Interaktionen innerhalb des Stators der F1F0-ATP-Synthase von Escherichia coli: Quervernetzung der Cystein-substituierten Untereinheiten

Praktikumsbericht / -arbeit , 2007 , 40 Seiten , Note: 1,7

Biologie - Cytologie

1. Einleitung
1.1 Die ATP-Synthase von Escherichia coli
Das Molekül Adenosintriphosphat (ATP) kommt in allen lebenden Organismen vor. ATP ist der universelle Überträger chemischer Energie in der Zelle, mit dessen Hilfe endergonische Prozesse angetrieben werden, wie Synthese von organischen Molekülen, aktiver Stofftransport über Biomembranen in die Zellen oder hinaus, sowie Bewegungen wie zum Beispiel bei der Muskelkontraktion. Deshalb wird ATP auch als die Energiewährung der Zelle bezeichnet (Greie et al., 2001). Die drei Phosphatgruppen des Adenosintriphosphates sind durch zwei energiereiche Phosphoanhydrid-Bindungen miteinander verbunden. Werden diese Bindungen durch Enzyme hydrolytisch gespalten, entsteht das Adenosindiphosphat (ADP)
bzw. das Adenosinmonophosphat (AMP) und jeweils anorganisches Phosphat (Pi). Jede Spaltung liefert eine Hydrolyseenergie von Δg’0 = -30,5 kJ/mol. Bei der Phosphorylierung kommt es jedoch zu einer Übertragung einer Phosphatgruppe auf ein anderes Molekül bedingt durch das hohe Gruppenübertragungspotential von ATP für Phosphatgruppen. Häufig entsteht auch ein Energiegewinn durch Hydrolyse bei der Freisetzung der Komponente. Außerdem fungiert ATP als Coenzym bei der Aktivierung von Metaboliten wie z.B. Aminosäuren. Aufgrund der zentralen Funktion des ATPs, ist dessen Synthese die in der Natur am häufigsten vorkommende Reaktion (Nelson & Cox, 2001).[...]

Inhaltsverzeichnis

• Abkürzungen
• 1. Einleitung
  • 1.1 Die ATP-Synthase von Escherichia coli
  • 1.2 Interaktionen zwischen der Untereinheit b und den anderen Statorkomponenten
  • 1.3 Aufgabenstellung dieser Arbeit
• 2. Material und Methoden
  • 2.1 Stämme, Plasmide, Primer und Antikörper
  • 2.2 Zellanzucht
  • 2.3 Molekularbiologische Methoden
    • 2.3.1 2-Stufen-PCR
    • 2.3.2 Restriktion der Plasmid-DNA
    • 2.3.3 Agarose-Gelelektrophorese mit Ethidiumbromid-Färbung
    • 2.3.4 Gel-Extraktion
    • 2.3.5 Ligation der DNA-Fragmente
    • 2.3.6 Transformation von DH5α und DK8
    • 2.3.7 Reinigung der Plasmid-DNA
    • 2.3.8 Konstruktion der Plasmide
      • 2.3.8.1 Herstellung der a-b-Konstrukte
      • 2.3.8.2 Herstellung der a-b-a-Konstrukte
      • 2.3.8.3 Herstellung der b-β-Konstrukte
  • 2.4 Präparative Methoden
    • 2.4.1 Präparation invertierter Membranvesikel
    • 2.4.2 Quervernetzung mit Kupfer-Phenanthrolin (CUP) an invertierten Membranvesikeln
  • 2.5 Analytische Methoden
    • 2.5.1 BCA-Proteinbestimmung
    • 2.5.2 Messung der ATPase-Aktivität
    • 2.5.3 Messung der ATP-getriebenen Protonentranslokation mittels ACMA-Fluoreszenz
    • 2.5.4 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
    • 2.5.5 Immunoblotanalyse
• 3. Ergebnisse
  • 3.1 Interaktion zwischen den Untereinheiten b und a
    • 3.1.1 Funktionelle Charakterisierung
    • 3.1.2 Quervernetzung zwischen den Untereinheiten b und a
  • 3.2 Interaktion zwischen den Untereinheiten b und β
    • 3.2.1 Funktionelle Charakterisierung
    • 3.2.2 Quervernetzung zwischen den Untereinheiten b und β
  • 3.3 Interaktion zwischen den Untereinheiten a, b und α
    • 3.3.1 Funktionelle Charakterisierung
    • 3.3.2 Quervernetzung zwischen den Untereinheiten a, b und α
• 4. Diskussion
• 4.1 Ausblick
• 5. Literatur

Zielsetzung und Themenschwerpunkte

Diese Arbeit untersucht die Interaktionen innerhalb des Stators der F₁Fo-ATP-Synthase von Escherichia coli. Die Zielsetzung ist die Charakterisierung der Wechselwirkungen zwischen spezifischen Untereinheiten mittels Quervernetzung und funktioneller Analysen.

• Charakterisierung der Interaktion zwischen den Untereinheiten b und a
• Untersuchung der Interaktion zwischen den Untereinheiten b und β
• Analyse der Interaktion zwischen den Untereinheiten a, b und α
• Anwendung verschiedener molekularbiologischer und biochemischer Methoden
• Funktionelle Charakterisierung der identifizierten Interaktionen

Zusammenfassung der Kapitel

Kapitel 1 führt in die Thematik der F₁Fo-ATP-Synthase von E. coli ein und beschreibt die Aufgabenstellung der Arbeit. Kapitel 2 detailliert die verwendeten Materialien und Methoden, einschließlich molekularbiologischer Techniken, Präparation von Membranvesikeln und analytischer Verfahren. Die Ergebnisse in Kapitel 3 präsentieren Daten zur Interaktion zwischen den Untereinheiten b und a, b und β sowie a, b und α, wobei jeweils funktionelle Charakterisierungen und Quervernetzungsexperimente beschrieben werden. Die Diskussion der Ergebnisse erfolgt in Kapitel 4.

Schlüsselwörter

F₁Fo-ATP-Synthase, Escherichia coli, Protein-Protein-Interaktionen, Quervernetzung, Untereinheiten a, b, α, β, funktionelle Charakterisierung, Membranproteine, molekularbiologische Methoden, Biochemie.

• Hochschule: Universität Osnabrück
• Note: 1,7
• Autor: Julika Pulst (Autor:in)
• Erscheinungsjahr: 2007
• Seiten: 40
• Katalognummer: V122970
• ISBN (eBook): 9783640274390
• ISBN (Buch): 9783640858927
• Sprache: Deutsch
• Schlagworte: ATP, Rotor, Stator, Cystein, Immunoblot, Gelelektrophorese, Antikörper, E.coli, Quervernetzung, Synthase, Synthese, binding change, ADP, Energieträger, ACMA