In dem durchgeführten Praktikum geht es um die Überprüfung einer Umklonierung des deutschen cDNA-Humangenomprojektes. Dabei stammen die 5 zu überprüfenden Klone aus einem Biologisch-Medizinischen Forschungszentrums (BMFZ) der Universität Düsseldorf, welches Teil des deutschen cDNA-Konsortiums war. Ziel des Projektes ist die Identifizierung und Analyse der menschlichen cDNA.
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung / Abstract
1.1. Zusammenfassung
1.2. Abstract
2. Einleitung
2.1. Humangenomprojekt (HUGO)
2.2. Deutsches cDNA-Humangenomprojekt
2.3. Gateway-Cloning
2.4. Aufgabenstellung
3. Material und Methoden
3.1. Material
3.1.1. Geräte
3.1.2. Kits
3.1.3. Chemikalien
3.2. Methoden
3.2.1. Plasmid-Präparation
3.2.2. Qualitätskontrolle
3.2.3. Polymerase Chain Reaction (PCR)
3.2.4. Restriktionsverdau
3.2.5. Agarose-Gelelektrophorese
4. Ergebnisse
4.1. Plasmid-Präparation und Qualitätskontrolle
4.2. Gelelektrophoretische Analyse der PCR und des Restriktionsverdaus
5. Diskussion
5.1. Plasmid-Präparation
5.2. Analyse der Umklonierung
5.3. Ausblick
Zielsetzung & Themen
Das Ziel dieses Praktikums ist die experimentelle Überprüfung der erfolgreichen Umklonierung von fünf Klonpaaren aus dem deutschen cDNA-Humangenomprojekt, bei der cDNA-Fragmente mittels der Gateway-Methode von einem Ausgangs- in einen Zielvektor überführt wurden.
- Grundlagen des Humangenomprojekts und Gateway-Cloning
- Methodik der Plasmid-Isolierung und Qualitätsprüfung mittels Photometrie
- Durchführung von Restriktionsverdaus zur Fragmentanalyse
- Amplifikation spezifischer DNA-Abschnitte mittels Polymerasekettenreaktion (PCR)
- Fragmentanalyse und Größenbestimmung über Agarose-Gelelektrophorese
Auszug aus dem Buch
2.3. Gateway-Cloning
Zur Umklonierung im cDNA Humangenomprojekt wurden cDNA Fragmente aus Ursprungsvektoren in Zielvektoren über das sogenannte Gateway Cloning umkloniert. In dieser Methode wird der Mechanismus der λ-Phage ausgenutzt, die im lysogenen Zyklus ihre DNA in das Bakterienchrosom einbaut. Im Gegensatz zu der Umklonierung durch Restriktion und Ligation ist das Gateway Cloning schneller, günstiger und effizienter. Bei der traditionellen Klonierung über Restriktionsenzyme und Ligasen sind die Klonierungserfolge stark eingeschränkt, da z.B. viele Restriktionsenzyme nicht verwendet werden können, da sie sonst innterhalb des Fragment of Interest (FoI) schneiden können und dieses dann unbrauchbar machen würden. Außerdem muss nach der Restriktion der Vektor z.B. in die Bakterien eingebaut werden.
Da die Vektoren eine Antibiotikaressistenz tragen, wird zwar auf einem Antibiotika Nährboden sichtbar, welche Bakterien einen Vektor aufgenommen haben, aber dies bestätigt nicht, dass auch das FoI eingebaut wurde. Dazu müssen die Klone weiter untersucht werden, was viel Zeit und Mühe erfordert. Außerdem ist ein Erfolg nicht garantiert. Die Gateway-Cloning Methode hingegen hat eine hohe Erfolgsquote. Die λ-Phage und das Bakterium besitzen attachment-sites (att) vor und hinter dem Fragment, welches rekombiniert wird. Dabei gibt es 4 Variationen von atts. Das attP, attB, attL und attR. Das Fragment an welchem beispielsweise attP sind kann durch PB-Clonasen, ein Klonase Enzym Mix, mit einem Fragment mit attB rekombinieren. Dabei entsteht durch diese Rekombination neue attachment-sites, die attL.
Zusammenfassung der Kapitel
1. Zusammenfassung / Abstract: Dieses Kapitel fasst die Zielsetzung des Praktikums zur Überprüfung von Umklonierungen mittels Gateway-Cloning zusammen und nennt die ersten Ergebnisse der Klon-Analysen.
2. Einleitung: Hier werden der wissenschaftliche Kontext des Humangenomprojekts, die Bedeutung der cDNA und die theoretischen Grundlagen des Gateway-Cloning-Verfahrens dargelegt.
3. Material und Methoden: Dieser Abschnitt beschreibt detailliert die verwendeten Geräte, Kits und Chemikalien sowie die Protokolle für Plasmid-Präparation, PCR, Restriktionsverdau und Gelelektrophorese.
4. Ergebnisse: Dieses Kapitel präsentiert die durchgeführten Analysen der Proben mittels Photometrie und die Auswertung der Agarosegele zur Identifizierung der Vektor- und Fragmentgrößen.
5. Diskussion: Hier findet die kritische Interpretation der Ergebnisse statt, wobei der Erfolg der Umklonierung für jeden der fünf Klonstämme einzeln bewertet und begründet wird.
Schlüsselwörter
Molekulargenetik, Gateway-Cloning, cDNA, PCR, Restriktionsverdau, Gelelektrophorese, Plasmid, Vektor, DNA-Analyse, Humangenomprojekt, pUC19, pDONR221, Bakterientransformation, ccdB-Gen, Fragmentlänge.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in diesem Praktikum primär?
Es geht um die Überprüfung der korrekten Umklonierung von fünf spezifischen cDNA-Klonpaaren des deutschen cDNA-Humangenomprojekts von einem Ausgangsvektor in einen Zielvektor.
Welche zentralen Themenfelder werden abgedeckt?
Die Arbeit behandelt die Theorie des Gateway-Clonings, die praktische Plasmid-Aufreinigung, die enzymatische DNA-Analyse sowie die PCR-Amplifikation und Gelelektrophorese.
Was ist das wissenschaftliche Ziel der Arbeit?
Das Ziel ist die experimentelle Verifizierung, ob das "Fragment of Interest" erfolgreich vom Ausgangs- in den Zielvektor umkloniert wurde, basierend auf der Analyse der resultierenden Fragmentgrößen.
Welche molekularbiologischen Methoden kommen zum Einsatz?
Es werden die alkalische Lyse zur Plasmid-Präparation, die Polymerasekettenreaktion (PCR), der Restriktionsverdau mit spezifischen Enzymen und die Agarose-Gelelektrophorese genutzt.
Welche Klonpaare wurden im Detail untersucht?
Insgesamt wurden fünf Klonpaare (S1-S5 und D1-D5) des Biologisch-Medizinischen Forschungszentrums der Universität Düsseldorf analysiert.
Was wurde in der Diskussion festgestellt?
Die Analyse ergab, dass die Umklonierung bei einigen Klonen fehlgeschlagen ist, bei einem Klon erfolgreich war und bei weiteren Proben keine eindeutige Aussage möglich ist.
Warum spielt das ccdB-Gen beim Gateway-Cloning eine Rolle?
Das ccdB-Gen kodiert ein toxisches Protein, das die Zellteilung verhindert und somit als Selektionsmarker dient, um sicherzustellen, dass Bakterien nur überleben, wenn das Fragment korrekt eingebaut wurde.
Welche Rolle spielt die Gelelektrophorese bei diesem Versuch?
Sie dient der Auftrennung und Größenbestimmung der DNA-Fragmente nach Restriktion oder PCR, um durch Vergleich der Längen den Erfolg der Umklonierung beurteilen zu können.
- Citar trabajo
- Daniel Waschestjuk (Autor), 2018, Identifizierung und Analyse der menschlichen cDNA. Überprüfung einer Umklonierung von 5 Klonpaaren mittels PCR und Restriktion, Múnich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/1168903
