Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung von Verfahren zur Rauschminderung, zur Reflexionsebenenselektion und zur numerischen Autofokussierung in der digitalholographischen Mikroskopie. Zunächst wurden die Eigenschaften der eingesetzten kurzkohärenten Superlumineszenzdioden charakterisiert und optimiert. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass die Rekonstruktion der hiermit aufgenommenen digitalen Hologramme mit Methoden der räumlich phasenschiebenden Interferometrie möglich ist. Die Bildweite der rekonstruierten Wellenfelder kann anschließend mittels der faltungsbasierten Propagation variiert werden. Die Untersuchungen ergaben, dass das Phasenrauschen bei Einsatz kurzkohärenter Lichtquellen im Vergleich zur Laserlichtquelle signifikant vermindert wird. Es wurde gezeigt, dass die Anwendung von angepassten Methoden der kurzkohärenten Interferometrie in der digitalholographischen Mikroskopie eine selektive Erfassung und Rekonstruktion definierter Reflexionsebenen ermöglicht. Hierbei ist die axiale Auflösung durch die Kohärenzlänge des verwendeten Lichts bestimmt; eine spektrale Bandpassfilterung des Lichts bewirkt eine definierte Erhöhung der Kohärenzlänge, wodurch die Empfindlichkeit gegenüber Fluktuationen in der Weglängendifferenz, z.B. durch mechanische Instabilitäten, vermindert wird.
Da die interferometrisch selektierte Objektebene im Allgemeinen nicht scharf abgebildet wird, wurde durch die Kombination von raumfrequenz- oder gradientenbasierten Bildschärfequantifizierungsverfahren mit der numerischen Propagation ein flexibler Autofokus für die digitalholographische Mikroskopie entwickelt. Hierdurch wird eine nachträgliche automatisierte Fokusstabilisierung sowie eine simultane scharfe Abbildung von Objekten in unterschiedlichen Gegenstandsweiten ermöglicht. Diese erlaubt in Kombination mit kurzkohärent-interferometrischen Verfahren eine reflexionsebenenselektive digitalholographische Auflichtmikroskopie mit automatisierter Optimierung der Abbildung. Hiermit konnte erstmals die durch eine lebende Zelle verursachte Phasenverzögerung in Auflicht bestimmt werden. Des Weiteren ermöglichen die bei der Autofokussierung von Messreihen erhaltenen Daten bei gleichzeitiger lateraler Maximalphasenbestimmung die quantitative dreidimensionalen Analyse von Objektbewegungen. Dieses Messprinzip ist z.B. zur Analyse von Sedimentations- und Migrationsprozessen von Zellen einsetzbar.
Inhaltsverzeichnis
- Kurzzusammenfassung
- Abstract
- 1 Einleitung und Motivation
- 2 Theoretische Grundlagen und Vorbetrachtungen
- 2.1 Kohärenz
- 2.1.1 Zeitliche Kohärenz
- 2.1.2 Räumliche Kohärenz
- 2.1.3 Kohärenzeingeschaften polychromatischer Lichtquellen
- 2.2 Digitale Holographie
- 2.2.1 Grundlagen der Holographie
- 2.2.2 Aufnahme digitaler Hologramme
- 2.2.3 Skalare Beugungstheorie
- 2.2.3.1 Fresnel-Kirchhoffsches Beugungsintegral
- 2.2.3.2 Fresnel-Approximation
- 2.2.4 Phasenschiebende Verfahren zur Objektwellenrekonstruktion
- 2.2.5 Separation der komplexen Objektwelle
- 2.2.6 Kompensation von Phasenabberationen
- 2.2.7 Interpretation der rekonstruierten Phasenverteilung
- 2.2.8 Laterales Auflösungsvermögen und Schärfentiefe
- 2.2.9 Digitale Holographie mit kurzkohärenten Lichtquellen
- 2.2.10 Reflexionsebenenselektive digitale Holographie mit kurzkohärenten Lichtquellen
- 2.3 Autofokusverfahren für die digitale Holographie
- 2.3.1 (De-)Fokussierte kohärente Abbildung
- 2.3.2 Verfahren zur Quantifizierung der Bildschärfe
- 2.3.2.1 Gewichtete Spektralanalyse (SPEC)
- 2.3.2.2 Statistische Varianzanalyse (VAR)
- 2.3.2.3 Kumulierte Gradientenbildung (GRA)
- 2.3.2.4 Kumulierte Laplace-Filterung (LAP)
- 2.3.3 Digitalholographische Autofokussierung
- 2.3.4 Autofokussierung von Amplituden- und Phasenobjekten
- 2.1 Kohärenz
- 3 Experimentelle Methoden
- 3.1 Kurzkohärenz
- 3.1.1 Lichtquellen
- 3.1.2 Bestimmung der Emissionsspektren
- 3.1.3 Aufnahme von Hologrammstapeln bei Variation der optischen Weglängendifferenz
- 3.1.4 Bestimmung der Kohärenzfunktion
- 3.1.4.1 Visibilitätsbestimmung
- 3.1.4.2 Modulationsbestimmung mit der Fourier-Transformationsmethode
- 3.1.4.3 Zweistufige Modulationsbestimmung mit der Fourier Transformationsmethode
- 3.1.5 Detektion von Reflexionsebenen
- 3.1.6 Zuordnung der Kohärenzmaxima
- 3.2 Digitale Holographie
- 3.2.1 Rekonstruktion der komplexen Objektwelle
- 3.2.2 Weiterverarbeitung der Phasenverteilung
- 3.2.2.1 Filterung
- 3.2.2.2 Entfaltung von Phasensprüngen
- 3.2.3 Dreidimensionale Rekonstruktion reflektiver Objektstrukturen
- 3.3 Digitalholographischer Autofokus
- 3.3.1 Propagationsintervall und Intervallschachtelungsstrategie
- 3.3.2 Autofokus-Kriterien
- 3.3.3 Hann-Filterung
- 3.3.4 Digitalholographische Multifokusuntersuchungen
- 3.4 Reflexionsebenenselektive digitalholographische Mikroskopie in Auflicht
- 3.5 Quantitative Positionsverfolgung von Phasenobjekten
- 3.5.1 Axiale Objektverfolgung
- 3.5.2 Laterale Objektverfolgung
- 3.5.3 3D-Verfolgung
- 3.1 Kurzkohärenz
- 4 Ergebnisse und Diskussion
- 4.1 Charakterisierung der eingesetzten Lichtquellen
- 4.1.1 Emissionsspektren
- 4.1.2 Vergleich der Methoden zur Bestimmung der Kohärenzfunktion
- 4.1.2.1 Visibilitätsbestimmung
- 4.1.2.2 Modulationsbestimmung mit der Fourier-Transformationsmethode
- 4.1.2.3 Zweistufige Modulationsbestimmung mit der Fourier Transformationsmethode
- 4.1.3 Interferometrische Charakterisierung der Kohärenzeingenschaften
- 4.2 Digitale Holographie mit kurzkohärenten Lichtquellen
- 4.2.1 Räumliches Phasenschieben
- 4.2.2 Auflösungsquantifizierung
- 4.2.2.1 Laterale Auflösung
- 4.2.2.2 Phasenauflösung
- 4.2.2.3 Abhängigkeit der Phasenverteilung von der verwendeten Wellenlänge
- 4.2.3 Numerische Propagation rekonstruierter Wellenfelder
- 4.2.4 Einfluss des Weglängenunterschiedes auf die digitalholographische Rekonstruktion
- 4.2.5 Reflexionsebenenselektive digitale Holographie
- 4.2.5.1 Digitalholographische Detektion und definierte Rekonstruktion von Objektebenen
- 4.2.5.2 Dreidimensionale Rekonstruktion reflektiver Objektstrukturen
- 4.3 Digitalholographischer Autofokus
- 4.3.1 Parameteroptimierung der kantendetektionsbasierenden Verfahren zur Bildschärfequantifizierung
- 4.3.1.1 Kumulierte Gradientenbildung
- 4.3.1.2 Kumulierte Laplacefilterung
- 4.3.2 Hann-Filterung
- 4.3.2.1 Technische Amplitudenobjekte in Auflicht
- 4.3.2.2 Zellbiologische Phasenobjekte in Durchlicht
- 4.3.3 Vergleich der Autofokus-Algorithmen
- 4.3.3.1 Bildschärfequantifizierung bei Amplitudenobjekten
- 4.3.3.2 Bildschärfequantifizierung bei Phasenobjekten
- 4.3.3.3 Recheneffizienz
- 4.3.3.4 Beurteilung der Autofokus-Algorithmen
- 4.3.4 Bestimmung des Zusammenhanges zwischen Gegenstandsweite und Autofokusdistanz
- 4.3.1 Parameteroptimierung der kantendetektionsbasierenden Verfahren zur Bildschärfequantifizierung
- 4.4 Anwendungen
- 4.4.1 Bestimmung der Phasenverzögerung von durchlaufenen Proben in Auflicht durch reflexionsebenenselektive digitale Holographie
- 4.4.2 Automatisierte Refokussierung bei digitalholographischen Langzeituntersuchungen
- 4.4.3 Digitalholographische Multifokusrekonstruktion
- 4.4.4 Digitalholographische 3D-Objektverfolgung
- 4.4.4.1 3D-Objektverfolgung an Einzelzellen
- 4.4.4.2 Multifokale 3D-Verfolgung mehrerer Zellen
- 4.4.4.3 Multifokale 3D-Verfolgung bei veränderlicher Objektform
- 4.1 Charakterisierung der eingesetzten Lichtquellen
- 5 Zusammenfassung und Ausblick
- Literaturverzeichnis
- A Anhang
- A.1 Technische Daten
- A.1.1 Kamerasensoren
- A.1.2 Bandpassfilter
- A.1.3 USAF 1951 Auflösungstesttafel
- A.2 Softwaremodule
- A.2.1 Bestimmung von Kohärenzfunktionen
- A.2.1.1 gIselControl
- A.2.1.2 KontrastGUI
- A.2.2 Digitalholographische Autofokussierung
- A.2.2.1 dcholo
- A.2.3 Digitalholographische Verfolgung von Objektpositionen
- A.2.3.1 PhaseIllustrator
- A.2.3.2 SortGUI
- A.2.3.3 Trackpoint
- A.2.1 Bestimmung von Kohärenzfunktionen
- A.1 Technische Daten
- Danksagung
- Veröffentlichungen
- Abkürzungs- und Variablenverzeichnis
Zielsetzung & Themen
Das Hauptziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Optimierung von Verfahren zur Rauschminderung, zur selektiven Erfassung von Reflexionsebenen und zur numerischen Autofokussierung in der digitalholographischen Mikroskopie. Die Forschungsfrage konzentrierte sich darauf, wie kurzkohärente Lichtquellen und angepasste Autofokusalgorithmen die Abbildungsqualität verbessern und eine quantitative dreidimensionale Analyse dynamischer zellbiologischer Prozesse ermöglichen können.
- Charakterisierung und Optimierung kurzkohärenter Superlumineszenzdioden (SLDs) für die Digitalholographie.
- Entwicklung und Anwendung von Methoden der kurzkohärenten Interferometrie zur selektiven Akquisition und Rekonstruktion definierter reflektiver Objektebenen.
- Implementierung einer vielseitigen Autofokus-Technik durch Kombination numerischer Propagation mit bildschärfequantifizierenden Verfahren.
- Reduktion des Phasenrauschens und Unterdrückung parasitärer Interferenzen durch den Einsatz kurzkohärenter Lichtquellen.
- Automatisierte Fokusstabilisierung und gleichzeitige scharfe Abbildung von Objekten in unterschiedlichen Abständen.
- Quantitative dreidimensionale Analyse von Objektbewegungen, insbesondere Sedimentations- und Migrationsprozesse von Zellen.
Auszug aus dem Buch
Abstract
The aim of this work was to develop methods for noise reduction, the evaluation of defined reflective object planes and numerical autofocusing in digital holographic microscopy.
At first, the properties of the applied short-coherent superluminescent diodes were characterized and optimized. It was demonstrated that digital holograms that were recorded with these light sources can be reconstructed with methods of spatial phase-shifting interferometry. Convolution-based propagation enables the variation of the image distance of the reconstructed object wave. The experiments showed that using short-coherent light sources instead of a laser significantly reduces the resulting phase noise. In addition, the application of adapted methods of short-coherent interferometry in digital holographic microscopy enables the selective acquisition and reconstruction of reflective object planes. Here, the axial resolution is determined by the coherence length of the light; spectral band-pass filtering results in a defined increase in the coherence length, thus the sensitivity to fluctuations in the optical path length difference, by mechanical instabilities for example, can be reduced.
Since the interferometrically-selected object plane is generally not sharply focused, a versatile autofocus technique for digital holographic microscopy was developed by a combination of numerical propagation with spatial-frequency- or gradient-based methods for the quantification of the image sharpness. Thus, subsequent automated focus-stabilization and the simultaneous sharp imaging of objects in different distances were proven to be possible. In short-coherent digital holographic microscopy this makes available the reconstruction of defined reflective object planes with automated optimization of the imaging conditions. Hereby, for the first time, the phase delay of a living cell could be determined in reflected-light microscopy. Moreover, the data obtained from numerical autofocusing and from tracking the maximal phase delay enables a quantitative three-dimensional analysis of object dynamics. This method can be applied in the analysis of sedimentation and migration processes of cells, for example.
Zusammenfassung der Kapitel
Kurzzusammenfassung: Dieses Kapitel fasst die Entwicklung von Verfahren zur Rauschminderung, Reflexionsebenenselektion und numerischen Autofokussierung in der digitalholographischen Mikroskopie zusammen, wobei insbesondere der Einsatz kurzkohärenter Lichtquellen hervorgehoben wird.
Abstract: This chapter provides an English summary of the work's aim, which is the development of methods for noise reduction, evaluation of reflective object planes, and numerical autofocusing in digital holographic microscopy.
1 Einleitung und Motivation: Dieses Kapitel beleuchtet die Bedeutung der optischen Mikroskopie für zellbiologische Prozesse und stellt die digitale Holographie als vielversprechende Methode zur markerfreien, hochaufgelösten und quantitativen Analyse dynamischer Lebensvorgänge vor.
2 Theoretische Grundlagen und Vorbetrachtungen: Dieses Kapitel legt die wissenschaftlichen Fundamente der Arbeit dar, indem es Konzepte wie Kohärenz, die Prinzipien der digitalen Holographie und verschiedene Autofokusverfahren sowie deren mathematische Herleitungen detailliert erklärt.
3 Experimentelle Methoden: Hier werden die für die Untersuchungen entwickelten und verwendeten experimentellen Aufbauten, Lichtquellen und Softwaremodule beschrieben, einschließlich der Methoden zur Kohärenzfunktionsbestimmung und zur 3D-Positionsverfolgung von Phasenobjekten.
4 Ergebnisse und Diskussion: Dieses Kapitel präsentiert die experimentellen Resultate, diskutiert die Charakterisierung der Lichtquellen und die Performance der digitalholographischen Rekonstruktions- und Autofokusverfahren, und illustriert deren Anwendung anhand biologischer Zelluntersuchungen.
5 Zusammenfassung und Ausblick: Das finale Kapitel resümiert die wesentlichen Ergebnisse der Arbeit, insbesondere die erfolgreiche Entwicklung und Anwendung rauschminimierter, ebenenselektiver und autofokussierender digitalholographischer Mikroskopie, und skizziert potenzielle zukünftige Entwicklungs- und Anwendungsfelder.
Literaturverzeichnis: Listet alle im Text zitierten wissenschaftlichen Publikationen auf und dient als Referenz für die Grundlagen der Arbeit.
A Anhang: Dieser Abschnitt enthält ergänzende technische Details zu verwendeten Kamerasensoren, Filtern und Testtafeln sowie detaillierte Beschreibungen der im Rahmen der Arbeit entwickelten Softwaremodule für die Datenanalyse und Objektverfolgung.
Schlüsselwörter
Digitalholographische Mikroskopie, Kurzkohärente Lichtquellen, Numerische Autofokussierung, Phasenrauschen, Reflexionsebenenselektion, 3D-Positionsverfolgung, Superlumineszenzdioden (SLD), Interferometrie, Bildschärfequantifizierung, Zellbiologische Prozesse, Dynamikanalyse, Kohärenzfunktion, Wellenfelder, Optische Kohärenztomographie (OCT)
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?
Diese Arbeit befasst sich mit der Entwicklung und Optimierung von Verfahren zur Rauschminderung, Reflexionsebenenselektion und numerischen Autofokussierung in der digitalholographischen Mikroskopie, insbesondere unter Einsatz kurzkohärenter Lichtquellen.
Was sind die zentralen Themenfelder?
Die zentralen Themenfelder umfassen die Charakterisierung kurzkohärenter Lichtquellen, die Anwendung kurzkohärenter Interferometrie für die Ebenenselektion, die Entwicklung und den Vergleich von Bildschärfequantifizierungsverfahren für den Autofokus sowie die quantitative dreidimensionale Analyse dynamischer zellbiologischer Prozesse.
Was ist das primäre Ziel oder die Forschungsfrage?
Das primäre Ziel ist die Entwicklung von Methoden, die eine rauschminimierte, ebenenselektive und automatisch fokussierte digitalholographische Mikroskopie ermöglichen, um damit eine quantitative 3D-Analyse dynamischer Objekte, insbesondere lebender Zellen, durchzuführen.
Welche wissenschaftliche Methode wird verwendet?
Die Arbeit verwendet primär die digitale Holographie in Kombination mit kurzkohärenter Interferometrie, numerischer Propagation von Wellenfeldern und verschiedenen Algorithmen zur Bildschärfequantifizierung für die Autofokussierung.
Was wird im Hauptteil behandelt?
Der Hauptteil der Arbeit behandelt die theoretischen Grundlagen der Kohärenz und Digitalholographie, die experimentellen Methoden zur Charakterisierung von Lichtquellen und zur Implementierung des Autofokus, sowie die Ergebnisse und Diskussion der entwickelten Verfahren und ihrer Anwendungen auf zellbiologische Proben.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Digitalholographische Mikroskopie, Kurzkohärente Lichtquellen, Numerische Autofokussierung, Phasenrauschen, Reflexionsebenenselektion, 3D-Positionsverfolgung, Superlumineszenzdioden, Interferometrie, Bildschärfequantifizierung, Zellbiologische Prozesse, Dynamikanalyse, Kohärenzfunktion, Wellenfelder, Optische Kohärenztomographie.
Welche Vorteile bieten kurzkohärente Lichtquellen in der digitalholographischen Mikroskopie?
Kurzkohärente Lichtquellen reduzieren signifikant das Phasenrauschen und unterdrücken Specklebildung sowie parasitische Interferenzen. Sie ermöglichen zudem die selektive Akquisition und Rekonstruktion definierter reflektiver Objektebenen, wodurch die axiale Auflösung verbessert und die Empfindlichkeit gegenüber mechanischen Instabilitäten reduziert wird.
Warum ist eine Hann-Filterung für Amplitudenobjekte im Autofokusverfahren wichtig?
Eine Hann-Filterung ist entscheidend, um Randbeugungsartefakte, die bei der Propagation der Objektwelle auftreten, zu unterdrücken. Diese Artefakte könnten sonst als Unschärfe fehlinterpretiert werden und die eindeutige Ermittlung der fokussierten Bildebene beeinträchtigen.
Wie trägt die Intervallschachtelung zur Effizienz der Autofokussierung bei?
Die Intervallschachtelung reduziert den Rechenaufwand erheblich, indem sie den gesamten Propagationsbereich zunächst grob abtastet und dann nur noch einen kleineren Bereich um das detektierte Extremum mit feinerer Schrittweite untersucht, anstatt den gesamten Bereich detailliert zu scannen.
Welche zellbiologischen Anwendungen werden mit den entwickelten Methoden untersucht?
Die entwickelten Methoden werden zur Analyse von Sedimentations- und Migrationsprozessen lebender Zellen eingesetzt. Dies umfasst die quantitative 3D-Positionsverfolgung von Erythrozyten und Tumorzellen, um deren Dynamik und Formveränderungen zu untersuchen.
- Citation du texte
- Dipl.-Phys. Patrik Langehanenberg (Auteur), 2009, Untersuchungen zum Einsatz kurzkohärenter Lichtquellen und numerischer Autofokussierungsverfahren in der digitalholographischen Mikroskopie, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/138340
