In der Diplomarbeit soll untersucht werden, wie sich Endothelzellen durch eine Regulierung ihrer Adhäsion an künstlichen Oberflächen verhalten. Dazu wurden als Modelloberflächen verschiedene Polymerschichten hergestellt, welche die Ankopplung von Molekülen der
extrazellulären Matrix, wie z.B. Kollagen IV, an das Substrat steuern und damit auch die Adhäsion der Endothelzellen regulieren. In der Experimenten wurde untersucht, wie sich die Morphologie von Einzelzellen und sowie die entsprechenden intrazellulären und
extrazellulären Adhäsionsstrukturen der Zellen entwickeln. Durch die unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften des Polymersubstrate wurde die Bindungsstärke von Kollagen IV zum Substrat variiert. Insbesondere soll die Umordnung des angebotenen
Kollagen IV sowie die in diesem Prozess involvierten Zelladhäsionsrezeptoren charakterisiert werden. Mittels Fluoreszenzmarkierung sollte sowohl das Aktin-Zytoskelett, verschiedene Integrine, die fokalen Adhäsionspunkte (mittels Vinculin) sowie das extrazelluläre Kollagen IV am konfokalen Laser Scanning Microscop sichtbar gemacht und ausgewertet werden.
Um die Ausbildung von kapillaren Netzwerken in einer künstlichen extrazellulären Matrix zu verbessern, soll die Adhäsion von Endothelzellen und die Reorganisation von vorbeschitetem Kollagen IV und diese in Abhängigkeit von lateralen Substratstrukturen untersucht werden.
Inhaltsverzeichnis
1. EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG
2. GRUNDLAGEN
2.1 Copolymeroberflächen
2.2 Proteinadsorption / Verdrünungsversuche
2.3 Extrazelluläre Matrix (ECM)
2.3.1 Basis Membrane
2.4 Endothelzellen
2.5 Zell-Matrix Kontakte Fokale und Fibrilläre Adhäsionen
2.5.1 Integrin
2.6 Rezeptoren
2.6.1 Zytoskelett
2.6.2 Vinculin
3. METHODEN UND MATERIAL
3.1 Präparation der Zellkulturträger
3.2 Zellkultur
3.3 Zellversuche
3.4 Fluoreszenzfärbung
3.4.1 Labeln von Kollagen IV mit TAMRA
3.5 Mikroskopie
3.6 Proteinverdrängung
4. ERGEBNISSE UND DISKUSSION
4.1 Adsorption/ Desorption und Austauschprozesse
4.2 Prozess des Strukturenwachstums des Kollagen IV
4.3 Lokalisierung fokaler Adhäsionskomplexe
4.4 Adhäsionsrezeptoren
5. ZUSAMMENFASSUNG
Zielsetzung & Themen
Die Masterarbeit untersucht den Einfluss der Anbindung von extrazellulären Matrixproteinen, insbesondere Kollagen IV, an verschieden funktionalisierte Polymerschichten auf das Adhäsionsverhalten und die Morphologie von Endothelzellen. Das Ziel ist es, zu verstehen, wie unterschiedliche physikochemische Oberflächeneigenschaften die Zelladhäsion sowie die Reorganisation von Matrixproteinen und die Ausbildung von Adhäsionsstrukturen beeinflussen.
- Regulierung der Zelladhäsion durch kovalente vs. adsorptive Kopplung
- Prozesse der Proteinadsorption, Desorption und des Proteinaustauschs
- Strukturelle Reorganisation von Kollagen IV und Fibronektin durch Endothelzellen
- Charakterisierung von Zell-Matrix-Kontakten mittels Fluoreszenzmikroskopie
- Analyse der Rolle von Adhäsionsrezeptoren wie Integrinen und Vinculin
Auszug aus dem Buch
2.2. Proteinadsorption- Verdrängungsversuche
Das Thema Proteinadsorption ist sehr eng verbunden mit wissenschaftlichen Fragen über alle Hauptrichtungen von biofunktionalen Polymermaterialgruppen um biologische Flüssigkeiten wie: Blut, Plasma, Zellmedium. Sie werden oft im Zusammenhang mit künstlichen Oberfläche bzw. Proteinadsorption untersucht.
In ein paar Minuten bildet auf den meisten Oberflächen beim Kontakt mit einem Biofluid eine Proteinschicht, welche nachfolgende Zellprozesse und Proteinstrukturänderungen oder Enzymaktivaktion vermittelt und bestimmt. Verschiedene Art von Wechselwirkungen können Adsorptionsprozess verursachen: unter anderem elektrostatische und hydrophobe Wechselwirkungen zwischen Protein und Oberfläche, Protein-Protein-Interaktionen. Faktoren enthaltende: Ionen (bound ions), Oberflächeladung, Oberflächenrauheit, Oberflächenenergie, usw.; müssen alle in Betracht gezogen werden bei der Definition der Rolle der festen Lösung der Grenzfläche. In Proteinoberflächen sind Wechselwirkungen durch die physischen Eigenschaften des Materials und die umgebende Lösung bestimmt. Diese Wirkungen ändern sich je nach Oberflächen- und Proteineigenschaft und dem chemischen Umfeld. Protein Oberflächenwechselwirkungen gehen meist mit einer mit Konformationsänderung der adsorbierten Proteine einher und bewirken Änderungen in der biologischen Aktivität und der nachfolgenden Zellwechselwirkungen.
Zusammenfassung der Kapitel
1. EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG: Einleitung in das Thema Tissue Engineering und Darstellung der Zielsetzung zur Untersuchung der Endothelzelladhäsion auf künstlichen Oberflächen.
2. GRUNDLAGEN: Vermittlung der theoretischen Hintergründe zu Polymeroberflächen, Proteinadsorption, extrazellulärer Matrix sowie zellulären Adhäsionsmechanismen.
3. METHODEN UND MATERIAL: Detaillierte Beschreibung der Präparation der Zellkulturträger, der Zellkultivierung, der Versuchsaufbauten sowie der angewandten Färbe- und Mikroskopietechniken.
4. ERGEBNISSE UND DISKUSSION: Präsentation und wissenschaftliche Erörterung der experimentellen Ergebnisse zur Proteinadsorption und der zellulären Reorganisation von Matrixproteinen.
5. ZUSAMMENFASSUNG: Zusammenfassende Darstellung der wichtigsten Erkenntnisse über den Einfluss der Substrateigenschaften auf das Adhäsionsverhalten und die Reorganisation von Kollagen IV durch Endothelzellen.
Schlüsselwörter
Tissue Engineering, Endothelzellen, Kollagen IV, Proteinadsorption, MSA-Copolymere, Zelladhäsion, Fokale Adhäsion, Fibronektin, Integrin, Vinculin, Zytoskelett, Fluoreszenzmarkierung, Konfokale Laserscanningmikroskopie, Biomaterialien, Oberflächenmodifizierung
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?
Die Arbeit befasst sich mit der Gewebezüchtung (Tissue Engineering) und untersucht, wie Endothelzellen an künstlichen Polymerschichten haften und wie sie die Umgebung (extrazelluläre Matrix) beeinflussen.
Welche zentralen Themenfelder werden behandelt?
Die zentralen Felder sind die Materialwissenschaft von Polymeroberflächen, die Zellbiologie von Adhäsionskontakten sowie die Interaktion zwischen Proteinen und synthetischen Trägermaterialien.
Was ist das primäre Ziel oder die Forschungsfrage der Arbeit?
Das Ziel ist es zu klären, wie die physikochemischen Eigenschaften von Modelloberflächen (verschiedene MSA-Copolymere) die Adhäsion und die Reorganisation von Matrixproteinen durch Endothelzellen beeinflussen.
Welche wissenschaftliche Methode wird verwendet?
Es werden verschiedene Methoden eingesetzt, darunter die Dünnschichtpräparation von Polymeren, Zellkultivierung (HUVEC), Fluoreszenzfärbung und die Auswertung mittels konfokaler Laserscanningmikroskopie (cLSM).
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Im Hauptteil werden der Aufbau der experimentellen Versuchsreihen, die Beobachtung der Proteinadsorption auf verschiedenen Oberflächen und die Analyse der durch Zellen induzierten Reorganisation von Kollagen IV und Fibronektin sowie die Lokalisierung von Adhäsionsmolekülen beschrieben.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Zu den wichtigsten Begriffen zählen Tissue Engineering, Kollagen IV, MSA-Copolymere, Endothelzellen, Adhäsion und Fluoreszenzmikroskopie.
Welchen Einfluss hat die "Temperung" der Oberflächen auf die Ergebnisse?
Die Temperung führt zur kovalenten Bindung der Proteine an das Substrat, wodurch eine zelluläre Reorganisation des Proteins verhindert wird, im Gegensatz zu hydrolysierten (nicht getemperten) Oberflächen.
Warum spielt die Hydrophobizität der Oberflächen eine Rolle?
Die Hydrophobizität bestimmt maßgeblich, wie stark Proteine an die Oberfläche binden und ob Zellen diese Proteine anschließend reorganisieren können.
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- Master of Science Agnieszka Kuriata (Author), 2008, Zelladhäsion auf Kollagen IV mit variabler Kopplung zu Polymersubstraten, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/118425
