Interaktionen innerhalb des Stators der F1F0-ATP-Synthase von Escherichia coli: Quervernetzung der Cystein-substituierten Untereinheiten

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungen

1. Einleitung
1.1 Die ATP-Synthase von Escherichia coli
1.2 Interaktionen zwischen der Untereinheit b und den anderen Statorkomponenten
1.3 Aufgabenstellung dieser Arbeit

2. Material und Methoden
2.1 Stämme, Plasmide, Primer und Antikörper
2.2 Zellanzucht
2.2.1 Medien
2.2.2 Komplementationstest
2.2.3 Zellanzucht
2.3 Molekularbiologische Methoden
2.3.1 2-Stufen-PCR
2.3.2 Restriktion der Plasmid-DNA
2.3.3 Agarose-Gelelektrophorese mit Ethidiumbromid-Färbung
2.3.4 Gel-Extraktion
2.3.5 Ligation der DNA-Fragmente
2.3.6 Transformation von DH5α und DK8
2.3.7 Reinigung der Plasmid-DNA
2.3.8 Konstruktion der Plasmide
2.3.8.1 Herstellung der a-b -Konstrukte
2.3.8.2 Herstellung der a-b -α-Konstrukte
2.3.8.3 Herstellung der b -β-Konstrukte
2.4 Präparative Methoden
2.4.1 Präparation invertierter Membranvesikel
2.4.2 Quervernetzung mit Kupfer-Phenanthrolin (CuP) an invertierten Membranvesikeln
2.5 Analytische Methoden
2.5.1 BCA-Proteinbestimmung
2.5.2 Messung der ATPase-Aktivität
2.5.3 Messung der ATP-getriebenen Protonentranslokation mittels ACMA-Fluoreszenz
2.5.4 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
2.5.5 Immunoblotanalyse

3 Ergebnisse
3.1 Interaktion zwischen den Untereinheiten b und a
3.1.1 Funktionelle Charakterisierung
3.1.2 Quervernetzung zwischen den Untereinheiten b und a
3.2 Interaktion zwischen den Untereinheiten b und β
3.2.1 Funktionelle Charakterisierung
3.2.2 Quervernetzung zwischen den Untereinheiten b und β
3.3 Interaktion zwischen den Untereinheiten a, b und α
3.3.1 Funktionelle Charakterisierung
3.3.2 Quervernetzung zwischen den Untereinheiten a, b und α

4 Diskussion
4.1 Ausblick

5 Literatur

Abkürzungen

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1. Einleitung

1.1 Die ATP-Synthase von Escherichia coli

Das Molekül Adenosintriphosphat (ATP) kommt in allen lebenden Organismen vor. ATP ist der universelle Überträger chemischer Energie in der Zelle, mit dessen Hilfe endergonische Prozesse angetrieben werden, wie Synthese von organischen Molekülen, aktiver Stofftransport über Biomembranen in die Zellen oder hinaus, sowie Bewegungen wie zum Beispiel bei der Muskelkontraktion. Deshalb wird ATP auch als die Energiewährung der Zelle bezeichnet (Greie et al., 2001). Die drei Phosphatgruppen des Adenosintriphosphates sind durch zwei energiereiche Phosphoanhydrid-Bindungen miteinander verbunden. Werden diese Bindungen durch Enzyme hydrolytisch gespalten, entsteht das Adenosindiphosphat (ADP) bzw. das Adenosinmonophosphat (AMP) und jeweils anorganisches Phosphat (Pi). Jede Spaltung liefert eine Hydrolyseenergie von ∆g’0 = -30,5 kJ/mol. Bei der Phosphorylierung kommt es jedoch zu einer Übertragung einer Phosphatgruppe auf ein anderes Molekül bedingt durch das hohe Gruppenübertragungspotential von ATP für Phosphatgruppen. Häufig entsteht auch ein Energiegewinn durch Hydrolyse bei der Freisetzung der Komponente. Außerdem fungiert ATP als Coenzym bei der Aktivierung von Metaboliten wie z.B. Aminosäuren. Aufgrund der zentralen Funktion des ATPs, ist dessen Synthese die in der Natur am häufigsten vorkommende Reaktion (Nelson & Cox, 2001).

Die Regeneration von ATP aus AMP bzw. ADP wird durch zwei verschiedene Prozesse in Organismen realisiert, die als Substratkettenphosphorylierung und Elektronentransport-phosphorylierung bekannt sind. Bei der Substratkettenphosphorylierung wird ATP durch direkte Übertragung einer Phosphatgruppe auf ADP von einem Intermediärsubstrat im Katabolismus gebildet. Im zweiten Mechanismus, der oxidativen Phosphorylierung, koppelt die ATP-Synthase die ATP-Bildung mit dem energetisch begünstigten Transport von Protonen (oder anderen Ionen) entlang eines Protonengefälles über eine Membran, um so die Energie für die Synthese von ATP aus ADP und Pi aufzubringen Dieser elektrochemische Ionen-Gradient (DµH+ oder DµNa+) wird durch Elektronentransportprozesse während der Zellatmung oder der Photosynthese über der Membran generiert (Greie et al., 2001). Der membrangebundene Enzymkomplex wird als F1F0-ATP-Synthase bezeichnet und kommt in hoch konservierter Form in der Plasmamembran von Prokaryoten, in der inneren Mitochondrienmembran von Eukaryoten und in der Thylakoid-Membran der Chloroplasten von Pflanzenzellen vor. Obwohl bei verschiedenen Organismen die Anzahl der Proteinuntereinheiten zwischen 8-16 variiert, weisen alle ATP-Synthasen einen transmembranen F0-Teil und einen cytoplasmatischen F1-Teil auf. Die F1F0-ATP-Synthase tritt speziell bei Bakterien abhängig vom Verhältnis der Substrate und Produkte entweder als ATP-verbrauchende Protonenpumpe oder als Protonen-getriebene ATP-Synthase auf. Unter anaeroben Bedingungen besteht bei E. coli die Hauptaufgabe des Enzyms darin, ATP zu hydrolysieren um die protonenmotorische Kraft zu erzeugen (Dimroth et al., 2006).

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Alle F-ATPasen weisen eine hohe Homologie hinsichtlich ihrer Struktur und Funktionsweise auf. Die F1F0-ATP-Synthase von E. coli wird aufgrund ihrer simplen Zusammensetzung als Modellenzym genommen (Greie et al., 2001/Abb. 1). Die acht verschiedenen Untereinheiten der F1F0-ATP-Synthase von E. coli werden alle durch das atp -Operon kodiert und liegen auf dem Chromosom. Zusätzlich gehört zum atp -Operon (Tab. 1) das atp I-Gen, dessen Funktion nach wie vor unbekannt ist.

Tab. 1 : Das atp -Operon und die Untereinheiten der F1F0-ATP-Synthase von E. coli

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Der F1-Teil, der als ATPase fungiert, besteht aus fünf verschiedenen Untereinheiten mit der Stöchiometrie α3β3gδe. Der Aufbau der Untereinheiten α und β ist ähnlich. Beide besitzen eine N-terminale β-Faltblatt-Domäne, eine in der Mitte gelegene Nucleotid-Binde-Domäne und eine C-terminale α-helikale Region, die zahlreiche polare Reste beinhaltet und wichtig für die regulatorische Funktion ist. Die Untereinheiten α und β sind alternierend in einem hexameren Ring um die zentral gelegene γ-Untereinheit angeordnet. Die γ-Untereinheit ragt mit ihren asymmetrischen α-Helices in das Hexamer hinein und ist nur in der N-terminalen „crown region“ des Hexamers nicht vorhanden. Vom Hexamer erstreckt sich die γ-Untereinheit zum F0-Teil und bildet zusammen mit ε einen 4,5 nm langen Stiel, den „central stalk“, der F1 mit F0 verbindet. Die Untereinheit ε ist ein 15 kDa großes, lösliches Polypeptid. Es besteht aus einer C-terminalen Helix-Loop-Helix-Haarnadel-Domäne und einer N-terminalen β-Sandwich-Domäne (Dunn et al., 2004). Die Untereinheit δ befindet sich außen im oberen Bereich des α3β3-Hexamers. Die N-terminalen 134 Reste der 176 Reste großen Untereinheit δ sind hauptsächlich α-helikal, sonst ist noch wenig über δ bekannt (Greie et al., 2001).

Der F0-Teil besitzt die protonentranslozierende Funktion und setzt sich aus den Untereinheiten a, b 2 und einem oligomeren c 10-Ring zusammen (Stöchiometrie ab2c10, Dimroth et al., 2006). Die monomere Untereinheit c ist eine helikale Haarnadel mit zwei transmembranen α-Helices, die durch einen kurzen Bereich hydrophiler Aminosäuren verbunden sind. Beide Endigungen des Proteins sind zur periplasmatischen Seite der Membran orientiert, während der hydrophile Loop zum Cytoplasma zeigt. Die Untereinheit c ist über γ und ε mit dem F1-Teil verbunden. Das N-terminale Viertel der Untereinheit a besteht aus fünf transmembranen Helices. Der N-Terminus liegt im Periplasma und die C-terminalen Dreiviertel des Proteins sind zum Cytoplasma orientiert. Es wurden zwei cytoplasmatische Loops und zwei periplasmatische Domänen gefunden. Insgesamt gibt es in diesem Bereich vier transmembrane Helices (Greie et al., 2001). Die Untereinheit b besteht aus 156 Aminosäuren und liegt als Homodimer vor, welches sich von der periplasmatischen Seite der Membran bis zum F1-Bereich erstreckt und größtenteils α-helikal ist. Die Untereinheit b kann in vier Domänen eingeteilt werden, der unpolaren N-terminalen transmembranen Domäne (Reste 1-24), einer „tether“-Domäne (Reste 25-52), einer Dimerisierungsdomäne (Reste 53-122) und einer δ-Bindedomäne (Reste 123-156). Die Dimerisierung ist reversibel und die Bindungen sind nur schwach; sie ist aber für die Assemblierung und Funktionalität des Enzyms unentbehrlich (Dunn et al., 2004).

Die Untereinheiten a und c sind an der Translokation von Protonen über die Membran beteiligt. Hierfür wird bei E. coli derzeit das „two-channel“-Modell bevorzugt. Dieses Modell besagt, dass in a zwei Halbkanäle, der „Inlet-Channel“ und der „Outlet-Channel“ seitlich zueinander verschoben liegen (Abb. 2). Sie führen jeweils von der Mitte der Membran zum Periplasma bzw. zum Cytoplasma. Das Proton tritt auf der Seite mit dem geringeren pH-Wert (Periplasma) über den „Inlet-Channel“ ein und trifft in der Mitte der Membran auf den Aspartatrest 61 eines c -Monomers (c D61). Das Proton bindet und vollführt eine 360°-Rotation innerhalb des c -Oligomers. Das Aspartat 61 wird dann durch den Argininrest 210 der a -Untereinheit (a R210), welches an der ac -Grenzfläche liegt, wieder deprotoniert. Das

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Proton tritt auf der Seite mit dem höheren pH-Wert (Cytoplasma) über den „Outlet-Channel“ aus. Außerdem kann an das Aspartat 61 DCCD (N, N’ -Dicyclohexylcarbodiimid) binden; die Folge ist, dass die Protonentranslokation irreversibel angehalten wird (Dimroth et al., 2006).

Um die Energie des Protonengradienten nutzen zu können, müssen der F1- und der F0-Komplex für die ATP-Synthese gekoppelt vorliegen. Die ATP-Synthase kann hierbei unterteilt werden in den Rotor und den Stator. Der Rotor besteht aus den Untereinheiten γ und ε und dem ringförmigen Dekamer der F0-Untereinheit c. Er überträgt mechanische Energie zwischen den beiden Sektoren F1 und F0 via Rotation. Der Stator besteht aus den Untereinheiten b 2δα3β3 a und sorgt für die notwendige Stabilität des Moleküls während der Rotation (Dunn et al., 2004).

Im F1-Komplex unterliegen die b-Untereinheiten während der Katalyse verschiedenen Konformationsänderungen, bedingt durch die asymmetrische Bewegung der Untereinheit g im α3β3-Hexamer. Die insgesamt drei Konformationen von β werden als „open“ (O), „tight“ (T) und „loose“ (L) bezeichnet (Abb. 3). Sie weisen unterschiedliche Bindungsaffinitäten für ATP, ADP und Pi auf. Während eine Einheit geöffnet ist und ADP und Pi binden kann (o-Zustand, für „open“), ist die benachbarte Einheit in der T-Form (für „tight“). In diesem Zustand findet die Synthese von ATP aus ADP und Pi statt. In der L-Form (L für „loose“) liegt das Produkt ATP vor und wird energieabhängig entlassen. Da sich die Untereinheit g in 120°-Schritten bewegt, durchläuft jede β-Untereinheit pro 360°-Drehung alle drei Konformationen und im F1-Komplex werden insgesamt drei Moleküle ATP generiert. Diese Vorgänge wurden als „binding-change“-Mechanismus bekannt (Greie et al., 2001) und Paul Boyer erhielt hierfür den Nobelpreis.

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Das Zusammenspiel zwischen der ATP-Synthese im F1-Teil und der Protonentranslokation im F0-Teil wird als Kopplung bezeichnet. Der c -Ring bei E. coli besteht aus 10 Monomeren und befördert daher zehn Protonen über die Membran bei einer kompletten Drehung. Demgegenüber steht eine Generierung von 3 Molekülen ATP pro kompletter Drehung des F1-Teils; dies entspricht einem Verhältnis ATP zu H+ von 3:10. Da die Anzahl der Monomere im c -Ring bei verschiedenen Organismen variieren kann (10-15 Monomere), ändert sich das ATP/H+-Verhältnis entsprechend (Dimroth et al., 2006). Für die Synchronisation der Kopplung gibt es zwei verschiedene Modelle, den „stepping-Mechanismus“ und den „elastic-strain-Mechanismus“. Beim „stepping-Mechanismus“ ist jede Drehbewegung der Untereinheit c an einen Teilschritt der Rotation von ge und somit an eine Teilreaktion bei der ATP-Synthese geknüpft. Bei einem Verhältnis ATP zu H+ von 3:10 gegenüber 3:15 muss es hierbei bislang schwer zu verstehende Änderungen im Mechanismus geben. Beim „elastic-strain-Mechanismus“ wird die Energie jeder Drehbewegung des c -Rings vermutlich im Stator (ab2 α3β3δ) gespeichert, bis sie ausreicht, um die Untereinheiten ge um 120° zu drehen und somit ein ATP-Molekül zu generieren. Für die Speicherung der Energie im Stator bieten sich die Untereinheiten b 2 und γ an, die sich verdrillen. Hier ist daher eine gewisse Flexibilität im Molekül gegeben, während die Interaktion des b -Dimers mit den anderen Untereinheiten des Stators im F1- und F0-Bereich für eine ebenso notwendige Stabilität des Moleküls sorgt. Allerdings reichen die bislang in der Vergangenheit charakterisierten Interaktionen der Untereinheit b mit den anderen Untereinheiten des Stators nicht aus, um die Stabilität innerhalb des Stators zu gewährleisten bzw. um das „elastic-strain-Modell“ zu verifizieren.

1.2 Interaktionen zwischen der Untereinheit b und den anderen Statorkomponenten

Im Folgenden wird auf die bislang charakterisierten Interaktionen von b mit den übrigen Statorkomponenten (a α3β3δ) näher eingegangen.

Im transmembranen F0-Bereich zeigten Kumamoto et al. (1986), dass Suppressormutanten einen durch die Mutation b G9D bedingten Funktionsverlust der ATPase teilweise wieder aufheben. Die Suppressormutationen liegen in Position 240 der a -Untereinheit (a P240A, a P240L). Die Ergebnisse lassen vermuten, dass diese Positionen in räumlicher Nähe zueinander liegen könnten. Entsprechende Cysteinmutanten wurden von Brandt im Zuge seiner Bachelorarbeit (2007) konstruiert. Die Mutanten mit den Austauschen b G9C und a P240C bildeten hierbei einen pH-abhängigen Crosslink, der aber schwächer ausfiel als z.B. der charakterisierte Crosslink von Fillingame et al. (2000) von b N2C mit a L228C (in derselben Arbeit wurde des weiteren ein Crosslink von b N2C mit der Position 227 in a erhalten); deshalb wurden weitere Cysteinmutanten um die sich in der fünften transmembranen Helix befindende Position a P240 konstruiert. Von ihnen bildeten a L237C, a N238C und a A242C starke Crosslinks mit b G9C, was zeigt, dass sie in räumlicher Nähe zu b G9 liegen. Die Mutanten mit den Austauschen a V239C, a I243C und a P240C zeigten nur schwache Crosslinks, während a W241C nicht auf Succinat wuchs und daher keine funktionelle ATP-Synthase besaß. Das Schema in Abb. 4 verdeutlicht, dass nur ein Glycin an Position 9 des b -Dimers in räumlicher Nähe zu dem charakterisierten Interaktionsbereich mit a liegt. McLachlin et al. (2000) stellten außerdem eine Interaktion von b R36C mit der a -Untereinheit fest, dieser Bereich wurde jedoch nicht näher eingegrenzt.

Im F1-Bereich zeigten Rodgers und Capaldi (1998) mittels Crosslinking, dass b L156 und αC90 miteinander interagieren. Im unteren Bereich von F1, wo die Bewegungen des Hexamers während der Katalyse größer sind, charakterisierten McLachlin et al. (2000) den Bereich zwischen 464-483 in α als mit b A92C interagierend. In seiner Arbeit untersuchte Brandt (2007) fünf Aminosäuren in diesem Bereich der α-Untereinheit als mögliche Interaktionspartner von b A92C. Die generierten Cysteinmutanten αA473C und αR477C bildeten hierbei starke Crosslinks mit b A92C, während αA469C und αA480C nur schwache Quervernetzungen ermöglichten und αS466C zu weit von b A92C entfernt lag. Dabei zeigten die Crosslinks keine pH- und Temperatur-Abhängigkeit. Die Lage einer b Untereinheit des b -Dimers liegt laut Brandt (2007) aufgrund der erhaltenen Ergebnisse in unmittelbarer räumlicher Nähe zu Aminosäure αA473 und αR477. McLachlin et al. (2000) zeigten, dass auch β mit b A92C interagiert. Dieser Bereich wurde aber bisher nicht näher eingegrenzt. Bereits bekannte Interaktionen zwischen b und δ sind b E155 mit δM158 und bei einer verlängerten Form von der Untereinheit b um zwei Aminosäuren b C158 mit δM158 (McLachlin & Dunn, 2000). Die betrachteten Positionen befinden sich alle im oberen Bereich des Stators und ihre Quervernetzung hat keinen Einfluss auf die ATPase-Aktivität, was darauf zurückzuführen ist, dass die Bewegung des α3β3-Hexamers während der Synthese bzw. Hydrolyse in diesem Bereich, der so genannten „crown region“, gering ist (Weber, 2006).

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Eine Übersicht der bislang entdeckten interagierenden Positionen von b mit a, α und β ist in Abb.5 dargestellt.

Für eine bessere Übersichtlich-keit sind nur die interagierenden Stellen, die für diese Arbeit relevant sind, gezeigt.

1.3 Aufgabenstellung dieser Arbeit

In dieser Arbeit sollten die von Brandt (2007) vorgelegten Ergebnisse zur Interaktion von b mit a verifiziert werden. Des Weiteren sollte der Interaktionsbereich von b mit β näher eingegrenzt werden, da McLachlin et al. (2000) eine Interaktion von b mit β feststellen konnten. Außerdem wurde anhand von a - b -α-Konstrukten überprüft, ob eine b -Untereinheit des b -Dimers sowohl mit a und α interagiert oder eine b -Untereinheit mit a und die andere mit α (vgl. Abb. 6). Dazu wurden Crosslink-Pärchen b -α mit b - a kombiniert, wobei nur Pärchen eingesetzt wurden, die einen starken Crosslink lieferten.

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Abb. 6: Zwei Modelle für die Interaktion des b -Dimers mit den Untereinheiten a und α

Zu Anfang wurden jeweils molekulargenetisch Cysteine in die entsprechenden Proteine eingebracht. Mit den hergestellten Cysteinmutanten wurde ein Komplementationstest durchgeführt, um die Funktionalität der veränderten ATPase auf Zellebene zu kontrollieren. Nach Anzucht der Mutanten erfolgten eine Zellanzucht und eine anschließende Vesikel-präparation. Auf Vesikelebene wurde erneut die Funktionalität überprüft, indem die ATPase-Aktivität inklusive Hemmung mit DCCD gemessen wurde. Bei den a - b -Konstrukten wurde die Funktionalität zusätzlich mittels eines ACMA-Quenches getestet, um zu überprüfen, ob der F1-Teil und F0-Teil gekoppelt vorlagen. Anschließend wurden mithilfe des starken Oxidationsmittels CuP die unmittelbar in räumlicher Nähe zueinander liegenden Cysteine quervernetzt, da diese bei Oxidation Disulfid-Brücken ausbilden. Die Crosslinks konnten anhand von Immunoblots mit den entsprechenden Antikörpern sichtbar gemacht werden.

2. Material und Methoden

2.1 Stämme, Plasmide, Primer und Antikörper

Tab. 2 : Verwendete Bakterienstämme

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