Die Überaktivität des PI3K/AKT-Signalweges ist ein Merkmal vieler Krebserkrankungen. Eine entscheidende Rolle spielt dabei insbesondere die Aktivität von AKT. Ziel dieser Arbeit war es, diese Rolle näher zu untersuchen, indem das Protein spezifisch ausgeschaltet wurde. Anwendung fand dabei die im Labor bereits etablierte Methode der Transfektion mittels Elektroporation. Durchgeführt wurde diese Methode an der ALL-Zelllinie Jurkat. Die möglichen Veränderungen hinsichtlich der Effekte von AKT wurden mithilfe von Untersuchungen zur Zellproliferation, Apoptoseinduktion und Proteinexpression charakterisiert. Diese sollten dabei helfen, die Wirkungen von AKT innerhalb des PI3K/AKT Signalweges besser zu verstehen und mögliche Rückschlüsse auf seine Bedeutung für Tumorzellen zulassen.
Zudem sollten die Ergebnisse zeigen, ob das gezielte Ausschalten des AKT-Gens neben der Verwendung von Aktinhibitoren einen möglichen therapeutischen Ansatz zur Behandlung von akuter lymphatischer Leukämie darstellt.

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Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung

1.1 Signaltransduktion
1.2 Der PI3K/Akt Signalweg
1.3 Pathologische Veränderungen im PI3K/AKT Signalweg
1.4 RNA-Interferenz
1.5 Zielstellung der Arbeit

2. Material und Methoden

2.1 Materialien

2.1.1 Geräte
2.1.2 Verbrauchsmaterialien
2.1.3 Medien, Puffer und Lösungen
2.1.4 Western Blot Antikörper
2.1.5 Chemikalien und Reagenzien
2.1.6 siRNAs

2.2 Zellbiologische Methoden

2.2.1 Kultivierung humaner Leukämiezelllinie Jurkat
2.2.2 Quantifikation - Zellzahl und Vitalität

2.3 Molekularbiologische Methoden

2.3.1 Herstellung von Proteinlysaten
2.3.2 Proteinbestimmung nach Bradford
2.3.3 Western Blot

2.3.3.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
2.3.3.2 Semi-Dry Blot
2.3.3.3 Proteinfärbung mit Ponceau S
2.3.3.4 Blocken unspezifischer Bindungsstellen und Immunreaktion
2.3.3.5 Detektion mittels Meerrettichperoxidase

2.4 Transfektion mit siRNA (small interfering RNA)

2.4.1 Transfektion mittels Elektroporation
2.4.2 Verwendete siRNA Moleküle

2.5 Durchflusszytometrie

2.5.1 Bestimmung der Transfektionsrate
2.5.2 Apoptose-/Nekrosemessung
2.5.3 Intrazelluläre Färbung

2.6 Statistik

3. Ergebnisse
4. Diskussion
5. Zusammenfassung und Ausblick

Zielsetzung und Themenschwerpunkte

Diese Diplomarbeit untersucht die Bedeutung des Proteins AKT im PI3K/AKT-Signalweg bei akuten lymphatischen Leukämien. Die Arbeit nutzt siRNA-Technologie zur gezielten Beeinflussung der AKT-Expression und analysiert die Auswirkungen auf die Leukämiezellen. Die Hauptziele sind die Bestimmung der Effizienz der siRNA-Transfektion, die Analyse der Auswirkungen auf Zellvitalität und Apoptose sowie die Klärung des Einflusses von AKT auf den Zelltod.

Der PI3K/AKT-Signalweg und seine Rolle in der Leukämieentstehung
Die Anwendung von siRNA zur gezielten Hemmung des AKT-Proteins
Die Auswirkungen der AKT-Hemmung auf das Zellwachstum und die Apoptose von Leukämiezellen
Analyse der Transfektionseffizienz verschiedener siRNA-Moleküle
Bewertung der Ergebnisse mittels Western Blot und Durchflusszytometrie

Zusammenfassung der Kapitel

1. Einleitung: Dieses Kapitel liefert eine umfassende Einführung in die Signaltransduktion, den PI3K/AKT-Signalweg und dessen Rolle in der Pathogenese akuter lymphatischer Leukämien. Es beschreibt detailliert die Bedeutung des AKT-Proteins innerhalb dieses Signalweges und erläutert das Prinzip der RNA-Interferenz als Methode zur gezielten Genregulation. Die Zielsetzung der Arbeit wird präzise formuliert und die Relevanz der Forschung im Kontext der Leukämietherapie hervorgehoben. Die Einleitung schafft ein solides Fundament für die nachfolgenden Kapitel und verdeutlicht die wissenschaftliche Grundlage der durchgeführten Untersuchungen.

2. Material und Methoden: Dieses Kapitel beschreibt detailliert die Materialien, Geräte und Methoden, die in der Arbeit verwendet wurden. Es umfasst die Beschreibung der verwendeten Zellkultur, der Methoden zur Zellzahlbestimmung und Vitalitätsmessung, sowie die molekularbiologischen Methoden wie die Herstellung von Proteinlysaten, die Proteinbestimmung nach Bradford und die Durchführung von Western Blots. Ein besonderer Fokus liegt auf der Beschreibung der siRNA-Transfektion mittels Elektroporation und der verwendeten siRNA-Moleküle. Die Beschreibung der Durchflusszytometrie für die Bestimmung der Transfektionsrate, Apoptose- und Nekrose-Messung und intrazellulären Färbung wird ebenfalls umfassend dargestellt. Schließlich werden die angewendeten statistischen Methoden erläutert. Diese detaillierte Beschreibung der Methodik gewährleistet die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse.

Schlüsselwörter

Akute lymphatische Leukämien, PI3K/AKT-Signalweg, AKT-Protein, RNA-Interferenz, siRNA, Transfektion, Apoptose, Zellvitalität, Western Blot, Durchflusszytometrie, Elektroporation.

Häufig gestellte Fragen (FAQ) zur Diplomarbeit: Rolle des AKT-Proteins im PI3K/AKT-Signalweg bei akuten lymphatischen Leukämien

Was ist das Thema der Diplomarbeit?

Die Diplomarbeit untersucht die Bedeutung des AKT-Proteins im PI3K/AKT-Signalweg bei akuten lymphatischen Leukämien. Es wird mittels siRNA-Technologie die AKT-Expression beeinflusst und die Auswirkungen auf Leukämiezellen analysiert.

Welche Ziele verfolgt die Arbeit?

Die Hauptziele sind die Bestimmung der Effizienz der siRNA-Transfektion, die Analyse der Auswirkungen auf Zellvitalität und Apoptose sowie die Klärung des Einflusses von AKT auf den Zelltod.

Welche Methoden wurden angewendet?

Die Arbeit verwendet Zellkulturmethoden (Kultivierung der Jurkat-Zelllinie), molekularbiologische Methoden (Proteinlysat-Herstellung, Bradford-Assay, Western Blot), siRNA-Transfektion mittels Elektroporation und Durchflusszytometrie (zur Bestimmung der Transfektionsrate, Apoptose-/Nekrose-Messung und intrazellulären Färbung). Die statistische Auswertung der Ergebnisse wird ebenfalls beschrieben.

Welche Materialien wurden verwendet?

Die Arbeit beschreibt detailliert die verwendeten Geräte, Verbrauchsmaterialien, Medien, Puffer, Lösungen, Antikörper, Chemikalien, Reagenzien und siRNA-Moleküle.

Wie wird die siRNA-Transfektion durchgeführt?

Die siRNA-Transfektion erfolgt mittels Elektroporation. Die Arbeit beschreibt detailliert das Verfahren und die verwendeten siRNA-Moleküle.

Welche Ergebnisse werden präsentiert?

Die Arbeit präsentiert die Ergebnisse in einem separaten Kapitel (Kapitel 3). Der genaue Inhalt der Ergebnisse wird nicht im Vorspann beschrieben.

Wie werden die Ergebnisse diskutiert?

Die Diskussion der Ergebnisse findet in Kapitel 4 statt. Der Inhalt der Diskussion wird hier nicht vorweggenommen.

Was ist die Zusammenfassung und der Ausblick der Arbeit?

Kapitel 5 fasst die wichtigsten Ergebnisse zusammen und gibt einen Ausblick auf zukünftige Forschungsfragen.

Welche Schlüsselwörter beschreiben die Arbeit?