Die Überaktivität des PI3K/AKT-Signalweges ist ein Merkmal vieler Krebserkrankungen. Eine entscheidende Rolle spielt dabei insbesondere die Aktivität von AKT. Ziel dieser Arbeit war es, diese Rolle näher zu untersuchen, indem das Protein spezifisch ausgeschaltet wurde. Anwendung fand dabei die im Labor bereits etablierte Methode der Transfektion mittels Elektroporation. Durchgeführt wurde diese Methode an der ALL-Zelllinie Jurkat. Die möglichen Veränderungen hinsichtlich der Effekte von AKT wurden mithilfe von Untersuchungen zur Zellproliferation, Apoptoseinduktion und Proteinexpression charakterisiert. Diese sollten dabei helfen, die Wirkungen von AKT innerhalb des PI3K/AKT Signalweges besser zu verstehen und mögliche Rückschlüsse auf seine Bedeutung für Tumorzellen zulassen.
Zudem sollten die Ergebnisse zeigen, ob das gezielte Ausschalten des AKT-Gens neben der Verwendung von Aktinhibitoren einen möglichen therapeutischen Ansatz zur Behandlung von akuter lymphatischer Leukämie darstellt.
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1.1 Signaltransduktion
1.2 Der PI3K/Akt Signalweg
1.3 Pathologische Veränderungen im PI3K/AKT Signalweg
1.4 RNA-Interferenz
1.5 Zielstellung der Arbeit
2. Material und Methoden
2.1 Materialien
2.1.1 Geräte
2.1.2 Verbrauchsmaterialien
2.1.3 Medien, Puffer und Lösungen
2.1.4 Western Blot Antikörper
2.1.5 Chemikalien und Reagenzien
2.1.6 siRNAs
2.2. Zellbiologische Methoden
2.2.1 Kultivierung humaner Leukämiezelllinie Jurkat
2.2.2 Quantifikation – Zellzahl und Vitalität
2.3. Molekularbiologische Methoden
2.3.1 Herstellung von Proteinlysaten
2.3.2 Proteinbestimmung nach Bradford
2.3.3 Western Blot
2.3.3.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
2.3.3.2 Semi-Dry Blot
2.3.3.3 Proteinfärbung mit Ponceau S
2.3.3.4 Blocken unspezifischer Bindungsstellen und Immunreaktion
2.3.3.5 Detektion mittels Meerrettichperoxidase
2.4. Transfektion mit siRNA (small interfering RNA)
2.4.1 Transfektion mittels Elektroporation
2.4.2 Verwendete siRNA Moleküle
2.5 Durchflusszytometrie
2.5.1 Bestimmung der Transfektionsrate
2.5.2 Apoptose-/ Nekrosemessung
2.5.3 Intrazelluläre Färbung
2.6. Statistik
3. Ergebnisse
3.1 Transfektionseffizienz
3.2 Transfektion mit Cell Death siRNA
3.3 Ergebnisse der Transfektion mit siRNA AKT1
3.4 Ergebnisse der Transfektion mit siRNA AKT2
3.5 Transfektion mit AKT siRNA in Kombination
3.6 Überblick der Ergebnisse der Western Blots
3.7 Transfektionen mit AKT siRNA bei gleichzeitiger Stimulation mit IGF
4. Diskussion
5. Zusammenfassung und Ausblick
Zielsetzung & Themen
Die Arbeit untersucht die funktionelle Bedeutung des Proteins AKT innerhalb des PI3K/AKT-Signalweges in der humanen T-Zell-Leukämiezelllinie Jurkat. Ziel ist es, durch die spezifische Inaktivierung von AKT mittels RNA-Interferenz (siRNA) die Auswirkungen auf Proliferation, Apoptoseinduktion und Proteinexpression zu charakterisieren, um das therapeutische Potenzial dieses Signalwegs für die Behandlung akuter lymphatischer Leukämien zu evaluieren.
- Signaltransduktion und PI3K/AKT-Signalweg
- RNA-Interferenz als Methode zur Geninaktivierung
- Etablierung und Anwendung der Elektroporation zur Transfektion
- Analyse von Proliferations- und Apoptoseparametern (Durchflusszytometrie, WST-1 Test)
- Proteinanalytik mittels Western Blot zur Bestimmung der AKT-Expression und Caspase-Aktivierung
Auszug aus dem Buch
1.1 Signaltransduktion
Unter Signaltransduktion versteht man die Weiterleitung eines Primärsignals und die im Endeffekt daraus resultierenden Vorgänge innerhalb einer Zelle. Sie dient der Integration einer Zelle in ihre Umwelt und gibt ihr die Möglichkeit auf verschiedene interne oder externe Reize entsprechend zu reagieren. Die Signaltransduktion wird durch eine Vielzahl von Signalwegen vermittelt. An denen sind eine große Anzahl von Enzymen und sekundären Botenstoffen in einer oder mehreren nachgeschalteten Ebenen beteiligt. In der Literatur wird dabei auch oft von Signalkaskaden gesprochen [1]. Ein Signalweg steht und wirkt aber nie isoliert, sondern seine Signale werden zusammen mit denen anderer Signalkaskaden im Zytoplasma oder Zellkern integriert. Durch Signalkaskaden entsteht ein komplexes Signalnetzwerk, welches viele Feedback-Reaktionen und eine bessere Reaktionsfähigkeit bei auftretenden Störungen ermöglicht. Signaltransduktionsvorgänge sind für alle Organismen von essentieller Bedeutung. Da sie es zum einen ermöglichen auf Veränderungen ihrer Umwelt entsprechend zu reagieren und so ihr Überleben zu sichern und zum anderen, wie bereits erwähnt, um innere und äußere Reize zu verarbeiten. Durch Signaltransduktion werden wichtige biologische Prozesse reguliert wie z.B. die Immunreaktion, sämtliche Sinneswahrnehmungen, Zellproliferation und Gentranskription.
Am Anfang einer jeden Signaltransduktionskette steht ein extrazellulärer oder intrazellulärer Reiz. Dies können Hormone, Wachstumsfaktoren oder Neurotransmitter aber auch elektromagnetische Wellen (Licht), Duftstoffe oder mechanische Reize sein. Die extrazellulären Signale werden von einem Rezeptormolekül empfangen, welches gewöhnlich nur von einem bestimmten Signaltyp aktiviert werden kann. Daraufhin wird ein intrazelluläres Signal erzeugt, was in der Folge zu einer Signalkaskade führt bis eine endgültige Antwort der Zelle wie z.B. Aktivierung eines Stoffwechselenzyms oder Anschalten der Expression eines Gens ausgelöst wird [1].
Im Folgenden soll näher auf die Auslösung von Signalwegen durch Wachstumsfaktoren eingegangen werden. Diese spielen bei dem in dieser Arbeit untersuchten PI3K/AKT Signalweg eine entscheidende Rolle.
Zusammenfassung der Kapitel
1. Einleitung: Vermittelt die theoretischen Grundlagen zur Signaltransduktion, zum PI3K/AKT-Signalweg, dessen pathologischen Veränderungen bei Krebserkrankungen sowie zur Methode der RNA-Interferenz und der Zielstellung der Arbeit.
2. Material und Methoden: Beschreibt detailliert die verwendeten Geräte, Chemikalien, Puffer sowie die zell- und molekularbiologischen Methoden, insbesondere die Transfektion mittels Elektroporation, Durchflusszytometrie und Western Blot.
3. Ergebnisse: Präsentiert die experimentellen Daten zur Transfektionseffizienz, zum Effekt der AKT-Inaktivierung auf Zellzahl, Vitalität und Apoptoserate sowie die Proteinexpression unter verschiedenen Versuchsbedingungen.
4. Diskussion: Interpretiert die erzielten Ergebnisse im Kontext der aktuellen Forschung zu PI3K/AKT-Inhibitoren und diskutiert die Bedeutung von AKT für das Zellüberleben und die Proliferation in der Jurkat-Zelllinie.
5. Zusammenfassung und Ausblick: Fasst die Erkenntnisse zusammen und diskutiert zukünftige Ansätze zur weiteren Erforschung von PI3K/AKT-Signalwegen und deren Rolle bei Leukämien.
Schlüsselwörter
AKT, PI3K/AKT-Signalweg, siRNA, RNA-Interferenz, Jurkat-Zellen, akute lymphatische Leukämie, Elektroporation, Apoptose, Proliferation, Western Blot, Durchflusszytometrie, Signaltransduktion, Tumorentwicklung, Geninaktivierung, Caspase.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?
Die Arbeit befasst sich mit der Untersuchung der Funktion des Proteins AKT innerhalb des PI3K/AKT-Signalweges in Jurkat-Leukämiezellen und der Möglichkeiten, dieses Protein mittels siRNA gezielt auszuschalten.
Was sind die zentralen Themenfelder?
Die zentralen Themen sind Signaltransduktion, molekulare Mechanismen der Apoptose, Proliferation von Krebszellen sowie moderne molekularbiologische Methoden der Geninaktivierung.
Was ist das primäre Ziel oder die Forschungsfrage?
Das primäre Ziel ist es, die Rolle von AKT in Leukämiezellen durch spezifisches Ausschalten zu untersuchen und zu bewerten, ob dies einen therapeutischen Ansatz zur Behandlung akuter lymphatischer Leukämien darstellen könnte.
Welche wissenschaftliche Methode wird verwendet?
Hauptmethoden sind die transiente Transfektion mittels Elektroporation, die Durchflusszytometrie zur Analyse von Apoptose und Zellvitalität sowie die Proteinanalytik durch den Western Blot.
Was wird im Hauptteil behandelt?
Der Hauptteil gliedert sich in die methodische Beschreibung, die experimentelle Durchführung der Transfektionen mit unterschiedlichen siRNA-Konzentrationen sowie die systematische Analyse der gewonnenen Ergebnisse zu Proliferation und Proteinsignatur.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Die wichtigsten Schlagworte sind AKT, siRNA, PI3K/AKT-Signalweg, Apoptose, Proliferation, Jurkat-Zellen und Elektroporation.
Welche Rolle spielt die Jurkat-Zelllinie in dieser Untersuchung?
Jurkat-Zellen wurden als Modell für eine humane T-Zell-Leukämie gewählt, da sie kein PTEN exprimieren und ein hohes Level an aktiviertem AKT aufweisen.
Warum war die Kombination von AKT-siRNAs notwendig?
Da die Transfektion mit einzelnen siRNAs nur geringfügige Effekte zeigte, wurden beide siRNAs kombiniert, um eventuell stärkere Hemmeffekte bei der Proliferation oder Apoptoseinduktion zu erzielen.
Wie wurde die Wirksamkeit der siRNA auf Proteinebene kontrolliert?
Die Wirksamkeit wurde mittels Western Blot überprüft, wobei durch Antikörper gegen AKT und Caspasen die verringerte Expression des Proteins sowie die Spaltung von Caspase-Substraten nachgewiesen wurde.
- Quote paper
- Katja Will (Author), 2009, Untersuchungen zur Rolle des Proteins AKT innerhalb des PI3K/AKT-Signalweges bei akuten lymphatischen Leukämien mittels siRNA, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/139634
