet werden können, da sie sonst innterhalb des Fragment of Interest (FoI) schneiden können und dieses dann unbrauchbar machen würden. Außerdem muss nach der Restriktion der Vektor z.B. in die Bakterien eingebaut werden. Da die Vektoren eine Antibiotikaressistenz tragen, wird zwar auf einem Antibiotika Nährboden sichtbar, welche Bakterien einen Vektor aufgenommen haben, aber dies bestätigt nicht, dass auch das FoI eingebaut wurde. Dazu müssen die Klone weiter untersucht werden, was viel Zeit und Mühe erfordert. Außerdem ist ein Erfolg nicht garantiert. Die Gateway-Cloning Methode hingegen hat eine hohe Erfolgsquote. Die 𝜆-Phage und das Bakterium besitzen attachment-sites (att) vor und hinter dem Fragment, welches rekombiniert wird. Dabei gibt es 4 Variationen von atts. Das attP, attB, attL und attR. Das Fragment an welchem beispielsweise attP sind kann durch PB-Clonasen, ein Klonase Enzym Mix, mit einem Fragment mit attB rekombinieren. Dabei entsteht durch diese Rekombination neue attachment-sites, die attL. Diese können wiederrum über LR-Clonasen mit attR zu attP rekombiniert werden. Somit handelt es sich bei dem Gateway-Cloning um eine Sequenz-spezifische Rekombination.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb.2.1.: Sequenz der attB-, attP-, attR- und attL-side (NCBI, 2014)

Dieser Mechanismus der 𝜆-Phage wird dazu genutzt ein FoI in einen Vektor einzubauen und kann anschließend für weitere Umklonierungen verwendet werden. Für die Umklonierung eines FoI in einen Vektor muss das FoI attachement sites aufweisen, welche vor der Amplifikation an das FoI fusioniert werden. Danach kann eine Amplifikation über die PCR stattfinden. Bei der Annahme das attB an das FoI fusioniert wurden, muss der Voktor attP enthalten. Der Ausgangsvektor (Donor Vector) enthält neben einem origin of Replication (oriR) und einer multiple cloning site (MCS) eine Ampicillinresistenz und zwischen den att ein ccdB-Gen. Dieses Gen kodiert ein toxisches Protein, welches die Zellteilung verhindert. Das Gen dient als zusätzliche Prüfmethode, ob das FoI eingebaut wurde, neben der Ampicillinresitenz. Das mit attB fusionierte DNA Fragment welches amplfiziert wurde kann mit dem Donor Vektor über BP-Clonasen rekombinieren. Dabei wird das ccdB-Gen aus dem Donor Vektor getrennt und das FoI wird in diesen Vektor umkloniert. Der Vektor wird nun als Entry Clone bezeichnet, da er das FoI trägt. Da die attB mit den attP rekombiniert wurden sind am Vektor attL entstanden. Diese Vektoren können zum Beispiel in E. Coli. transformiert und auf ein Ampicillin-Nährboden gesetzt werden. Dabei werden nur die Bakterien wachsen, die einen Vektor aufgenommen haben, aufgrund der Ampicillinresistenz, und welche das FoI enthalten, denn wenn dies nicht eingebaut wurde, bleibt das ccdB-Gen auf dem Vektor und dieses Bakterium kann somit nicht wachsen. Als nächstes kann mit dem Entry Vektor eine Umklonierung stattfinden. Dazu muss der Zielvektor (Destination Vector) attR und ebenfalls ein ccdB-Gen zwischen den att enthalten. Außerdem muss dieser eine andere Antibiotikaressistenz als der Entry Vektor enthalten. Über LR-Clonasen wird das FoI in den Zielvektor umkloniert, wohingegen das ccdB-Gen in den Entry Vektor umkloniert wird. Nach einer Transformation der Zielvektoren in Bakterien, werden diese auf einen Nährboden mit dem zweiten Antibiotikum gesetzt. Nur Bakterien die den Zielvektor enthalten können sich vermehren, da sie eine Antibiotikumressistenz gegen das zweite Antibiotikum aufweisen und das FoI enthalten müssen, da sonst das ccdB-Gen den Wachstum verhindern würde. Durch eine Kultivierung der Bakterien kann das FoI amplifiziert, expremiert und anschließend analysiert werden. (Research, 2000) (Scientific, kein Datum)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb.2.2.: Darstellung des Gateway-Clonings (invitrogen, 2012)

Das Gateway-Cloning ist für dieses Praktikum wichtig, da die zu untersuchende Umklonierung über dieses Verfahren stattgefunden hat. Dabei wurde ein cDNA Fragment aus dem Ausgangsvektor pUC19 (S-Klone) in den Zielvektor pDONR221 (D-Klone) umkloniert. Hier wurde das FoI jedoch nicht über Restriktions-enzyme aus dem Ausgangsvektor geschnitten, sondern über PCR amplifiziert. Dabei wurden die Primerbindestellen direkt vor und hinter das Insert gesetzt, sodass das amplifizierte Insert im Zielvektor kleiner erscheint. Das Insert sollten im D-Klon um folgende Basenpaarzahl kleiner sein:

Tab. 2.1.: Differenz des Umklonierten Inserts (Bayer, 2018)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.4. Aufgabenstellung

An diesem Versuchstag wurden die mittels Gateway-Cloning klonierten cDNA-Proben des Deutschen cDNA-Humangenomprojekts überprüft. Hierbei wurde die Umklonierung überprüft, in dem die Ausgangsprobe sowie die Endprobe mittels PCR und Restriktion auf das eingefügte DNA-Fragment hin untersucht wurden. Um das Fragment zu isolieren wurden zwei verschiedene Versuche vorgenommen. Zuerst wurden beide Klonproben (S5 und D5) restringiert, wobei bei dem S-Klon mit BamHI und HindIII geschnitten wurde und der D-Klon mit Bsr GI. Die Restriktion wurde in einem Zeitraum von einer Stunde vorgenommen. Zeitgleich wurden beide Klonproben in PCR-Ansätzen eingesetzt, um das gesuchte Fragment amplifizieren zu können. Die Länge der restringierten Fragmente wurde mit den Längen der mittels PCR amplifizierten Fragmente verglichen. Wenn die Längen bei den Proben der D- und S-Klone ähnlich groß sind, so kann angenommen werden, dass die Umklonierung erfolgreich war.

3. Material und Methoden

3.1. Material

3.1.1. Geräte

Tab.3.1.: Geräteliste

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

3.1.2. Kits

Tab.3.2.: Kittabelle

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

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