Tierexperimentelle Untersuchung zum Einfluss von Sirolimus auf die Wundheilung

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung

2 Stand der Forschung
2.1 Wundheilung
2.2 Einfluss der immunsuppressiven Therapie auf die Wundheilung
2.3 Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)
2.4 Transforming Growth Factor Beta (TGF-ß)
2.5 Induzierbare Stickstoffmonoxidsynthase (iNOS)

3 Fragestellung

4 Material und Methoden
4.1 Material
4.1.1 Versuchstiere
4.2 Methoden
4.2.1 Sirolimus-Applikation
4.2.2 Operation
4.2.3 Materialgewinnung und Materialverarbeitung
4.2.4 Sirolimus-Bestimmung im Serum
4.2.5 Messung der mechanischen Reißfestigkeit der Wunde
4.2.6 Hydroxyprolinbestimmung
4.2.7 Bestimmung von Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in der Wundflüssigkeit
4.2.8 Bestimmung von Transforming Growth Factor (TGF-ß) in der Wundflüssigkeit
4.2.9 Bestimmung der Gesamtproteinmenge in der Wundflüssigkeit
4.2.10 Histologische Übersichtsfärbung (Hämatoxylin-Eosin Färbung)
4.2.11 Immunhistochemische Färbung
4.3 Datenverarbeitung
4.3.1 Software
4.3.2 Statistische Auswertung

5 Ergebnisse
5.1 Einfluss von Sirolimus und Operation auf das Körpergewicht
5.2 Einfluss von Sirolimus auf die Wundheilungsparameter
5.2.1 Wundreißfestigkeit der formalinfixierten Hautproben
5.2.2 Hydroxyprolingehalt des Granulationsgewebes
5.2.3 Einfluss von Sirolimus auf die Konzentration von VEGF und TGF-ß
5.2.4 Gesamtproteinkonzentration in der Wundflüssigkeit
5.2.5 Histologische Übersichtsfärbung (Hämatoxylin-Eosin Färbung)
5.2.6 Immunhistochemische Färbung

6 Diskussion
6.1 Wundmodell
6.2 Gewicht im Versuchsverlauf
6.3 Einfluss von Sirolimus auf die Wundheilung
6.4 Einfluss von Sirolimus auf die Expression von VEGF, TGF-ß und iNOS in Wunden
6.4.1 Vascular endothelial growth factor (VEGF)
6.4.2 Transforming growth factor (TGF-ß)
6.4.3 Induzierbare NO-Synthase (iNOS)
6.5 Schlussfolgerung und Ausblick

7 Zusammenfassung

8 Literaturverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1 Einleitung

Die Wundheilung hat eine zentrale Beutung nach chirurgischen Eingriffen. Sie ist zudem Voraussetzung für das Abheilen chronischer Wunden bei immunkompromittierten Patienten mit Tumorleiden, Sepsis oder Diabetes mellitus, sowie nach Polytrauma oder einer Organtransplantation. Für den Ablauf einer komplikationslosen Wundheilung sind eine Reihe von komplexen zellulären und molekularen Mechanismen notwendig, die unter normalen Bedingungen dazu führen, dass sich die Wundränder verschließen und sich Narbengewebe ausbildet [112]. Um verschiedene Einflussfaktoren auf die Wundheilung zu untersuchen, wie z.B. medikamentöse Therapie oder ischämische Prozesse, ist es notwendig, sich zunächst mit dem physiologischen Ablauf der Wundheilung vertraut zu machen. Clark beschreibt die Wundheilung der Haut als eine Integration dynamischer interaktiver Prozesse zwischen löslichen Mediatoren, festen Blutbestandteilen, extrazellulärer Matrix und Parenchymzellen [28,30]. Die einzelnen Phasen der Wundheilung werden dabei von komplexen Kontrollmechanismen geführt, die eine Initiation des Heilungsprozesses und eine Regeneration des Hautgewebes gewährleisten [94]. Zu den einzelnen Wundheilungsprozessen zählen vor allem Blutgerinnung, Entzündungsreaktion, Zellreplikation, Epithelialisierung, Angiogenese, Einlagerung von Matrix, Wundmodulation und Narbenbildung [80]. Zur Untersuchung dieser Phasen der Wundheilung hat sich seit Jahren ein Wundmodell im Tierversuch mit Ratten etabliert. Schon 1968 untersuchte Aspesos den Wundheilungsprozess unter ischämischen Bedingungen im Tiermodell [10]. Das in dieser Arbeit verwandte Wundmodell wurde 1957 von Edwards etabliert und gilt als Standardmodell in der Wundheilungsforschung [5,13,102,103,120,152].

Das Immunsystem besitzt bei der Wundheilung eine zentrale Rolle [48,147]. Die Regulation der Wundheilung durch lokale Produktion von Wachstumsfaktoren, welche Entzündungszellen sowohl autokrin als auch parakrin beeinflussen, wird in der Literatur intensiv belegt [41,74]. Dabei sind Wachstumsfaktoren eng in die Wundheilung eingebunden und gerade bei der Initiation des Heilungsprozesses ist ihre Freisetzung durch immunkompetente Zellen von enormer Wichtigkeit [51]. Zu den Hauptaufgaben dieser Wachstumsfaktoren zählen, neben Chemotaxis und Modulation von Entzündungszellen, die Stimulation von Fibroblasten und Endothelzellen. Damit gewährleisten sie eine für die Neoformation von Granulationsgewebe essentielle Kollagensynthese und Neovas- kularisation [107]. Als wichtige Zytokine für den physiologischen Ablauf der Wundheilung haben sich u.a. Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) und Transforming Growth Factor Beta (TGF-ß) erwiesen, die eine Schlüsselrolle bei der Wundmodulation spielen [37,52]. Auch die zentrale Bedeutung des Stickstoffmonoxid- stoffwechsels und die Expression des Schlüsselenzyms induzierbare Stickstoffmonoxid- synthase (iNOS) für den Ablauf einer komplikationslosen Wundheilung ist mehrfach untersucht worden [11].

In dieser Arbeit wurde die Expression der drei Mediatoren VEGF, TGF-ß und iNOS am 10. postoperativen Tag immunhistochemisch untersucht und mit anderen Wundheilungs- parametern korreliert, um eine mögliche Aussage über den Ablauf der Wundheilung treffen zu können.

Das Medikament Sirolimus ist ein immunsuppressives Agens, dass in der Transplantationschirurgie einen festen Stellenwert erlangt hat. Klinisch wird es zur Prophylaxe einer Abstoßungsreaktion nach Organtransplantation eingesetzt. Sowohl in klinischen als auch in experimentellen Studien wurde die pharmakologische Wirkung von Sirolimus auf die Wundheilung untersucht. Dabei wurde ein inhibitorischer Effekt von Sirolimus auf die Fibroblastenaktivität beschrieben, der mit einer Beeinträchtigung der Wundheilung einhergeht [88]. Unter anderem durch eine Beeinträchtigung von Fibroblastenfunktion und Angiogenese kam es in einer aktuellen Studie in 35 - 50 % der mit Sirolimus therapierten Patienten zu chirurgischen Komplikationen wie Lymphozelen, Wunddehiszensen, und Abszessen [67]. Auch die Inzidenz von Wundinfektionen im Rahmen einer Sirolimustherapie wurde untersucht und dabei eine erhöhte Infektionsgefahr aufgrund unzureichend abgeschlossener Wundheilung vermutet [3]. In einer prospektiv randomisierten Studie wurde eine höhere Inzidenz an postoperativen Wundkomplikationen bei einer Therapie mit Sirolimus gegenüber einer Therapie mit dem Immunsuppressivum Tacrolimus nachgewiesen (47 % vs. 8 %, p <0.0001) [40].

Der genaue Mechanismus dieser möglichen Beeinträchtigung der Wundheilung durch Sirolimus, unter Berücksichtigung der Wirkung auf die Zytokin vermittelte Wund- modulation, bleibt jedoch ungeklärt.

In unserer Arbeit untersuchten wir im Tierversuch die dermale Wundheilung unter immunsuppressiver Therapie mit Sirolimus am 10. postoperativen Tag und testeten eine mögliche Inhibition der Mediatoren VEGF, TGF-ß und iNOS.

2 Stand der Forschung

2.1 Wundheilung

Der Wundheilungsprozess wird in verschiedene Phasen unterteilt, die zeitlich versetzt ablaufen: Koagulation, Entzündung, Proliferation und Modulation [29,80,81].

Koagulationsphase

Sofort nach Hautgewebsverletzung führt eine lokale Aggregation von Blutplättchen zur Hämostase. Dabei setzen Thrombozyten Wachstumsfaktoren frei, vor allem Platelet- derived Growth Factor (PDGF), Transforming Growth Factor-α (TGF-α), Transforming Growth Factor-ß (TGF-ß), Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1), Fibroblast Growth Factor (FGF) und Epidermal Growth Factor (EGF). Die meisten dieser Moleküle werden zudem auch von Monozyten oder Makrophagen synthetisiert [159]. Diese Zytokine haben einen Effekt auf die Proliferation und Migration von Endothelzellen, Fibroblasten, Monozyten und Epithelzellen. Auch Leukozyten werden dabei durch Freisetzung vasoaktiver und chemotaktischer Faktoren aus der Gerinnungskaskade, dem Komplementsystem und beschädigten Zellen rekrutiert und in die frühe Phase der Wundheilung miteinbezogen [29].

Entzündungsphase

Der Ablauf der Entzündungsphase ist ein komplexes Zusammenspiel zahlreicher Noxen und Mediatoren, welche nach einer Wundsetzung in das betroffene Gewebe eingeschwemmt werden [172]. Nach 6 Stunden ist im Wundgewebe eine erhöhte Konzentration verschiedener Entzündungszellen nachzuweisen [175]. Dabei sind neutrophile Granulozyten die ersten Zellen, die aktiv in die Wunde einwandern und Enzyme freisetzen [91]. Unterstützt durch die von Entzündungsmediatoren vermittelte Vasodilatation mit konsekutiver Strömungsverlangsamung und erhöhter Kapillar- permeabilität kommt es nun entlang der Konzentrationsgradienten chemotaktischer Substanzen zur Granulozytenmigration in die Wunde [147]. Ihre Aufgabe besteht in der unspezifischen Immunabwehr gegen Bakterien und im Wunddébridement [157].

24 Stunden nach einem Trauma dominieren auch im Wundsekret vor allem neutrophile Granulozyten und einige wenige Lymphozyten. Nach 48 Stunden zeigen sich hohe Konzentrationen an Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen und einigen Fibroblasten [174,175]. Neben Wachstumsfaktoren werden Monozyten und Makrophagen durch verschiedene Faktoren wie Hypoxie, Laktat, Fibronektin, Kollagen, Elastin und endotheliale Integrine stimuliert und phagozytieren pathogene Keime, Zelldedritus und Proteine [91]. Durch autokrine Mechanismen werden von Makrophagen, Monozyten und Lymphozyten weitere Zytokine synthetisiert, darunter IGF-1, TGF-ß, PDGF, VEGF, Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α), Interleukin-1 (IL-1) und Interleukin-2 (IL-2) [29,45,91,130]. Wundmakrophagen, die sich vornehmlich aus im Blut zirkulierenden Monozyten differenzieren, erscheinen ab dem 2. Tag in der Wunde und stellen die größte Zellfraktion zwischen dem 3. und 5. Tag der Heilung [147]. Lymphozyten erreichen am 7. Tag der Heilung ihre größte Konzentration und während der späten Entzündungs- und frühen Proliferationsphase modulieren verschiedene Subtypen von T-Lymphozyten die Bildung der Extrazellulärmatrix [48]. Im Gegensatz zu Granulozyten sind Makrophagen und Lymphozyten unentbehrlich für eine normale Heilung [48,99].

Proliferationsphase

Die Proliferationsphase ist charakterisiert durch die Bildung von Granulationsgewebe, das sich aus Makrophagen, Myofibroblasten und Fibroblasten zusammensetzt. Diese Zellen sind eingebettet in eine Extrazellulärmatrix aus Fibronektin, Blutgefäße, Hyaluronsäure und interstitiellem Kollagen. Die Syntheseaktivität der Fibroblasten wird zum großen Teil von TGF-ß, aber auch von anderen Wachstumsfaktoren wie dem Adhäsionsmolekül Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) oder Stickstoffmonoxid (NO) angetrieben [31,147]. Am 3. Tag sind Fibroblasten zusammen mit neu gebildetem Typ-III-Kollagen, später dann Typ-I-Kollagen, im Wundgewebe vorhanden [1]. Die Fibroblasten unterlaufen dann einigen phänotypischen Änderungen, um verschiedene Funktionen zu erlangen [91]. Diese Funktionen beinhalten die Proliferation, Migration und die Synthese von extrazellulären Matrixproteinen [31]. Neovaskularisation setzt ab dem 2. Tag ein, wenn unter dem Einfluss von Zytokinen, einer niedrigen Sauerstoffkonzentration und einer hohen Laktatkonzentration Kapillaren in das Wundgewebe einsprießen [91]. Während der Angiogenese findet eine dynamische Interaktion zwischen Endothelzellen, angio- genetischen Zytokinen (vor allem FGF, VEGF und TGF-ß), Angiopoetin und der umgebenen Extrazellulärmatrix statt [167]. Unter Hypoxiebedingungen wird die VEGF- Synthese auf das 5-fache des Ausgangsniveaus hochreguliert [85,160]. Mit der Abnahme von Entzündungszellen in der Wunde werden Wachstumsmediatoren zunehmend von anderen Zellen wie Fibroblasten, Endothelzellen und Keratinozyten synthetisiert.

Fibroblasten synthetisieren IGF-1, Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), TGF-ß, PDGF, VEGF und Keratinocyte Growth Factor (KGF). Endothelzellen produzieren TGF-ß, bFGF, PDGF, VEGF, und Keratinozyten synthetisieren VEGF, EGF, TGF-ß und TGF-α [147].

Wundmodulation

Die Phase der Wundmodulation beginnt um den 7. Tag und dauert bis zu zwei Jahren. Dabei wird das Fibronektin aus dem Wundgewebe entfernt und es kommt durch weitere Ablagerung von Typ-I- und Typ-III-Kollagen zur strukturellen Organisation der zellulären Matrix. Zunächst dominiert Typ-III-Kollagen im Wundgewebe; die reife Wunde besteht jedoch ebenso wie die normale Haut zu 90 % aus Typ-I-Kollagen. Während des Abheilungsvorgangs unterläuft das Wundgewebe kontinuierlichen zellulären Verän- derungen. Die Anzahl der Kollagenfibrillen nimmt zu und die Ablagerung von Proteoglykan bewirkt eine zusätzliche Stabilität des Hautgewebes [86]. Anfängliches Fibrin, später auch das von aktivierten Makrophagen gebildete Fibronektin und Thrombospondin-1 sowie andere (Glyko-) Proteine (z.B. SPARC – secreted protein acidic and rich in cystene) werden nach und nach durch Kollagen ersetzt [147]. Nach 2 - 3 Wochen wird der maximale Kollagengehalt im Wundgewebe erreicht [90]. Die Verdickung, Ausrichtung entlang der Belastungsrichtung und Quervernetzung der Kollagenbündel korreliert mit der zunehmenden Festigkeit der Wunde. Nach einem Monat erreicht das Wundgewebe 40 % der Reißfestigkeit von normalem Hautgewebe und überschreitet nur selten 80 % der Reißfestigkeit nach einem Jahr [91]. Im Gegensatz dazu erlangt beispielsweise Wundgewebe des Magens oder des Duodenums schon nach 20 - 40 Tagen der Heilung die Ausgangsstabilität wieder [65]. Die Bestandteile der Extrazellulärmatrix haben im weiteren Verlauf der Abheilung, nicht nur durch die Bildung eines passiven Gerüstes für einwachsende Zellen, sondern auch über die Wundmodulation eine große Bedeutung für den physiologischen Ablauf der Wundheilung. Es konnte gezeigt werden, dass die Hemmung der Thrombospondin-1-Synthese in Wunden durch lokale Applikation von Antisense-Thrombospondin-Oligomeren zu einer verzögerten Wundheilung führt [44]. Die Phase der Wundmodulation ist also geprägt von einem interaktiven Wechselspiel zwischen Extrazellulärmatrix und Wundzellen, die als Resultat ein stabiles, kollagenreiches Hautgewebe bewirken.

2.2 Einfluss der immunsuppressiven Therapie auf die Wundheilung

Die Transplantation eines Organs wurde im 20. Jahrhundert durch zwei entscheidende Entwicklungen möglich. Zum Einen war es die Etablierung der Technik zur Bildung von Gefäßanastomosen durch Dr. Alexis Carrel, zum Anderen war es die Entwicklung effektiver pharmakologischer Immunsuppression, um die Abstoßung des Allotransplantats zu verhindern.

1953 wurden Kortikosteroide erstmals im Tierversuch erfolgreich gegen eine Abstoßungsreaktion eingesetzt [42]. Medewar und Morgan konnten unabhängig voneinander an Kaninchen zeigen, dass die systemische Gabe von Steroiden die Überlebenszeit von Hauttransplantaten verlängerte [110]. 1963 wurde von Starzl erstmals eine Kombinationstherapie mit Azathioprin und Kortikosteroiden bei Nieren- transplantationspatienten erfolgreich angewandt und damit die bisherigen immun- suppressiven Regime enorm verbessert [110]. Bis zur Einführung der Cyclosporine im Jahre 1983 wurde die Kombination von Azathioprin und Steroiden als Standardtherapie zur Immunsuppression angesehen [132]. 1986 konnte durch die erste klinische Studie endgültig die Effizienz der Cyclosporine nachgewiesen und eine neue Gruppe der Immunsuppressiva, die Calcineurininhibitoren, bestätigt werden [14,76]. Als weitere Substanz dieser Gruppe wurde 1989 Tacrolimus hinzugefügt, das in einer klinischen Studie erfolgreich gegen eine Abstoßungsreaktion nach Lebertransplantation eingesetzt wurde. Dieses Ergebnis ließ sich auch unter maximaler Cyclosporintherapie nicht erzielen [92]. In den 90er Jahren wurde die immunsuppressive Therapie durch das Makrolidantibiotikum Sirolimus, oder Rapamycin, erweitert. Im Gegensatz zu den Cyclosporinen und Tacrolimus interagiert diese Substanz jedoch nicht mit Calcineurin, sondern bindet an den mTOR- Rezeptor (mammalian target of rapamycin), um eine Aktivierung der T-Zellen, vor allem durch eine Inhibition von Interleukin-2 (IL-2) zu blockieren [68]. Weitere pharmakologische Effekte von Sirolimus sind eine verminderte T-Zell-Antwort auf IL-2, IL-12, IL-7, IL-15, eine verminderte B-Lymphozyten und Thymozyten Proliferation, eine Inhibition des Übertritts der T-Lymphozyten aus der G1-Phase in die S-Phase des Zellzyklus und die Beeinflussung zahlreicher Zytokine (u.a. PDGF, TGF-ß, VEGF) [15].

Die Entwicklung und enorme Verbesserung der immunsuppressiven Therapie hat bis zur heutigen Zeit dazu geführt, dass die Transplantation eines Organs eine etablierte Therapieoption bei terminalen Organinsuffizienzen geworden ist. Sowohl die Letalität nach Transplantation, als auch die Inzidenz der Abstoßungsreaktionen konnten effizient gesenkt werden. Eine zunehmende Herausforderung im klinischen Alltag ist jedoch nun die Reduzierung der unerwünschten Wirkungen einer immunsuppressiven Therapie geworden. Neben den systemischen Komplikationen wie Infektionen bei Panzytopenie, Diabetes mellitus und Osteoporose sind vor allem Wundheilungsstörungen zu nennen. Wundheilungsstörungen und Wundinfektionen zählen heute zu den häufigsten Komplikationen nach Transplantation [116,185]. Bei verschiedenen immunsuppressiven Medikamenten wurden diese Wundheilungsstörungen beobachtet.

Eine Beeinträchtigung der dermalen Wundheilung durch Kortikosteroide wurde erstmals 1949 bei Patienten mit Weichteilverletzungen bemerkt, bei denen sich nur eine minimale Formation von Granulationsgewebe nach Gabe von Adrenocortikotropem Hormon (ACTH) zeigte [136]. Diese Beobachtungen wurden durch verschiedene tierexperimentelle Studien im Ratten- oder Kaninchenmodell bestätigt und ausgeweitet [6,49,115,128,137,146]. Auch in klinischen Studien konnte gezeigt werden, dass Kortikosteroide vor allem in hohen Dosierungen die Wundheilung durch Inhibition der Proliferation von Fibroblasten und Blutgefäßen beeinträchtigen [66,72,100]. Green verglich in einer klinischen Studie die postoperativen Wundheilungsstörungen von 38 Patienten, die nach Kolektomie oder Splenektomie Kortikosteroide erhielten, mit 22 Patienten, die nach der gleichen operativen Prozedur keine Kortikosteroide erhielten. Dabei zeigten sich bei den Patienten nach Kortikosteroidtherapie ein 5-fach erhöhtes Auftreten von Wundheilungsstörungen, wobei die Dauer der Kortikosteroidtherapie keinen entscheidenden Einfluss auf die Inzidenz der postoperativen Wundheilungskomplikationen hatte [66,72]. In einer weiteren klinischen Studie wurde ebenfalls die Inzidenz der postoperativen Wundheilungsstörungen nach Kortikosteroidtherapie untersucht und eine Inzidenz von 44 % bei den Kortisonpatienten gegenüber 22 % bei der Kontrollgruppe festgestellt [50]. In einer tierexperimentellen Studie konnte zudem eine verminderte Wundreißfestigkeit unter systemische Gabe von Kortison beobachtet werden [49]. Sowohl histologisch als auch durch den Nachweis einer verminderten Wundreißfestigkeit konnte also gezeigt werden, dass durch eine perioperative Gabe von Kortikosteroiden die postoperative Wundheilung gestört wurde.

Eine Beeinträchtigung der Wundheilung wurde auch bei anderen immunsuppressiven Substanzgruppen beobachtet. In tierexperimentellen Untersuchungen wurde die Wirkung von Tacrolimus auf die Wundheilung untersucht. Dabei wurde anhand des auch in unserer Arbeit verwendeten Tiermodells gezeigt, dass es nach Gabe von Tacrolimus (2,0 mg/kg KG) über 10 Tage nach Operation zu einer statistisch signifikanten Reduktion der Wundreißfestigkeit (p<0,01) und Abnahme des Kollagengehaltes (p<0,05) kommt [147,148]. In einer prospektiv randomisierten Studie wurden Wundheilungsstörungen nach immunsuppressiver Therapie mit Tacrolimus bzw. Sirolimus verglichen. Dabei wurden bei 28 % der Patienten (n = 77) Wundheilungskomplikationen festgestellt, davon 8 % bei Patienten der Tacrolimus-Gruppe und 47 % bei Patienten der Sirolimus-Gruppe [40].

Sirolimus wird in der Literatur in einigen Studien mit Wundheilungsstörungen in Verbindung gebracht. 1991 beschreibt Akselband erstmals eine durch Fibroblast Growth Factor (FGF) vermittelte inhibitorische Wirkung von Sirolimus auf die Proliferation von Endothelzellen und Fibroblasten, die für den Ablauf der physiologischen Wundheilung essentiell sind [2]. Flanagan untersuchte wenige Jahre später die Wirkung von Sirolimus auf die Proliferation von T-Lymphozyten und konnte eine Inhibition des Eintritts der Zellen in die S-Phase des Zellzyklus nachweisen [56]. Die zentrale Bedeutung der T- Lymphozyten für den geregelten Ablauf der Wundheilung ist bekannt [48,147]. Auch in einigen klinischen Studien konnte gezeigt werden, dass ein Zusammenhang zwischen Sirolimus und Wundheilungsstörungen besteht, der vor allem in der Transplantations- chirurgie zu einem zentralen Problem geworden ist. So beschreibt Guilbeau drei Fälle von Patienten, die nach Lebertransplantation und immunsuppressiver Therapie mit Sirolimus in Kombination mit Kortikosteroiden eine Verzögerung der Wundheilung mit Wunddehiszensen erfahren hatten. Als Sirolimus durch ein anderes Immunsuppressivum ersetzt wurde, waren die Wundheilungsstörungen rückläufig und die Wunden verschlossen sich komplikationslos [71]. In einer retrospektiven Studie wurden Wundheilungsstörungen nach Sirolimustherapie in Kombination mit Kortikosteroiden und Tacrolimus oder Cyclosporinen bei Nierentransplantationspatienten beobachtet. Dabei zeigten sich bei 53 % der Patienten der Sirolimusgruppe eine oder mehrere Wundheilungskomplikationen gegenüber 7 % der Patienten der Kontrollgruppe [168].

Es bleibt unklar, inwieweit das Ausmaß der Wundheilungskomplikationen in Abhängigkeit von einer Kombinationstherapie mit Sirolimus und anderen Immunsuppressiva steht. Der genaue Mechanismus, der für eine Beeinträchtigung der Wundheilung durch Sirolimus verantwortlich gemacht werden könnte, ist zudem noch nicht geklärt. Ob dieser Mechanismus durch eine Inhibition bestimmter Zytokine geschieht und ab welcher Dosierung diese Inhibition eintritt, soll Gegenstand unserer Arbeit sein.

2.3 Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)

VEGF ist ein dimerisches Glykoprotein mit einer strukturellen Homologie zum Zytokin PDGF. Es sind vier Homodimere bekannt, die sich in Größe und Löslichkeit unterscheiden (121, 165, 184 und 209 kd). Die verschiedenen Isomere von VEGF werden durch posttrankriptionales Splicing von einem einzelnen Gen generiert [53].

Eine VEGF-Synthese wurde vornehmlich in Endothelzellen, aber auch in Melanozyten nachgewiesen [34]. VEGF wird in verschiedenen stark vaskularisierten Geweben wie dem Ovar, den Nieren, dem zentralen Nervensystem und soliden Tumoren exprimiert [101,165]. Zu den Hauptaufgaben von VEGF zählt die Induktion der Mitogenese und der interstitiellen Kollagenasetranskription in Endothelzellen [171]. Zudem hat VEGF einen steigernden Effekt auf die vaskuläre Hyperpermeabiltät während der Wundheilung und verstärkt damit den Transport von Nährstoffen in das Wundgewebe [24]. Es konnte in einer tierexperimentellen Studie gezeigt werden, dass VEGF während des Wundheilungsprozesses in Keratinozyten an den Wundrändern vermehrt exprimiert wird [24]. Dabei scheint die Expression von VEGF stark von ischämischen Verhältnissen und verschiedenen Mediatoren, insbesondere der iNOS, angetrieben zu werden [101,165]. Ein Zusammenhang zwischen einer Inhibition der iNOS und einem daraus resultierenden verminderten VEGF-Gehalt im Wundgewebe wird beschrieben [79].

Die zentrale Bedeutung von VEGF für den Ablauf der physiologischen Wundheilung wird in der Literatur beschrieben. 1998 beschreibt Howdieshell eine erhöhte VEGF- Konzentration im Wundsekret bei Schweinen [78]. 1999 konnten diese Ergebnisse durch eine Antikörper vermittelte Inhibition von VEGF und dadurch bedingte Wund- heilungsstörungen bestätigt werden [77]. In einigen weiteren tierexperimentellen Untersuchungen zu Wundheilungsstörungen unter Hypoxiebedingungen wurde gezeigt, dass VEGF die Angiogenese während der Proliferationsphase entscheidend steigert [37,125,154,192]. Eine topische Applikation von VEGF führte darüber hinaus durch eine gesteigerte Angiogenese und durch Mobilisierung und Rekrutierung von Zellen aus dem Knochenmark zu einer Beschleunigung der Wundheilung bei diabetischen Mäusen [60]. In einer anderen tierexperimentellen Studie konnte sogar gezeigt werden, dass durch topische Gabe von VEGF eine Verzögerung des Wundheilung reversibel ist [117].

Auch in einigen klinischen Studien wurde die Bedeutung von VEGF für die Wundheilung untersucht. Wagner konnte bei Patienten mit akuten und chronischen Wunden sowohl im dermalen Wundgewebe als auch im Wundsekret 3-fach erhöhte VEGF-Konzentrationen nachweisen [178]. In einer anderen Studie wurden bei Patienten nach Brandverletzung 22- fach erhöhte VEGF-Konzentrationen am 14. Tag gemessen. VEGF war bei der Abheilung der Brandwunden entscheidend für den Wundverschluss und die Ausbildung eines Wundödems [83].

VEGF induziert eine Angiogenese im Rahmen der Wundheilung durch verschiedene Mechanismen. Zum Einen wirkt VEGF direkt mitogen auf Endothelzellen. Zum Anderen steigert es die vaskuläre Hyperpermeabilität und führt damit zur Einlagerung von Fibrinmatrix, die wiederum auch ein potenter Stimulus der Angiogenese ist [46]. Auf diese Weise trägt VEGF eine wichtige Funktion für den Ablauf der normalen Wundheilung.

2.4 Transforming Growth Factor Beta (TGF-ß)

Die Familie der TGF-ß Zytokine wurde erstmals im Rahmen von Untersuchungen der Fibroblastenstimulation in Anwesenheit von TGF-α entdeckt [164].

Es ist bekannt, dass TGF-ß verschiedene Zellinteraktionen steuert, die essentiell für die Wundheilung sind [52,118,134]. In der Literatur werden fünf verschiedene Subtypen von TGF-ß unterschieden, die in ihrer Bezeichnung von 1 - 5 durchnummeriert werden. In unserer Arbeit untersuchten wir immunhistochemisch die Konzentration von TGF-ß1 im Wundgewebe und im Wundsekret am 10. postoperativen Tag. Nach Synthese eines Precursor-Proteins werden die einzelnen TGF-ß Isomere abgespalten und liegen dann als Polypeptid mit 112 Aminosäuren vor. Das biologisch aktive TGF-ß ist eine Verbindung aus zwei Monomeren (meist ein Homodimer). Die verschiedenen TGF-ß Formen haben sehr ähnliche Funktionen, sind jedoch in ihren Aufgaben nicht vollkommen gleich. Ihr Wirkungsmechanismus variiert je nachdem, welche Zielzelle sie beeinflussen. Obwohl fast alle Zelltypen des menschlichen Organismus TGF-ß produzieren, wird es im Rahmen der Wundheilung vor allem von Fibroblasten, Thrombozyten und Monozyten gebildet. Sobald TGF-ß extrazellulär freigesetzt wurde, bindet es an Rezeptoren der Zellmembran und stimuliert dann auto- und parakrin über einen intrazellulären Signalweg die Zielzelle [52]. TGF-ß steuert verschiedene Zellarten, die für die Wundheilung von großer Bedeutung sind. Entzündungszellen, vornehmlich neutrophile Granulozyten und Makrophagen, werden durch TGF-ß chemotaktisch rekrutiert und lagern sich durch Migration im Wundgewebe ein. TGF-ß ist somit unerlässlich für die Entzündungsphase und ermöglicht Entzündungszellen, ihre Wirkung im Wundgewebe zu entfalten. Während der Proliferationsphase wird die Migration und Proliferation von Endothelzellen durch

Induktion der Expression des α5ß1-Integrins bewirkt [35]. Dadurch nimmt TGF-ß Einfluss auf die Angiogenese während der Wundheilung. Fibroblasten sind eine weitere Zellart, die sehr stark durch TGF-ß beeinflusst werden. Durch Chemotaxis und Stimulation der Proliferation entfaltet TGF-ß seine Wirkung an Fibroblasten und leitet somit die Produktion der Extrazellulärmatrix, insbesondere bestehend aus Kollagen und Fibronektin, ein [96]. Diese Beziehung zwischen TGF-ß und Fibroblasten ist fundamental für die Proliferationsphase und Wundmodulation während der physiologischen Wundheilung.

Die Bedeutung von TGF-ß für die Wundheilung wurde in verschiedenen tierexperimentellen Studien untersucht. 1986 beschrieb Ignotz eine TGF-ß vermittelte Stimulation der Expression von Fibronektin und Kollagen und deren Einbau in die extrazelluläre Matrix [82]. Im gleichen Jahr wurde durch Roberts in vivo eine Beschleunigung der Fibrose und Angiogenese und in vitro eine Stimulation der Kollagenformation durch TGF-ß beobachtet [143]. In mehreren tierexperimentellen Studien konnte gezeigt werden, dass TGF-ß eine signifikante Steigerung der Kollagensynthese und der Proliferation von Fibroblasten bewirkt und somit zu einer Beschleunigung der Wundheilung führt [37,108,114,122]. Anhand eines Tiermodells wurde mehrfach verdeutlicht, dass durch Glukokortikoide induzierte Wund- heilungsstörungen unter TGF-ß Wirkung reversibel sind [17,130,131,178]. Auch durch Bestrahlung verursachte Wundheilungsstörungen werden durch TGF-ß verbessert [18].

In einigen klinischen Studien wurde ebenfalls der Zusammenhang zwischen TGF-ß und dem Ablauf einer normalen Wundheilung hergestellt. So konnte im Wundsekret bei Patienten mit Dekubitus eine statistisch signifikante Erhöhung der TGF-ß Konzentration nachgewiesen werden [1,89]. In einer klinischen Studie mit 24 Patienten nach Hauttransplantation wurden im Wundsekret TGF-ß Konzentrationen von 3 - 4 ng/ml gemessen. Diese gegenüber den anderen im Wundsekret gemessenen Zytokinen erhöhte Konzentration spiegelt auch klinisch eine wichtige Beteiligung von TGF-ß an dem Ablauf der Wundheilung wider [125].

2.5 Induzierbare Stickstoffmonoxidsynthase (iNOS)

Bislang sind von den Stickstoffmonoxidsynthasen drei Isoformen bekannt: die endotheliale NO-Synthase (eNOS, Typ I), die induzierbare NO-Synthase (iNOS, Typ) und die neuronale NO-Synthase (nNOS, Typ III). Die verschiedenen Isoformen der iNOS werden zelltypspezifisch exprimiert und unterschiedlich reguliert [111]. Die eNOS und die nNOS sind kalziumabhängig und werden Calmodulin vermittelt aktiviert [124]. Ein wesentlicher Unterschied zwischen den einzelnen Unterformen der Stickstoffmonoxidsynthase ist darin zu sehen, dass die eNOS und die nNOS in der Lage sind, Stickstoffmonoxid (NO) in einem zeitlich begrenzten Rahmen von wenigen Minuten zu synthetisieren [109]. Hingegen produziert die iNOS größere Mengen NO im zeitlichen Bereich von Stunden und Tagen [176].

Die induzierbare NO-Synthase wurde zunächst in Makrophagen nachgewiesen [162]. Später fand sich auch eine Expression der iNOS in Mesangial- und Tubuluszellen der Niere [58,93,129]. Das von der iNOS in hoher Konzentration bereitgestellte Stickstoffmonoxid ist ein wichtiger Effektor in der unspezifischen Immunabwehr [58,93]. Die Aktivität der iNOS und die freigesetzte NO-Menge ist abhängig vom extrazellulären Angebot an L-Arginin [121]. Es konnte gezeigt werden, dass NO direkt oder indirekt im Hautgewebe eine Vasodilatation, Angiogenese und Melanogenese auslöst [25,63,170,180]. Die Expression der iNOS wird im Rahmen der Entzündungsreaktion, z.B. nach mechanischen Traumen, thermischen Schäden und Exposition gegenüber Endo- oder Exotoxinen gesteigert [163]. Stimuli für die Expression der iNOS sind proinflammatorische Mediatoren wie Lipopolysaccharide, Tumor Nekrose Faktor-α (TNF- α), TGF-ß, IL-1 und Interferon γ (IFN-γ).

Die Bedeutung der iNOS für die Wundheilung wurde durch verschiedene tierexperimentelle Studien untersucht. 1996 wurde durch Schäffer im Tiermodell gezeigt, dass eine verminderte Konzentration an Stickstoffmonoxid, verursacht durch eine kompetetive Inhibition der NO-Synthase durch S-Methyl Isothiouronimum (MITU), mit einer statistisch signifikanten Verminderung des Kollagengehalts und der Wundreißfestigkeit einhergeht [147,149]. In einer weiteren Untersuchung wurde durch den Transfer des iNOS Gens eine Reversibilität von Wundheilungsstörungen erzielt [188]. Zu den Mechanismen mit denen die iNOS in die Wundheilung eingreift zählt die Induktion der Angiogenese. Es konnte gezeigt werden, dass ein Defizit an NO-Synthase die Wundheilung durch eine verminderte Angiogenese beeinträchtigt [98]. Auch durch eine Stimulation der Kollagensynthese scheint die iNOS am Wundheilungsprozess teilzunehmen. So wurde in einer in vitro Untersuchung von menschlichen Muskelsehnen eine gesteigerte Kollagensynthese unter dem Einfluss von iNOS beobachtet [186].

In der Literatur wird auch durch einige klinische Studien der bedeutende Zusammenhang zwischen der Expression von iNOS und einer physiologischen Wundheilung bestätigt. So wurde bei Patienten (n=16) mit chronischen Ulzera eine statistisch signifikant erhöhte mittlere Heilungsrate unter hoher iNOS-Expression gegenüber einer niedrigen iNOS- Expression festgestellt. Diese Ergebnisse haben verdeutlicht, dass eine hohe iNOS- Expression mit einer gesteigerten Wundheilungsrate zusammenhängt und möglicherweise sogar als Prognosefaktor genutzt werde könnte [106]. In einer aktuellen klinischen Studie wurde der Zusammenhang zwischen der iNOS und einer Wundheilung anhand von menschlichem Respirationsepithel untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Stickstoffmonoxid, synthetisiert mittels der iNOS, durch Stimulation der Epithelzell- migration wesentlich zur Reparation des Respirationsepithels beiträgt [19].

3 Fragestellung

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, im Tierversuch an Ratten die Auswirkungen des immunsuppressiven Medikaments Sirolimus (in Dosen von 0,5, 2 und 5 mg/kg KG) auf akute Wundheilungsprozesse zu untersuchen.

Hierzu wurde Sirolimus, beginnend am Tag vor der Operation, über 10 Tage oral appliziert. Nach Ablauf der 10 Tage erfolgte eine Einschläferung der Tiere. Anschließend wurden die mechanische Wundfestigkeit und der Kollagengehalt des Granulationsgewebes als Standardparameter der Wundheilung analysiert. Dieses Ergebnis wurde im Zusammenhang mit der Expression der Wundmediatoren VEGF, TGF-ß und iNOS im dermalen Wundgewebe diskutiert.

4 Material und Methoden

4.1 Material

4.1.1 Versuchstiere

Als Versuchstiere wurden 44 männliche Albinoratten vom Stamm Sprague-Dawley (Firma Charles River, Sulzfeld, Deutschland) mit einem Gewicht von 220 - 280 g verwendet. Eine Woche vor dem Versuch wurden die Tiere zur Akklimatisation in den Räumen der Versuchstierhaltung unter standardisierten Bedingungen (12 Stunden Tag-Nacht Zyklus, 22° C Raumtemperatur) untergebracht. Je zwei Ratten wurden in einem transparenten Käfig gehalten, der mit Sägemehl ausgestreut und durch ein Metallgitter abgedeckt war. Alle Tiere erhielten Standard-Trockenfutter und Wasser ad libitum. Sie wurden zusätzlich während des Versuchsverlaufs regelmäßig gewogen. Es wurden vier Versuchsgruppen gebildet, wobei drei Gruppen Sirolimus in verschiedener Dosierung (SIR0.5: 0,5 mg/kg KG/d, SIR2: 2 mg/kg KG/d, SIR5: 5 mg/kg KG/d) und die Kontrollgruppe ein Lösungs- mittel erhielten. Perioperativ verstarben acht Tiere (je ein Tier aus den Gruppen SIR0.5, SIR2, SIR5 und fünf Tiere aus der Kontrollgruppe) unter den Narkosebedingungen. Im Versuchsverlauf verstarben noch drei Tiere (zwei Tiere aus SIR5 und ein Tier aus der Kontrollgruppe) aus ungeklärter Ursache. Fünf zusätzliche männliche Albinoratten vom gleichen Stamm (Sprague-Dawley, Firma Charles River, Sulzfeld, Deutschland) wurden deshalb nachträglich operiert und der Kontrollgruppe zugefügt. Der Versuch wurde durch die Bezirksregierung Arnsberg gemäß § 8 des Tierschutzgesetzes am 23.09.2004 genehmigt.

4.2 Methoden

4.2.1 Sirolimus-Applikation

Die Ratten wurden randomisiert in 4 Gruppen (SIR0.5; SIR2; SIR5; Kontrollgruppe) zu je 11 Tieren verteilt. Die Tiere bekamen ihre erste Dosis Sirolimus bzw. Lösungsmittel einen Tag vor der Operation. Die weitere Applikation von Sirolimus erfolgte in Abständen von 24 Stunden über 10 Tage lang postoperativ. Die Tiere in jeder Gruppe erhielten Sirolimus oral unter Verwendung einer 1 ml Spritze mit aufgesetzter Knopfkanüle. Bei der Applikation wurde besonders auf die Platzierung der gebogenen Knopfkanüle in den Ösophagus geachtet, um eine mögliche Aspiration des Medikaments zu vermeiden. Den Ratten der Kontrollgruppe wurde 1 ml/kg KG Lösungsmittel (Ethanol 2 %) eingespritzt. Vor jeder Applikation wurden die Ratten gewogen, um die Sirolimusdosis zu berechnen und Gewichtsveränderungen zu dokumentieren.

4.2.2 Operation

4.2.2.1 Wundmodell

Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein von Edwards 1957 etabliertes Wundmodell verwendet, das als Standardmodell in der Wundheilungsforschung gilt [5,13,102,140,152]. Es beinhaltet die Implantation von Polyvinylalkohol-Schwämmchen in subkutane Taschen, die nach Setzen einer ca. 7 cm langen dorsalen Hautinzision frei präpariert wurden. Am 10. postoperativen Tag wurden die Tiere eingeschläfert und es erfolgte die Explantation und Isolierung der Schwämmchen. Sowohl das in die Schwämmchen eingewachsene Granulationsgewebe als auch das daraus gewonnene Wundsekret wurden untersucht. Unter normalen Wundheilungsbedingungen hat zu diesem Zeitpunkt bereits die proliferative und regenerative Phase mit Bildung des Granulationsgewebes, Neovaskularisation und Strukturierung der extrazellulären Matrix eingesetzt [75,158].

4.2.2.2 Vorbereitung der Polyvinylalkoholschwämmchen

Um die Polyvinylalkoholschwämmchen von Formalin zu reinigen, wurden sie für ca. 6 Stunden unter fließendem Leitungswasser gespült und anschließend bei Raumtemperatur getrocknet. Dann wurden die Schwämmchen gewogen, um den später darin enthaltenen Hydroxyprolingehalt auf das Schwammgewicht beziehen zu können. Vor der Implantation wurden die Schwämmchen für ca. 20 Minuten in steriler Natriumchlorid-Lösung (0,9 %) abgekocht und zur Wahrung des isotonischen Milieus in frische Natiumchlorid-Lösung überführt.

4.2.2.3 Operatives Verfahren

Die Operation erfolgte in einem speziell für Tiere ausgestatteten Operationsraum unter Wahrung der aseptischen Bedingungen. Zunächst wurden die Tiere markiert und gewogen, um die Narkosedosis zu berechnen. Die Narkoseeinleitung erfolgte dann durch intraperitoneale Injektion von Xylazin (Rompun®) 2 % (1 mg/kg KG) und Ketamin (Ketavet®) (100 mg/ml) im Verhältnis 1:3. Daraufhin wurde die Rückenhaut der Tiere elektrisch rasiert und mit Povidon-Iodlösung desinfiziert. Nach Befestigung der Tiere in Bauchlage auf dem Operationstisch wurde eine ca. 7 cm lange Hautinzision dorsal medial entlang der Wirbelsäule gesetzt und beidseitig subkutan Taschen stumpf präpariert. Dort wurden auf beiden Seiten der Hautinzision insgesamt zehn Polyvinylalkoholschwämmchen implantiert. Zum Schluss wurde die Wunde mit Hilfe eines Hautklammergerätes verschlossen. Nach Beendigung der Operation wurden die Tiere während der Aufwachphase mit Wärmelampen versorgt. Im Rahmen der Narkose verstarben acht Tiere (ein Tier je aus den Gruppen SIR0.5, SIR2, SIR5 und fünf Tiere aus der Kontrollgruppe).

4.2.3 Materialgewinnung und Materialverarbeitung

4.2.3.1 Isolierung und histologische Aufarbeitung der Hautgewebeproben

Die Tiere wurden 10 Tage nach der Implantation erneut in Rompun-Ketavetnarkose operiert, wobei sie eine Überdosis des Narkosemittels erhielten und durch transthorakale kardiale Punktion getötet wurden. Durch eine kardiale Punktion wurde Blut entnommen und zur Bestimmung des Sirolimus-Spiegels in EDTA-Monovetten aufgezogen. Danach wurden die Wundklammern entfernt und der Rücken der Tiere ca. 4 cm beiderseitig des OP-Schnittes rasiert. Nach Desinfektion mit Povidon-Iod-Lösung wurde daraufhin die Rückenhaut mit einem Skalpell in toto entfernt und mit einem Hautschneidegerät in sieben gleich große Streifen (8 x 80 mm) geschnitten, so dass die Narbe zentral in der Mitte im rechten Winkel zur Länge des Hautstreifen lag. Von jedem Tier wurden vier kraniale Hautstreifen auf vorgeschnittene 2 mm dicke Kartonstreifen (15 x 80 mm) mit Hilfe eines Heftklammerapparates befestigt und in 4 % Formaldehydlösung bei +4° C zur Messung der mechanischen Wundreißfestigkeit aufbewahrt (weitere Verarbeitung siehe 4.2.5.). Zwei weitere Hautstreifen wurden zur histologischen Aufbereitung in 4 % Formaldehyd- Lösung bzw. auf Trockeneis gelagert, um später Paraffin- oder ggf. Kryoschnitte anfertigen zu können. Dieses Hautgewebe wurde sowohl einer immunhistochemischen Färbung, als auch einer HE-Färbung unterzogen (siehe 4.2.10. und 4.2.11.).

4.2.3.2 Isolierung und histologische Aufarbeitung der Polyvinylalkoholschwämme

Die subkutan implantierten Schwämmchen wurden zunächst von dem umgebenden Granulationsgewebe mit einer Pinzette freigelegt und dann entnommen.

a) Hydroxyprolin-Bestimmung

Die zwei am weitesten kranial gelegenen Schwämme wurden in Alufolie verpackt, auf Trockeneis tiefgefroren und bei -80° C für die Hydroxyprolin-Bestimmung aufbewahrt. Die standardisierte Verwendung der am weitesten kranial gelegenen Schwämme erfolgte, da die Wundheilung erfahrungsgemäß kranial rascher erfolgt als in weiter kaudal gelegenen Arealen.

b) Immunhistochemie

Ein Schwamm (definiert als „2. Schwämmchen, rechts“) wurde nach 24stündigem Fixieren in gepufferter Paraformaldehyd-Lösung (4 %) in Gewebekassetten überführt und die Paraformaldehyd-Lösung 30 Minuten in fließendem Leitungswasser ausgewaschen. Es folgte eine stufenweise Entwässerung (Xylol 3 x 10 Minuten; Ethanol 100 %, 2 x 10 Minuten; Ethanol 96 %, 1 x 5 Minuten; Ethanol 70 %, 1 x 5 Minuten). Dann wurden die Schwämmchen in Paraffin eingebettet und am Rotationsmikrotom 4 µm dicke Schnitte hergestellt. Die Schnitte wurden auf Objekträger aufgezogen, getrocknet und anschließend immunhistochemisch gefärbt (siehe 4.2.10.).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1:

Exemplarisches Bild einer Ratte mit der ca. 7 cm langen Wunde am 10. postoperativen Tag. In die subkutan implantierten Polyvinylalkoholschwämmchen ist mittlerweile Granulationsgewebe eingewachsen.

4.2.3.3 Gewinnung der Wundflüssigkeit

Die restlichen sieben Schwämmchen wurden mit Hilfe einer Gewebefaßpinzette („russische Pinzette“) in 15 ml Röhrchen ausgepresst und die dabei anfallende Wundflüssigkeit in sterile Reagenzröhrchen pro Tier gesammelt und auf Trockeneis gekühlt. Dabei wurden ca. 0,5 ml des Wundsekrets zur Bestimmung der Sirolimus- Konzentration in ein 1 ml EDTA-Röhrchen überführt. Das restliche Wundsekret wurde zur Entfernung von Zellen und Zellresten für 20 Minuten mit 1200 g bei 4° C zentrifugiert. Der Überstand wurde durch einen Milipore-Filter (Durchmesser 0,45 µm) filtriert und zur späteren Zytokin-Bestimmung (VEGF und TGF-ß ELISA siehe 4.2.7. und 4.2.8.) in 1 ml Röhrchen bei -80° C gelagert. Ein Teil des Filtrats (ca. 200 µl) wurde für eine spätere Gesamtproteinbestimmung entnommen (siehe 4.2.9.)

4.2.4 Sirolimus-Bestimmung im Serum

Die Bestimmung von Sirolimus im Tierblutserum erfolgte mittels eines Mikropartikel- Enzym-Immunoassays (MEIA) mit Hilfe des Geräts IMx Sirolimus (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA). Die Methode des MEIA hat sich in mehreren Studien als sehr genau und reproduzierbar erwiesen. Die analytische Sensitivität des MEIA liegt bei unter 1,5 ng/ml. Zudem hat sich eine gute Korrelation zu anderen Referenzmethoden gezeigt [14,55,150]. Das Verfahren beruht auf einer kompetetiven Antikörperreaktion mit einem murinen monoklonalen Antikörper, der an karboxylierte Mikropartikel gebunden ist. Im Gegensatz zu chromatographischen Methoden, die lediglich die Muttersubstanz Sirolimus nachweisen, werden durch das Immunoassay-Verfahren sowohl die Muttersubstanz als auch einige Metaboliten durch die Kreuzreaktion der Sirolimus-Metabolite mit dem verwendeten Antikörper erfasst [181].

Am 10. postoperativen Tag wurden im Rahmen der Narkose durch kardiale Punktion 2 - 3 ml Blut entnommen und zur Bestimmung des Sirolimus-Spiegels in EDTA-Monovetten aufgezogen (siehe 4.2.3.1.). Zur Messung der Proben wurde den Anleitungen des Herstellers gefolgt. Die Proben wurden zunächst zentrifugiert und der Überstand (Serum) abpipettiert. Die 200 µl Serum wurde im Verhältnis 1:4 verdünnt und mit 300 µl einer Präzipitationslösung (IMX Sirolimus Whole Blood Precipitation Reagent) vorbehandelt. Das Gerät (IMx Sirolimus) wurde kalibriert und die Messung der einzelnen Proben wurde durchgeführt.

4.2.5 Messung der mechanischen Reißfestigkeit der Wunde

In der Wundheilungsforschung hat sich die Wundreißfestigkeit als objektiv messbarer, mechanischer Parameter der Wundheilung etabliert [13,64,126,152]. Bei dieser Methode wird mittels eines Tensiometers diejenige Zugkraft bestimmt, die erforderlich ist, um eine in der Heilungsphase befindliche, lineare Schnittwunde auseinander zu reißen. Die Messung der mechanischen Wundreißfestigkeit ist dabei ein grobes Maß der Wundfestigkeit und Wundadaption. Sie spiegelt die klinische Auswirkung der Wundheilungsstörung wider [18]. Zunächst wurde die explantierte Rückenhaut der Tiere auf Kartonstreifen befestigt und in 4 % Formaldehydlösung bei +4° C über 72 Stunden fixiert (siehe 4.2.3.1.). Die Formalinfixierung bewirkt eine vollständige Quervernetzung der Kollagenfibrillen in der Wunde und ermöglicht somit eine Aussage, inwieweit eine ungleiche Quervernetzung als Ursache von Festigkeitsunterschieden in Frage kommt [102,103].

Zur Messung der Wundreißfestigkeit wurde der Kartonstreifen, auf dem der Hautstreifen fixiert worden war, entfernt und der Hautstreifen zuerst am oberen Backen des Messgeräts eingespannt. Nach Eichung des Gerätes wurde anschließend das untere Ende des Hautstreifens in den unteren Backen eingespannt. Der Abstand der Backen betrug 31,5 mm und die Zuggeschwindigkeit 50 mm/min. Der Tensiometer zeigte den maximalen Wert der Zugkraft (in Newton) an, bei dem der Hautstreifen riss. Dieser Wert wurde als mechanische Wundfestigkeit notiert.

4.2.6 Hydroxyprolinbestimmung

Hydroxyprolin ist eine Aminosäure, die bei der Stabilisierung der Triple-Helix Struktur des Kollagens eine zentrale Rolle spielt. Sie ist ausschließlich im Kollagen in nennenswerter Menge zu finden [139]. Kollagen ist ein fibrilläres Protein, das als wichtigstes Strukturprotein der extrazellulären Matrix der Dermis gilt und überwiegend aus Monoaminosäuren besteht. Die Kollagenfasern bestimmen die mechanische Stabilität des Bindegewebes [87]. Zudem wird eine Beeinträchtigung der Wundheilung durch einen Mangel an Kollagen im Gewebe hervorgerufen [27].

Aufgrund des spezifischen Vorkommens von Hydroxyprolin im Kollagen gilt es als repräsentativer Parameter für den Kollagengehalt des Gewebes [27,152,183]. Um eine Aussage über den Kollagengehalt in den Schwämmchen treffen zu können, wurde somit der Hydroxyprolingehalt spektralphotometrisch gemäß der Methode nach Woessner bestimmt [183].

4.2.6.1 Probenvorbereitung

Das Gewicht der Schwämmchen wurde vor und nach der Implantation bestimmt. Eine Hydroxyprolin-Standardreihe (0; 100; 250; 500; 750; 1000; 1500; 1750 µg/100 ml; ausgehend von einer Hydroxyprolin-Stammlösung mit 0,001 M Salzsäure auf vorangehende Werte verdünnt) wurde unter identischen Bedingungen mitgeführt. Zunächst wurden die Standardproben, der Leerwert und die Schwämme der jeweiligen Tiere in säurefeste, hitzebeständige Röhrchen vorgelegt, dann wurden 4 ml 6 M Salzsäure hinzu- gefügt und der fertige Ansatz über 3 Stunden bei 130° C hydrolysiert. Anschließend wurde das Hydrolysat durch angefeuchtete Papierfilter filtriert. Es erfolgte die Zugabe von 30 µg Methylrot (0,01 % in Ethanol) als pH-Indikator und anschließend die Zugabe von 5 M Natronlauge, bis der Farbumschlag von rot nach gelb erfolgte. Mit 0,1 M Salzsäure bzw.

0,1 M Natronlauge wurde ein pH-Wert zwischen 6 und 6,5 eingestellt und die Proben mit Aqua bidest. auf ein Volumen von 25 ml aufgefüllt.

4.2.6.2 Hydroxyprolinmessung (Standardverfahren)

4.2.6.2.1 Methodik

Zu je 50 µl vorbereiteten Standards und Proben wurden 150 µl Aqua bidest. und 200 µl Chloramin-T-Arbeitslösung hinzugegeben, sorgfältig gemischt und 20 Minuten bei Raum- temperatur inkubiert. Im Anschluss erfolgte die Zugabe von 200 µl 3,15 M Perchlorsäure und eine weitere Inkubationszeit von 5 Minuten, um überschüssiges Chloramin-T zu eliminieren. Dann wurden 200 µl p-DABA-Lösung zum Ansatz pipettiert, sorgfältig gemischt und 20 Minuten bei 60° C im Wasserbad inkubiert. Nach Abkühlung der Proben unter Raumtemperatur wurden 100 µl als Doppelwert in eine unbeschichtete 96-well- Mikrotiter-Platte gegeben. Die optische Dichte wurde am ELISA-Reader bei 570 nm bestimmt und die Hydroxyprolin-Konzentration mit Hilfe der Eichkurve bestimmt.

4.2.6.2.2 Material und Reagenzien

- Substratpuffer:

34 g Natiumhydroxid wurden in 500 ml Aqua bidest. gelöst und anschließend 50 g Citonensäure-monohydrat, 120 g Natriumacetat-trihydrat und 12 ml Eisessig (Essig- säure 100 %) hinzugegeben und gelöst. Der pH-Wert wurde mittels 1 M Salzsäure bzw. 1 M Natronlauge auf 0,6 eingestellt und die Lösung mit Aqua bidest. auf 1000 ml aufgefüllt.

- Chloramin-T-Arbeitslösung:

In 20 ml Aqua bidest. wurden 1,41 g Chloramin-T-hydrat gelöst und 30 ml Methyl- cellosolve (Ethylenglycol-monomethyl-ether) und 50 ml Substratpuffer hinzu- gegeben und gemischt.

- 3,15 M Perchlorsäure (HClO4):

27 ml Perchlorsäure 70 % wurden mit 73 ml Aqua bidest. verdünnt.

- p-Dimethylaminobenzaldehyd-Lösung (p-DABA-Lösung): 20 g p-DABA wurden in 100 ml Methylcellosolve gelöst.

- Hydroxyprolin-Stammlösung (2 mg/ml) für die Standardreihe:

100 mg Trans-4-Hydroxy-L-Prolin wurden in 50 ml 0,001 M Salzsäure gelöst.

4.2.6.3 Hydroxyprolinmessung (Mikroassay)

Für Probenwerte, die unterhalb des niedrigsten Wertes der Standardreihe lagen, wurde ein Hydroxyprolin-Mikroassay angewandt [38]. Als Proben wurden die Hydrolysate aus

4.2.6.1. verwendet.

4.2.6.3.1 Methodik

a) Standardkurve

100 mg Trans-4-Hydroxy-L-Prolin wurden in 50 ml 0,001 M Salzsäure verdünnt (Stammlösung: 2 mg/ml). Durch weitere Verdünnung mit 0,001 M Salzsäure wurde die Standardreihe hergestellt (313 ng/ml, 625 ng/ml, 1250 ng/ml, 2500 ng/ml, 5000 ng/ml, 10000 ng/ml, 15000 ng/ml, 20000 ng/ml).

b) Testansatz

Standard und Probe wurden in eine 96-well-Mikrotiterplatte als Doppelwert pipettiert. Zu je 60 µl Hydrolysat wurden 20 µl Assay-Puffer und 40 µl Chloramin-T-Lösung hinzugefügt und bei Zimmertemperatur für 15 Minuten inkubiert. Anschließend gab man 80 µl p-DABA-Lösung hinzu, inkubierte erneut für 20 Minuten bei 60° C im Wasserbad und ließ die Platte dann abkühlen. Mit Hilfe des ELISA-Readers wurde die optische Dichte bei 570 nm gegen die Referenzwellenlänge 650 nm bestimmt und die Hydroxyprolin- Konzentration mit Hilfe der Eichkurve berechnet.

4.2.6.3.2 Material und Reagenzien

- Puffer-Stammlösung:

5 g Citronensäure-monohydrat, 11,9 g Natriumacetat-trihydrat, 7,2 g Natriumacetat- anhydrat und 3,4 g Natriumhydroxid wurden in 80 ml Aqua bidest. gelöst, mit Eisessig auf pH 6,1 eingestellt und auf ein Gesamtvolumen von 100 ml aufgefüllt.

- Assay-Puffer:

1-Propanol, Aqua bidest. und die Puffer-Stammlösung wurden im Verhältnis von 3:2:10 gemischt.

- Chloramin-T-Lösung:

0,282 g Chloramin-T-hydrat wurden in 1 ml 1-Propanol, 1 ml Aqua bidest. und 8 ml Puffer-Stammlösung aufgelöst.

- p-Dimethylaminobenzaldehyd-Lösung (p-DABA-Lösung):

2 g p-DABA wurden in 1,25 ml Methylcellsolve und 2,75 ml Perchlorsäure (70 %) gelöst.

4.2.7 Bestimmung von Vascular Endothelial Growth Factor in der Wundflüssigkeit

4.2.7.1 Methodik

Die Menge an VEGF in der Wundflüssigkeit wurde anhand eines Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) bestimmt. Der ELISA dient der quantitativen Analyse von Antigenen, Haptenen und Antikörpern und kann in drei unterschiedlichen Formen aufgebaut werden: als „Zwei-Antikörper-Test“, als „Antikörperbindungstest“ und

„Antigenbindungstest“. Zur quantitativen Bestimmung von VEGF wurde ein „Zwei- Antikörper-Test“ (Sandwich-ELISA) der Firma RayBiotech verwendet.

Bei dieser Methode wird eine 96-well-Mikrotiterplatte benutzt, die mit einem spezifisch gegen VEGF von Ratten gerichteten Antikörper beschichtet ist. Nach Anlegen einer Standardreihe werden die zu messenden Proben in die Mikrotiterplatte pipettiert, und das in den Proben enthaltene VEGF bindet an den immobilisierten Antikörper in den Vertiefungen der Platte. Nach mehrmaligem Auswaschen der Mikrotiterplatte wird ein biotinylierter, Spezies spezifischer, VEGF-Antikörper hinzu gegeben. Nach Auswaschen des ungebundenen biotinylierten Antikörpers wird ein mit Horseradish Peroxidase (HRP) konjugierter Streptavidin-Komplex in die Vertiefungen der Platte pipettiert, und nach erneutem Waschen wird TMB Substrat Lösung hinzugefügt. Es entwickelt sich ein Farbumschlag proportional zur Konzentration an VEGF in der jeweiligen Probe. Die Enzymreaktion wird daraufhin durch Zugabe von Salzsäure beendet. Die Farbintensität der Proben, nach einem Farbumschlag von blau nach gelb, wird schließlich photometrisch bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen.

Bei den einzelnen Schritten und Mengenverhältnissen des ELISA wurde den Anleitungen des Herstellers gefolgt.

4.2.7.2 Material und Reagenzien

Rat VEGF ELISA Kit (Firma RayBiotech, Inc; Cat#: ELR-VEGF-001):

- VEGF Mikrotiterplatte: 96 well-Platte, beschichtet mit anti-Rat VEGF Antikörper
- Waschpufferkonzentrat: 25 ml einer 20-fach konzentrierten Lösung
- Standardlösung: rekombinantes Ratten VEGF
- Verdünnungspuffer A: 30 ml, 0,09 % Salzsäure
- Detektionsantikörper VEGF: biotinyliertes anti-rat VEGF
- HRP-Streptavidin Konzentrat: 8 µl, 6000-fach konzentriertes HRP-konjugiertes Streptavidin
- TMB: 12 ml 3,3`, 5,5`-Tetramethylbenzidine in gepufferter Lösung
- Stop-Solution: 25 ml, 1 M Salzsäure

4.2.8 Bestimmung von Transforming Growth Factor in der Wundflüssigkeit

4.2.8.1 Methodik

Zur Bestimmung von Transforming Growth Factor (TGF-ß) in der Wundflüssigkeit wurde ein Sandwich-ELISA der Firma Promega verwendet. Dieser ELISA wurde zur sensitiven und spezifischen Bestimmung von biologisch aktivem TGF-ß entwickelt. Eine 96-well- Mikrotiterplatte, die mit einem unspezifisch gegen TGF-ß gerichteten monoklonalen Antikörper beschichtet wird, bindet in der Wundflüssigkeit enthaltenes freies TGF-ß. Das gebundene TGF-ß bindet wiederum an einen spezifischen polyklonalen Sekundär- antikörper. Nach mehrmaligem Auswaschen der Mikrotiterplatte wird die Menge des gebundenen Sekundärantikörpers durch die Reaktion mit einem Detektionsantikörper bestimmt. Dieser Spezies spezifische Antikörper ist zuvor mit HRP konjugiert und mit einem Farbstoff versehen worden. Nach erneutem Waschen und Inkubation mit einem chromogenen Substrat kommt es zu einem Farbumschlag. Anschließend werden die Proben photometrisch bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen. Die durch die abgelaufene Oxidations-Reduktions-Reaktion entstandene Farbintensität verhält sich dabei proportional zur Konzentration an TGF-ß im Wundsekret.

Bei den einzelnen Schritten und Mengenverhältnissen des ELISA wurde den Anleitungen des Herstellers gefolgt.

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