DNA-Sequenzierungen nach Sanger und Maxam-Gilbert -
Histone spielen eine wichtige Rolle in der Organisation der Erbsubstanz und sind an Prozessen der Genregulation beteiligt.
Ziel der Arbeit war es, Gene menschlicher Histone zu analysieren und deren Anordnung (Histongengruppen, Cluster) auf dem menschlichen Genom zu beschreiben und mit anderen Säugern zu vergleichen. Es gelang die Analyse der Organisation von 3 Clustern menschlicher Histongene und Bestimmung deren DNA Sequenzen.
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
2. Material und Methoden
2.1. Material
2.1.1. Chemikalien
2.1.2. Reagenziensätze
2.1.3. Enzyme
2.1.4. Nucleotide
2.1.5. Zellen
2.2. Methoden
2.2.1. Untersuchung einer menschlichen Genbibliothek
2.2.1.1. Aufbau und Herkunft
2.2.1.2. Reagenzien
2.2.1.3. Aussaat von Bakteriophagen
2.2.1.4. Übertragung der Phagen-DNA auf Nitrocellulose
2.2.1.5. DNA-Sonden zur Hybridisierung
2.2.1.6. Hybridisierung der membrangebundenen DNA
2.2.1.7. Waschen der Filter
2.2.1.8. Autoradiographie
2.2.1.9. Anlegen von Bakteriophagenstammsuspensionen
2.2.2. Präparation von Bakteriophagen- DNA
2.2.2.1. Reagenzien
2.2.2.2. Plattenlysatmethode
2.2.2.3. Präparation aus Flüssigkulturen
2.2.2.4. Präparation in kleinem Maßstab
2.2.2.5. Aufreinigung von Phagenlysat mit Lambdasorb Antikörpern
2.2.2.6. Aufreinigung von Phagenlysat mit DEAE-Cellulose
2.2.3. Verdauung von DNA mit Restriktionsenzymen
2.2.3.1. Reagenzien
2.2.3.2. Durchführung
2.2.4. Agarose-Gelelektrophorese von DNA
2.2.4.1. Reagenzien
2.2.4.2. Durchführung
2.2.5. Dot-Blot-Analyse von DNA
2.2.5.1. Reagenzien
2.2.5.2. Durchführung
2.2.6. Übertragung von DNA auf Membranfilter
2.2.6.1. Kapillarblot nach Southern
2.2.6.2. Diffusionsblot nach Reed und Mann
2.2.7. Markierung von DNA
2.2.7.1. Radioaktive Markierungstechniken
2.2.7.2. Nichtradioaktive Markierungen
2.2.8. Isolierung von DNA-Fragmenten aus Gelen
2.2.8.1. Extraktion aus Low-Melting-Point (LMP)-Agarosegel
2.2.8.2. Isolierung aus TypII-Agarosegel
2.2.9. Subklonierung von DNA-Fragmenten
2.2.9.1. Verwendete Vektoren
2.2.9.2. Dephosphorylierung von Vektoren
2.2.9.3. Vorbereitung der DNA-Fragmente
2.2.9.4. Ligation
2.2.10. Transformation
2.2.10.1. Herstellung kompetenter Zellen
2.2.10.2. Einschleusen von Plasmiden in Bakterienzellen
2.2.11. Ausstreichen von transformierten Bakterien
2.2.12. Isolierung von Plasmid-DNA
2.2.12.1. Plasmidpräparation zur Analyse ("Mini Screen")
2.2.12.2. Präparation im mittleren Maßstab
2.2.12.3. Präparation im großen Maßstab
2.2.13. Aufreinigung von DNA
2.2.13.1. Saccharosegradienten
2.2.13.2. CsCl2-Gradienten
2.2.13.3. Reinigung mit "Gene-Clean"
2.2.13.4. Aufreinigung markierter DNA über Sephadex G-50
2.2.14. Strangtrennung von DNA-Fragmenten
2.2.15. Sequenzanalyse von DNA
2.2.15.1. Chemische Spaltung nach Maxam und Gilbert
2.2.15.2. Enzymatische Methode nach Sanger
2.2.15.3. Hochspannungsgelelektrophorese in Polyacrylamidgelen
2.2.15.4. Autoradiographie
2.2.16. Isolierung von Gesamt-DNA aus Blut
2.2.17. Southern-Blot-Analyse genomischer DNA
2.2.18. Zellkultur
2.2.19. Präparation von RNA aus Zellen
2.2.20. Übertragung von RNA auf Membranfilter (Northern-Blot)
2.2.20.1. Glyoxylierung von RNA
2.2.20.2. RNA-Gelelektrophorese und Northern Blot des Gels
2.2.21. S1- Kartierung
3. Ergebnisse
4. Diskussion und Zusammenfassung
5. Anhang
6. Verzeichnis der Abkürzungen
7. Literaturverzeichnis
Zielsetzung & Themen
Das Hauptziel dieser Inaugural-Dissertation ist die Untersuchung der Organisation menschlicher Histongene im Genom sowie die Bestimmung der Sequenzen einzelner Gene und ihrer flankierenden Abschnitte, um die Gruppierung und Regulation dieser Gene besser zu verstehen.
- Strukturelle Analyse menschlicher Histon-Gencluster
- Methoden der DNA-Isolierung und Klonierung aus Genbibliotheken
- Sequenzanalyse mittels chemischer Spaltung (Maxam & Gilbert) und Kettenabbruch-Synthese (Sanger)
- Untersuchung der regulatorischen Sequenzelemente in 5'- und 3'-Bereichen
- Vergleichende Analyse der Genorganisation mit anderen Spezies
Auszug aus dem Buch
Einleitung
Desoxyribonukleinsäure wurde bereits 1869 aus menschlichen Eiterzellen und 1871 aus Spermien vom Rheinlachs isoliert (Miescher), ihre Rolle als Träger der Erbinformation jedoch wurde erst mehr als 70 Jahre später entdeckt (Avery et al, 1944). Erst die Aufklärung ihrer Struktur einer DNA-Doppelhelix durch Watson und Crick (1953) ermöglichte einen Einblick in ihre Funktionsweise bei der Vererbung.
Mit der Erkenntnis, daß der Sitz der Erbinformation der Zellkern ist, und nach der Beschreibung der Kernsubstanz als Chromatin (Flemming, 1882) stellte sich die Frage, welche Rolle den DNA-gebundenen, basischen Proteinen zukommt. Kossel hatte ihnen bereits 1884, ohne Kenntnis ihrer Funktion, den Namen Histone gegeben.
Dahinter verbargen sich 5 verschiedene basische Kernproteintypen, deren Wechselwirkung mit der DNA durch Röntgenbeugungsexperimente belegt wurde (Wilkins, 1956). Bei einer Bindung aufgereinigter Histone an DNA entstanden sich wiederholende Strukturelemente von etwa 100 Angström Abstand. Da die Doppelhelix allein keine solchen Strukturmerkmale aufwies, schloß man, daß die basischen DNA-bindenden Proteine Einfluß auf die Organisation dieser Substanz im Zellkern haben sollten.
Zusammenfassung der Kapitel
1. Einleitung: Dieses Kapitel gibt einen historischen Überblick über die Erforschung der DNA und der Histone und definiert das Ziel der vorliegenden Arbeit.
2. Material und Methoden: Dieser Abschnitt beschreibt detailliert die verwendeten Chemikalien, Enzyme, Bakterienstämme und molekularbiologischen Verfahren wie Klonierung, Sequenzanalyse und Hybridisierung.
3. Ergebnisse: Hier werden die Resultate der Isolierung und Charakterisierung der verschiedenen Histon-Klone sowie deren Sequenzanalysen präsentiert.
4. Diskussion und Zusammenfassung: Die Ergebnisse werden interpretiert, mit Daten anderer Organismen verglichen und die Erkenntnisse zur Organisation der menschlichen Histongene zusammengefasst.
5. Anhang: Enthält die detaillierten Sequenzdaten der analysierten Klone.
6. Verzeichnis der Abkürzungen: Eine Aufstellung der in der Arbeit verwendeten Fachbegriffe und Abkürzungen.
7. Literaturverzeichnis: Ein umfassendes Verzeichnis der zitierten wissenschaftlichen Quellen.
Schlüsselwörter
Histongene, DNA-Organisation, Genbibliothek, Bakteriophagen, Southern-Blot, Northern-Blot, Sequenzanalyse, Maxam-Gilbert-Methode, Sanger-Methode, Gencluster, regulatorische Sequenzen, S1-Kartierung, Histon-Varianten, Chromatin, Molekularbiologie.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?
Die Arbeit befasst sich mit der molekularbiologischen Untersuchung der Organisation und Sequenz menschlicher Histongene.
Was sind die zentralen Themenfelder?
Die zentralen Themen sind die Isolierung von Genclustern aus menschlichen Genbibliotheken, die Bestimmung der Nukleotidsequenzen und die Untersuchung regulatorischer Sequenzelemente.
Was ist das primäre Ziel der Untersuchung?
Das primäre Ziel ist es, die organisationelle Gruppierung der Core-Histone und die Sequenzstruktur der Histongene im menschlichen Genom aufzuklären.
Welche wissenschaftlichen Methoden werden verwendet?
Es kommen Standardmethoden der Gentechnik zum Einsatz, darunter Hybridisierung, Southern-Blot-Analysen, verschiedene Sequenzierverfahren (Maxam/Gilbert und Sanger) sowie die S1-Kartierung.
Was wird im Hauptteil behandelt?
Der Hauptteil konzentriert sich auf die Charakterisierung der isolierten Bakteriophagen-Klone, die Kartierung der Histongene innerhalb dieser Klone und deren detaillierte Sequenzanalyse.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Wichtige Begriffe sind Histongene, Gencluster, Sequenzanalyse, DNA-Organisation und Regulatorische Sequenzelemente.
Welche Bedeutung haben die im Kapitel 3.7 beschriebenen Analysen?
Kapitel 3.7 liefert die präzisen Nukleotidsequenzen der untersuchten Histongene, welche für das Verständnis der Genorganisation und der Protein-Kodierung entscheidend sind.
Welches Fazit zieht der Autor in Bezug auf die Organisation der Histongene?
Der Autor stellt fest, dass Histongene beim Menschen in komplexen Clustern organisiert sind, die Ähnlichkeiten, aber auch signifikante Unterschiede zu Histon-Organisationen in anderen Spezies aufweisen.
Wie wurde die S1-Kartierung zur Analyse genutzt?
Die S1-Kartierung wurde eingesetzt, um den Beginn der mRNA-Transkription der Histongene präzise zu bestimmen und somit die funktionellen Genanfänge zu identifizieren.
- Citation du texte
- Dr. Stefan Eick (Auteur), 1989, Untersuchungen zur Organisation und Sequenz menschlicher Histongene, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/120678
