Zelladhäsion auf Kollagen IV mit variabler Kopplung zu Polymersubstraten

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungen und Formelzeichen

1. EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

2. GRUNDLAGEN
2.1 Copolymeroberflächen
2.2 Proteinadsorption / Verdrünungsversuche
2.3 Extrazelluläre Matrix (ECM)
2.3.1 Basis Membrane
2.4 Endothelzellen
2.5 Zell-Matrix Kontakte Fokale und Fibrilläre Adhäsionen
2.5.1 Integrin
2.6 Rezeptoren
2.6.1 Zytoskelett
2.6.2 Vinculin

3. METHODEN UND MATERIAL
3.1 Präparation der Zellkulturträger
3.2 Zellkultur
3.3 Zellversuche
3.4 Fluoreszenzfärbung
3.4.1 Labeln von Kollagen IV mit TAMRA
3.5 Mikroskopie
3.6 Proteinverdrängung

4. ERGEBNISSE UND DISKUSSION
4.1 Adsorption/ Desorption und Austauschprozesse
4.2 Prozess des Strukturenwachstums des Kollagen IV
4.3 Lokalisierung fokaler Adhäsionskomplexe
4.4 Adhäsionsrezeptoren

5. ZUSAMMENFASSUNG

Abbildungsverzeichnis

Tabellenverzeichnis

Literaturverzeichnis

Abkürzungen und Formelzeichen

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1 Einleitung und Zielsetzung

In der Medizin bildet das Tissue Engineering (Gewebezüchtung) zurzeit einen wichtigen Bereich. Ziel bei der Gewebezüchtung ist einem Patienten Zellen zu entnehmen, diese in vitro zu expandieren und sie schließlich wieder zu implantieren. Das Material, auf dem die Zellen wachsen sollten, muss solche Lebensverhältnisse für die Zellen wie in einem Gewebe erfühlen. In vitro werden die Zellen mit dreidimensionalen Träger sub stanz integriert und unter dem Einfluss von Wachstumsfaktoren kultiviert um die Forschung mit Biomaterialen durchzuführen. Die extrazelluläre Matrix liegt in einem Gewebe zwischen tierischen Zellen. Um ähnliche Bedingungen zu erzeugen, muss man die Substrate mit Matrixproteinen beschichten. Die gut analysierten Zell-Matrix-Substrat-Gebilde werden als Implantate anschließend in die zu ersetzenden Gewebsdefekte eingebracht. Die körperfremden Polymerwerkstoffe werden als Biomaterialen eingesetzt, um Körperfunktionen, Organe oder Gewebe schützen bzw. ersetzen zu können. So kann bei Endothelzellen, die Ausbildung vaskuläler Strukturen zur Bildung von Blutgefäßen angeregt werden, die die Funktionalität des Kollagens IV als Bestandteil der Basallamina auf Polymerschichten untersuchen.

In der Diplomarbeit soll untersucht werden, wie sich Endothelzellen durch eine Regulierung ihrer Adhäsion an künstlichen Oberflächen verhalten. Dazu wurden als Modelloberflächen verschiedene Polymerschichten hergestellt, welche die Ankopplung von Molekülen der extrazellulären Matrix, wie z.B. Kollagen IV, an das Substrat steuern und damit auch die Adhäsion der Endothelzellen regulieren. In der Experimenten wurde untersucht, wie sich die Morphologie von Einzelzellen und sowie die entsprechenden intrazellulären und extrazellulären Adhäsionsstrukturen der Zellen entwickeln. Durch die unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften des Polymersubstrate wurde die Bindungsstärke von Kollagen IV zum Substrat variiert. Insbesondere soll die Umordnung des angebotenen Kollagen IV sowie die in diesem Prozess involvierten Zelladhäsionsrezeptoren charakterisiert werden. Mittels Fluoreszenzmarkierung sollte sowohl das Aktin-Zytoskelett, verschiedene Integrine, die fokalen Adhäsionspunkte (mittels Vinculin) sowie das extrazelluläre Kollagen IV am konfokalen Laser Scanning Microscop sichtbar gemacht und ausgewertet werden.

Um die Ausbildung von kapillaren Netzwerken in einer künstlichen extrazellulären Matrix zu verbessern, soll die Adhäsion von Endothelzellen und die Reorganisation von vorbeschitetem Kollagen IV und diese in Abhängigkeit von lateralen Substratstrukturen untersucht werden.

II GRUNDLAGEN

Für ein besseres Verständnis werden in dieser Kapitel die allgemeinen Grundlagen erläutert, die für das Endothelzellwachstum auf biofunktionales MSA-Copolymeren und Bildung von vaskulären Strukturen durch diese Zellen wichtig sind. Somit wird an dieser Stelle das Zusammenspiel von dem Zytoskelett der Zelle, das über Integrine mit der extrazellulären Matrix verbunden ist, mit der Reorganisation des Matrixprotein Kollagen IV dargestellt.

2.1. Copolymeroberflächen

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Tab. 1: Eigenschaften der Copolymeroberflächen. (Pompe T. at el.2003)

Als Zellkulturträger wurden Deckgläschen mittels Dünnschichtpräparation mit verschiedenen Maleinsäureanhydrid- Copolymeren (MSA-Copolymere) beschichtet. Das ist eine Grundlage für die Versuche. In diesem Experiment wurden drei verschiedene Copolymerbeschichtungen auf Deckgläschen verwendet, die sich durch ihre Oberflächenenergie und Hydrophobizität unterscheiden.

Bei den Deckgläschen werden spezielle Reinigungs- und Modifizierungsprozesse durchgeführt um Aminogruppe zu erzeugen. Dann wird durch Spin-Coating von Polymerlösungen eine kovalente Anbindung der Copolymere an das Substrat gebildet. Durch Hydrolyse können die Anhydridgruppen in Säuregruppen geändert werden. Da Aminogruppen nicht mit Säurengruppen eine chemische Bindung eingehen können, wird somit eine kovalente Bindung des Proteins unterbunden (Abb. 2). Bei den getemperten Proben bleiben Anhydridgruppen bestehen und eine kovalente Bindung zwischen den MSA- Copomylere (Polyoctadecen (OD)- MSA [PO-MSA], Polypropylen (PP)-MSA [PP-MSA] und Polyethylen (PE)-MSA [PE-MSA] ) und Kollagen IV kann geformt werden (Pompe T. et al 2003).

Bei der nicht-kovalenten Anbindung der Proteine auf den hydrolysierten Proben entstehen die unterschiedliche Bindungsstärken zwischen der MSA-Schicht und den Proteinen durch die unterschiedliche Hydrophobizität der Substrate.

Durch die Länge der unpolaren Kohlenwasserstoffkette der Comonomere wird der Hydrophobizität bestimmt. OD-MSA (Polysciences Inc., Warrington, PA, USA) ist viel hydrophober als PP-MSA (Leuna-Werke AG, Deutschland) und PE-MSA (Sigma Aldrich, Deisenhofen, Deutschland), die im Kontrast zu OD-MSA kürzere Kohlenwasserstoffkette besitzen. Die Bindungsstärke von immobilisierten Proteinen, wie z.B. Kollagen IV, wird durch die physikchemische Eigenschaften der Polymeroberflächen, wie zum Beispiel: Reaktivität und Hydrophobizität (Tab.1) bestimmt.

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Abb. 2: Die Proteinanbindung an

Copolymere: kovalent und hydrolysiert

(Markowski M. 2003)

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Abb. 3: 1) Molekulare Struktur der wiederholenden Untereinheiten von verschiedene Maleinsäurenhydride Copolymeren. Blaue Sauerstoffgruppen ziehen die Anhydridgruppen. (A)OD-MSA (B)PP-MSA und (C)PE-MSA.

2) Chemische Struktur der MSA- Copolymere

(Pompe T. et al. 2003)

2.2. Proteinadsorption- Verdrängungsversuche

Das Thema Proteinadsorption ist sehr eng verbunden mit wissenschaftlichen Fragen über alle Hauptrichtungen von biofunktionalen Polymermaterialgruppen um biologische Flüssigkeiten wie: Blut, Plasma, Zellmedium. Sie werden oft im Zusammenhang mit künstlichen Oberfläche bzw. Proteinadsorption untersucht.

In ein paar Minuten bildet auf den meisten Oberflächen beim Kontakt mit einem Biofluid eine Proteinschicht, welche nachfolgende Zellprozesse und Proteinstrukturänderungen oder Enzymaktivaktion vermittelt und bestimmt. Verschiedene Art von Wechselwirkungen können Adsorptionsprozess verursachen: unter anderem elektrostatische und hydrophobe Wechselwirkungen zwischen Protein und Oberfläche, Protein-Protein-Interaktionen. Faktoren enthaltende: Ionen (bound ions), Oberflächeladung, Oberflächenrauheit, Oberflächenenergie, usw.; müssen alle in Betracht gezogen werden bei der Definition der Rolle der festen Lösung der Grenzfläche. In Proteinoberflächen sind Wechselwirkungen durch die physischen Eigenschaften des Materials und die umgebende Lösung bestimmt. Diese Wirkungen ändern sich je nach Oberflächen- und Proteineigenschaft und dem chemischen Umfeld. Protein­Oberflächenwechselwirkungen gehen meist mit einer mit Konformationsänderung der adsorbierten Proteine einher und bewirken Änderungen in der biologischen Aktivität und der nachfolgenden Zellwechselwirkungen.

Zwischen Oberflächen und Proteinen kann man zwei Hauptprozesse beobachten: Adsorption und Desorption. Die Abbildung 4 zeigt die Prozesse während der Adsorption und Desorption von Proteinen an Grenzflächen. Die Teilprozesse des Transportes des Proteins zur Oberfläche wurden durch Diffusion und Konvektion dargestellt. Ein adsorbiertes Protein kann an der Oberfläche entweder, ohne seine native Struktur zu verändern, desorbieren oder durch Änderung der Konformation bzw. Orientierung seine Form umstrukturieren.

Desorption ist bedingt durch die Stärke der Bindung und der Zeit des Proteinkontakts an der Oberfläche. Bei längeren Zeiträumen und starker Wechselwirkung können stärkere und zahlreichere Bindungen eingegangen werden und damit eine Desorption erschweren.

Neben der reinen Desorption können Austauschprozesse für eine Abgabe der Proteine von der Oberfläche verantwortlich sein. Der Austausch eines bereits adsorbierten Proteins durch ein zweitens wird als sequentiellen Adsorption bzw. Verdrängung oder als ,Vroman Effekt’ bezeichnet. Dieser Effekt beschreibt die dynamische Veränderung einer physisorbierten Proteinschicht. (Brash et al.1978)

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Abb. 4: Schematische Darstellung der Prozesse während der Proteinadsorption. (Renner L. 2003)

2.3. Extrazelluläre Matrix (ECM)

Die extrazelluläre Matrix muss bei der Gewebezüchtung bestimmte Eigenschaften haben, damit die Endothelzellen (EC) angesiedelt werden und gut wachsen können.

- Die ECM sollte vor allem keine toxischen Auswirkungen auf die Zellen haben.
- Zweitens soll die Matrix optimale Bedingungen für die Zellen zum Wachstum und zur Differenzierung möglich machen.
- Drittens sollte die Matrix ein mechanisch stabiles Gerüst darstellen, um den kultivierten Zellen eine natürliche, dreidimensionale Anordnung zu erlauben.

Es gibt kein Einheitsmaterial, welches für Entwicklung eines jeden Gewebes gleich gut geeignet wäre. Im Prinzip ist es so, dass für jedes Gewebe eine ganz individuelle Matrix/ Scaffold angewendet werden muss. (Minuth W. W., 2002)

Die extrazellulären Matrixkomponenten bilden ein Netzwerk, in dem die Zellen eines Gewebeverbands verankert sind. Die ECM besteht aus vier Hauptgruppen :

S Kollagen S Elastin S Proteoglycane S Strukturglycoproteine

Der Hauptbestandteil der ECM ist Kollagen, das durch seine Struktur und hohe Zugfestigkeit vielen Geweben, wie z.B. Haut, Sehnen und Knorpel mechanische Stabilität verleiht.

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Abb. 5: Molekular Mechanismus Kontakt einer Zelle mit extrazellulärem Matrix: Über Zell-Matrix- Adhäsionen wird das Zytoskelett mit dem Adhäsionsproteine der ECM verknüpft.

(Kojetynsky 2001)

Im Gegensatz zu den Glycoproteinen enthalten Kollagene besonders viel Kohlenhydrate- sie machen bis zu 90% ihrer Gesamtmasse aus, während der Proteinteil entsprechend gering ist. Die Kollagene lassen sich in mindestens 12 verschiedene Typen unterteilen. Type I- III gehören zu den fibrillen-assoziierten Kollagenen. Typ IV ist ein netzbildendes Kollagen. Viele Zellen sind durch weitere Glycoproteine mit der ECM verknüpft. Diese binden sich an die Integrin-Rezeptormoleküle, die in die Plasmamembrane eingelagert sind. Die Integrine durchspannen die Plasmamembran und sind auf der Innenseite mit Mikrofilamenten des Zytoskeletts verknüpft. Die Integrine sind also ein strukturelles und funktionelles Bindeglied zwischen der extrazelluläre Matrix und dem Zytoskelett.

Elastine sind elastische Fasern, die der ECM ihre elastische Eigenschaft verleihen. Proteoglycane (95%- Kohlenhydrate + 5% Proteine) bilden eine stark wasserhaltige, gellartige Substanz, die an der ECM als Permeabilitätsbarriere fungiert und den Transport von Ionen und Nährstoffen beeinflusst.

Die letzte Gruppe, die Glycoproteine vermitteln Bindungsstellen zwischen Zellen und ECM. Zu den wichtigsten Vertretern gehören: Fibronektin und Laminin. Fibronektin spielt eine große Rolle bei der Wundheilung, Blutgerinnung und Embryogenese. Diese Moleküle funktionieren auch als Gerüstproteine und Bindemittelsubstanzen. (Alberts B. et al. 2003)

2.3.1 Basal Membran

Die Basal Membran sind dünn und spezialisiert. Diese extrazelluläre Matrix umgibt die meisten Geweben in allen Metazoans. Sie bestehen aus mehreren Komponente, dazu gehören: Laminin, Typ IV Kollagen, Perlecan. Die sind entscheidend für Komplettierung der Embryogenese und sie sind unabdingbar für Gewebeorganisation und strukturelle Integrität.

Kollagen IV

In dieser Arbeit wurde das sehr wichtige Protein Kollagen IV untersucht, um es als dünne Beschichtung auf der oberfläche von Gewebekulturen nutzbar zu machen. Diese Proteine wurde 1966 durch Kefalides entdeckt. (Stamow D. 2007)

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Abb. 6: Entstehung der Kollagen IV Netzwerke (Timpl R. et al. 1996)

Kollagen IV ist ein universaler Bestandteil der Basalmembran. Diese flächenförmige Matrix von Kollagen liegt an den Erythrocyten und Endothellzellen an. Die fasst Muskel- und Nervenzellen ein. Kollagen IV ist ein wichtiger Hauptbestandteil zusammen mit Proteoglycanen, Laminin und Enactine Kollagen IV Netzwerke. Es besteht aus drei Alpha Untereinheiten . Diese sind durch 6 verschiedene Gene kodiert, Alpha 1 durch Alpha 6. Alle drei können eine Triplehelix bilden und mit 2 andere Untereinheiten das Typ- Kollagen IV formen. Das Kollagen kann unlösliche Fasern mit hoher Bruchfestigkeit bauen. Kollagen IV hat kurze nicht helikale Aminoende Domäne, eine lange Gly-X-Y wiederholende Domäne mit vielen kleinen Absätze und am Carboxylende eine globuläre NC1 Domäne. (Khoskhnoodl J 2004)

2.4 Endothelzellen

Endothelzellen sind die Grundeinheit des Endotheliums, auch Plattenepithel genant, das alle Blutgefäße, wie Arterien, Venen und Kapillaren, auskleidet.

Endothelzellen besitzen meist eine kubische Form und sind ca. 10-30 pm groß. Sie bilden eine glatte Oberfläche, die den Austausch zwischen Blutfluss und Geweben erleichtert. (Abb.6) Es gibt viele verschiedene Funktionen, die von Endothelzellen erfüllt werden. Sie nehmen direkten Einfluss auf die Regulierung des sie umgebenden Bindegewebes. Endothelzellen produzieren selbst Wachstumsfaktoren und sondern diese ab. Über spezifische Rezeptoren binden die Wachstumsfaktoren an der Zellmembran. Dies aktiviert Proliferation, Migration und Bildung von Blutgefäßen und Kapillaren (Angiogenese). (Stryer L. et al.

2003)

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Abb. 7: Endothelzellen als Monolayer

2.5 Zell-Matrix Kontakte/Fokale und Fibrilläre Adhäsionen

Die Zelle besitzt Rezeptoren in der Zellmembran, die zwei Arten von Adhäsionskontakten formen können (Kleinig H. at el. 1999):

- An extrazellulärem Material| -- Zell- Matrix- Adhäsion
- An Nachbarzellen -- Zell- Zell- Adhäsion

Um eine Adhering junction zu formen, muss die Zelle erst anhaften. Das Zytoskelettsystem muss dann rund um Moleküle gesammelt sein, das sofort Adhäsion vermittelt. Das Ergebnis ist ein gut definierte Struktur- Desmosom, Hemidesmosom, fokale Adhäsion oder Adherente junctions, die sie sich leicht am Elektronenmikroskop identifizieren lassen. (Geiger B. 2001) Für Zell-Zell, bzw. Zell-Matrix- Verbindungen gelten generell die folgende Grundlage: Interzelluläre Anheftungsproteine vermitteln die Bindung von Aktinfilamenten oder Intermediärefilamenten an den Transmembranproteinen und diese binden wiederum über extrazelluläre Domänen an den Proteinen der ECM. (Alberts et al. 2003) Die Transmembranproteine lassen sich in folgende Untergruppen einteilen: die wichtigste und große Gruppe der Integrine, die Cadherine und Dystroglykan Komplexe.

Adhäsionen mit der ECM formen sich bei allen Typen von adhärenten Zellen, aber ihr Morphologie und Größe können heterogen sein. Viele von diesen Adhäsionen teilen zwei gemeinsame Elemente: sie sind durch Integrine vermittelt und sie interagieren mit dem Aktin Zytoskelett an der Innenseite der Zelle. Die ECM-Liganden enthalten Fibronektin, Vitronektin und auch verschiedene Kollagene. Die am besten bekannten Adhäsionen sind: Fokale Adhäsion bzw. Fokale Kontakte (FA), Fibrilläre Adhäsion (FiA), Fokale Komplexe und Podosomen. In dieser Arbeit werden die ersten beiden Adhäsionen genauer beschrieben und mit Beispielen erklärt.

Fokale Kontakte bzw. Fokale Adhäsionen (FA) sind gestreckte Strukturen. Sie können mehrere Mikrometer groß sein und werden oft nahe an der Peripherie der Zelle gefunden. FA vermitteln starke Adhäsion zu dem Substrat und sie verbinden die ECM mit den Aktin­Mikrofilamenten durch einen Plaque, der aus vielen verschiedenen Proteinen besteht.

Mehr in der Mitte von vielen Zelltypen kann man fibrilläre Adhäsionen (FiA) finden, die entweder verlängert sind oder punktartige Strukturen bilden, die mit ECM-Fibrillen verknüpft sind. Eine typische Komponente dieser Adhäsion mit z.B. extrazellulären Fibronektin- Fibrillen ist der Rezeptor der α5β1 Integrin.

Fokale Adhäsionen sind weiter verbreitet, bilden interzellulär an das Aktinzytoskelett und bilden verschiedene Kontakte mit der ECM. Sie sind vor allem bei migratorischen Prozessen von Bedeutung (Geiger B. 2001)

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Abb. 8: Verbindungen der Integrine mit Bestandteile der extrazelluläre Matrix und des Zytoskeletts.

2.5.1 Integrin

Integrine sind wichtige Rezeptoren, die von Zellen genutzt werden, um an die extrazelluläre Matrix anzudocken und auf Signale von außen zu antworten. Sie lassen sich in eine Alpha - und Beta Untereinheit (Kawakami K. 2001), mit mehreren Familien und Variationen, unterteilen (Abb.7a). Die verschiedenartige Untereinheiten sorgen für die Spezifität der Bindung an extra- (alfa-Unterheiten) und interzelluläre (beta-Unterheiten) Liganden.

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