Untersuchungen zur Rolle des Proteins AKT innerhalb des PI3K/AKT-Signalweges bei akuten lymphatischen Leukämien mittels siRNA

Inhalt

1. Einleitung

1.1 Signaltransduktion

1.2 Der PI3K/Akt Signalweg

1.3 Pathologische Veränderungen im PI3K/AKT Signalweg

1.4 RNA-Interferenz

1.5 Zielstellung der Arbeit

2. Material und Methoden

2.1 Materialien

2.1.1 Geräte

2.1.2 Verbrauchsmaterialien

2.1.3 Medien, Puffer und Lösungen

2.1.4 Western Blot Antikörper

2.1.5 Chemikalien und Reagenzien

2.1.6 siRNAs

2.2. Zellbiologische Methoden

2.2.1 Kultivierung humaner Leukämiezelllinie Jurkat

2.2.2 Quantifikation – Zellzahl und Vitalität

2.3. Molekularbiologische Methoden

2.3.1 Herstellung von Proteinlysaten

2.3.2 Proteinbestimmung nach Bradford

2.3.3 Western Blot

2.3.3.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

2.3.3.2 Semi-Dry Blot

2.3.3.3 Proteinfärbung mit Ponceau S

2.3.3.4 Blocken unspezifischer Bindungsstellen und Immunreaktion

2.3.3.5 Detektion mittels Meerrettichperoxidase

2.4. Transfektion mit siRNA (small interfering RNA)

2.4.1 Transfektion mittels Elektroporation

2.4.2 Verwendete siRNA Moleküle

2.5 Durchflusszytometrie

2.5.1 Bestimmung der Transfektionsrate

2.5.2 Apoptose-/ Nekrosemessung

2.5.3 Intrazelluläre Färbung

2.6. Statistik

3. Ergebnisse

3.1 Transfektionseffizienz

3.2 Transfektion mit Cell Death siRNA

3.3 Ergebnisse der Transfektion mit siRNA AKT

3.4 Ergebnisse der Transfektion mit siRNA AKT

3.5 Transfektion mit AKT siRNA in Kombination

3.6 Überblick der Ergebnisse der Western Blots

3.7 Transfektionen mit AKT siRNA bei gleichzeitiger Stimulation mit IGF

4. Diskussion

5. Zusammenfassung und Ausblick

Literaturverzeichnis

Danksagung

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Regulation des PI3K/AKT-Signalweges

Abbildung 2: Übersicht über die Aktisoformen

Abbildung 3: Genetische Veränderungen des PI3K-Signalweges

Abbildung 4: Mechanismus der RNA-Interferenz

Abbildung 5: Neubauer Zählkammer

Abbildung 6: Reduktion des Tetrazoliumsalzes WST-1 zu Formazan

Abbildung 7: Aufbau des Blotsandwich

Abbildung 8: Elektroporationsküvette

Abbildung 9: Struktur des Aktmoleküls mit Bindestellen der verwendeten

siRNAs

Abbildung 10: Bestimmung der Transfektionsrate am Durchflusszytometer

Abbildung 11: Übersicht über Verteilung der lebenden, apoptotischen

und nekrotischen Zellen nach Annexin V-FITC und PI-Färbung

Abbildung 12: Darstellung der Vorgehensweise bei der Bestimmung

der Apoptose- und Nekroserate

Abbildung 13: Vorgehensweise bei der FACS-Messung nach

intrazellulärer Färbung

Abbildung 14: Ergebnisse der Zellzählung nach Transfektion mit

Cell Death siRNA

Abbildung 15: Vitalität nach Elektroporation mit Cell Death siRNA

Abbildung 16: Apoptoserate nach Transfektion mit Cell Death siRNA

Abbildung 17: Nekroserate nach Transfektion mit Cell Death siRNA

Abbildung 18: Zellzahl nach Transfektion mit AKT1 siRNA

Abbildung 19: Vitalität nach Transfektion mit AKT1 siRNA

Abbildung 20: Western Blot nach Tranfektion mit AKT1 siRNA

Abbildung 21: Zellzahl nach Transfektion mit AKT2 siRNA

Abbildung 22: Vitalität nach Transfektion mit AKT2 siRNA

Abbildung 23: Apoptose- und Nekroserate nach Transfektion

mit AKT2 siRNA

Abbildung 24: Zellzahl nach Transfektion mit kombinierten AKT siRNAs

Abbildung 25: Vitalität nach Transfektion mit kombinierten AKT siRNAs

Abbildung 26: Apoptose- und Nekroserate nach Transfektion mit

kombinierten AKT siRNAs

Abbildung 27: Mittlere Fluoreszenzintensität nach Transfektion mit

kombinierten AKT siRNAs

Abbildung 28: FACS-Daten intrazelluläre Färbung nach 48 h

Abbildung 29: Western Blot bei AKT siRNAs in Kombination

Abbildung 30: Western Blot AKT siRNAs

Abbildung 31: Western Blot mit Caspase-Antikörper

Abbildung 32: Zellzahl nach Transfektion mit AKT siRNAs bei gleichzeitiger

Stimulation mit IGF

Abbildung 33: Vitalität nach Transfektion bei gleichzeitiger Stimulation

Abbildung 34: Apoptose- und Nekroserate nach Transfektion bei

Gleichzeitiger Stimulation

Abbildung 35: Western Blot Stimulationsversuch

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Proteinstandards zur Erstellung der Eichkurve

Tabelle 2: Verwendete Primärantikörper

Tabelle 3: Verwendete Sekundärantikörper

Tabelle 4: Zielsequenzen der eingesetzten AKT siRNAs

Tabelle 5: Verwendete Farbstoffe bzw. Antikörper für FACS-Messung

Tabelle 6: Verwendete Antikörper für die intrazelluläre Färbung

Tabelle 7: Transfektionseffizienz

Tabelle 8: Signifikanzen (p-Werte) für die Apoptose- und Nekroserate

der mit AKT siRNA in Kombination behandelten Zellen bezogen

auf die Kontrolle nach dem Student t-test

Tabelle 9: Zellzahlen nach Behandlung mit verschiedenen

Konzentrationen VEGF

Tabelle 10: Zellzahlen nach Behandlung mit verschiedenen

Konzentrationen IGF

Abkürzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1. Einleitung

1.1 Signaltransduktion

Unter Signaltransduktion versteht man die Weiterleitung eines Primärsignals und die im Endeffekt daraus resultierenden Vorgänge innerhalb einer Zelle. Sie dient der Integration einer Zelle in ihre Umwelt und gibt ihr die Möglichkeit auf verschiedene interne oder externe Reize entsprechend zu reagieren. Die Signaltransduktion wird durch eine Vielzahl von Signalwegen vermittelt. An denen sind eine große Anzahl von Enzymen und sekundären Botenstoffen in einer oder mehreren nachgeschalteten Ebenen beteiligt. In der Literatur wird dabei auch oft von Signalkaskaden gesprochen [1]. Ein Signalweg steht und wirkt aber nie isoliert, sondern seine Signale werden zusammen mit denen anderer Signalkaskaden im Zytoplasma oder Zellkern integriert. Durch Signalkaskaden entsteht ein komplexes Signalnetzwerk, welches viele Feedback-Reaktionen und eine bessere Reaktionsfähigkeit bei auftretenden Störungen ermöglicht. Signaltransduktionsvorgänge sind für alle Organismen von essentieller Bedeutung. Da sie es zum einen ermöglichen auf Veränderungen ihrer Umwelt entsprechend zu reagieren und so ihr Überleben zu sichern und zum anderen, wie bereits erwähnt, um innere und äußere Reize zu verarbeiten. Durch Signaltransduktion werden wichtige biologische Prozesse reguliert wie z.B. die Immunreaktion, sämtliche Sinneswahrnehmungen, Zellproliferation und Gentranskription.

Am Anfang einer jeden Signaltransduktionskette steht ein extrazellulärer oder intrazellulärer Reiz. Dies können Hormone, Wachstumsfaktoren oder Neurotransmitter aber auch elektromagnetische Wellen (Licht), Duftstoffe oder mechanische Reize sein.

Die extrazellulären Signale werden von einem Rezeptormolekül empfangen, welches gewöhnlich nur von einem bestimmten Signaltyp aktiviert werden kann. Daraufhin wird ein intrazelluläres Signal erzeugt, was in der Folge zu einer Signalkaskade führt bis eine endgültige Antwort der Zelle wie z.B. Aktivierung eines Stoffwechselenzyms oder Anschalten der Expression eines Gens ausgelöst wird [1].

Im Folgenden soll näher auf die Auslösung von Signalwegen durch Wachstumsfaktoren eingegangen werden. Diese spielen bei dem in dieser Arbeit untersuchten PI3K/AKT Signalweg eine entscheidende Rolle.

Bei Wachstumsfaktoren handelt es sich um extrazelluläre Signalproteine, die verschiedenste intrazelluläre Prozesse regeln (Zellwachstum, Proliferation und Differenzierung) und insbesondere bei der Entwicklung von mehrzelligen Organismen eine wichtige Funktion übernehmen. Das Signal wird in der Regel über die Bindung des Wachstumsfaktors an einen spezifischen Rezeptor in der Zellmembran vermittelt. Es gibt sechs große Familien von Wachstumsfaktoren: FGF-Familie (Fibroblast growth factor), TGF-Familie (Transforming growth factor), Hedgehog, Wingless, Delta und Serrate und Ephrine. Bei Bindung an ihren jeweiligen spezifischen Rezeptor erzeugt dieser durch Konformationsänderung im Inneren der Zelle ein Signal, welches über eine Signalkaskade zur Aktivierung oder Abschaltung von Genen führt. Im Falle des untersuchten Signalweges handelt es sich um Rezeptor-Tyrosin-Kinasen (RTK), eine Klasse der enzymgekoppelten Oberflächenrezeptoren. Ein wichtiger Signalweg, der durch die Bindung von Wachstumsfaktoren an diese RTKs aktiviert wird, ist der PI3K/Akt Signalweg, der im nächsten Abschnitt ausführlich besprochen werden soll. [2]

1.2 Der PI3K/Akt Signalweg

Der Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K) Signalweg vermittelt zelluläre Wirkungen von Insulin und Wachstumsfaktoren. Auf der einen Seite schützt die Aktivierung des PI3K Signalweges vor vorprogrammiertem Zelltod (Apoptose). Diese Wirkung ist besonders für das Überleben und Wachstum von Tumorzellen von Bedeutung und kann dadurch zur Tumorentwicklung beitragen. Auf der anderen Seite spielt der PI3K Signalweg eine entscheidende Rolle bei der Regulation des Stoffwechsels durch Insulin und gestörte Funktionen des Signalweges begünstigen die Entwicklung des Diabetes mellitus. Auf diese Funktion soll im Folgenden nicht näher eingegangen werden. Die nachfolgenden Ausführungen konzentrieren sich auf die Bedeutung des PI3K/Akt Signalweges im Zusammenhang mit der Entstehung und Entwicklung von Tumoren.

Der PI3K/Akt-Kinaseweg ist ein wichtiger Regulator des Zellüberlebens. Seine Aktivierung spielt eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl zellulärer Prozesse wie z.B. Transkription, Proliferation, Migration, Zellwachstum, Apoptose und Glucosemetabolismus. [3, 4] Die Aktivierung der Lipidkinase PI3K wird neben

Wachstumsfaktoren wie EGF und IGF auch durch Hormone wie Insulin, durch Integrine, durch verschiedene Formen zellulären Stresses wie z.B. oxidativer Stress oder auch durch die Aktivierung von Ras induziert.

Die folgende Abbildung (Abb. 1) gibt einen kurzen Überblick über die Regulation des PI3K/Akt-Signalweges.

PI3Ks sind heterodimere Moleküle, die aus einer katalytischen (p110, 110 kD) und einer regulatorischen (p85, 85 kD) Untereinheit aufgebaut sind. Die Aktivierung einer Rezeptor-Tyrosin-Kinase durch Bindung eines der oben genannten Moleküle führt zur Aktivierung von PI3K, welche daraufhin innerhalb von Sekunden Phosphatidylinositole der Zellmembran phosphoryliert, d.h. aus PIP2 entsteht durch Phosphorylierung PIP3, ein wichtiger sekundärer Botenstoff. Die Aktivierung der regulatorischen Untereinheit der PI3K kann ebenfalls über G-Protein gekoppelte Rezeptoren erfolgen [3]. PIP3 rekrutiert nun Proteinkinasen wie z.B. PKB/Akt und PDK1, die mit ihrer PH- (Pleckstrin-homologe) Domäne an PIP3 binden. Die Lokalisierung an die Zellmembran führt zu Konformationsänderungen, durch die zwei Phosphorylierungsstellen des AKT-Moleküls exponiert werden. Die vollkommene Aktivierung von Akt erfordert die Phosphorylierung des Moleküls an beiden Stellen. Durch PDK2 (Ser473-Kinase) wird das Molekül beim Ser473 phosphoryliert und durch PDK1 bei Thr-308. PKB/Akt ist nun in aktiviertem Zustand dazu in der Lage eine große Anzahl an zellulären Signalmolekülen, die für die Regulation von Zellwachstum, Zellzyklus und Zellteilung wichtig sind, zu phosphorylieren. Als direkter Gegenspieler von Akt ist PTEN (Phosphatase und Tensin Homolog) zu nennen, welches die Umwandlung von PIP3 zu PIP2 fördert und somit eine Aktivierung von PKB/AKT verhindert [6]. Die Möglichkeit zur Inaktivierung bzw. Regulierung des Signalweges ist wichtig, um die Homöostase (Gleichgewicht) der verschiedenen zellulären Prozesse aufrecht zu erhalten.

Das Protein AKT spielt innerhalb des PI3K-Signalweges eine zentrale Rolle und ist wichtig bei der Vermittlung der PI3K-Effekte. Es handelt sich dabei um eine 57kD Ser/Thr-Kinase und das zelluläre Homologon des viralen Onkoproteins v-Akt. Es ist verwandt mit den Proteinkinasen A und C bei Säugetieren und wird deshalb auch häufig als Proteinkinase B bezeichnet [3]. Es gibt drei verschiedene AKT-Isoformen, die von unterschiedlichen Genen codiert werden: Akt1 (PKBα), Akt2 (PKBβ) und Akt3 (PKBγ). Akt1 wird ubiquitär in hohem Maße exprimiert, Akt2 kommt vorrangig in insulinsensitivem Gewebe einschließlich Leber, Skelettmuskulatur und Fettgewebe vor und Akt3 wird am stärksten im Gehirn exprimiert.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 2 Übersicht über die Aktisoformen [3]

Dargestellt sind die drei Aktisoformen mit ihren spezifischen Domänen:

N-terminale PH-Domäne, zentrale Kinase-Domäne und

C-terminale regulatorische Domäne

Jede Isoform besteht aus drei funktionellen Domänen: eine N-terminale PH-Domäne für die Bindung von Inositol-Phospholipiden und die Rekrutierung von AKT an die Plasmamembran, eine zentrale Kinase-Domäne und eine C-terminale regulatorische Domäne. Nach seiner vollständigen Aktivierung wird AKT in das Zytoplasma und den Zellkern translokalisiert, wo sich viele seiner Substrate befinden.

Der PI3K-Signalweg und somit auch AKT spielen eine wichtige Rolle bei verschiedenen physiologischen Prozessen wie z.B. der Apoptose, genauer gesagt bei der Hemmung der Apoptose. Zum einen schützt AKT durch die Inaktivierung proapoptotischer Faktoren Krebszellen vor apoptotischen Eingriffen. Zu diesen Faktoren gehören u.a. BAD (BCL2-antagonist of death), procaspase-9 und Forkhead Transkriptionsfaktoren [28, 29]. Zum anderen aktiviert AKT Transkriptionsfaktoren, die zur Hochregulation anti-apoptotischer Gene wie cyclic-AMP- response element-binding protein (CREB) führen.

Eine weitere bedeutende Rolle kommt AKT bei der Regulierung der Zellproliferation zu. Die Stimulation der Zellteilung wird durch die Aktivierung von mTor (mammalian target of rapamycin) durch AKT vermittelt. Ein wichtiger Bindungspartner von mTOR ist proline-rich Akt substrate 40 kDa (PRAS40). Unterphosphoryliertes PRAS40 hemmt die mTOR Kinaseaktivität [30, 31]. Daraufhin werden die ribosomale Proteinkinase p70S6k durch mTOR phosphoryliert. Das führt zu erhöhter Translation existierender mRNA Transkripte [32].

Solange der PI3K/AKT-Signalweg nicht von Mutationen oder anderweitigen Veränderungen betroffen ist, trägt er zur Aufrechterhaltung wichtiger physiologischer Prozesse bei. Allerdings ist er der am häufigsten von Veränderungen wie z.B. Amplifikationen, Mutationen und Rearrangements betroffene Signalweg, die dann im Endeffekt zur Entwicklung von Krebserkrankungen führen können [3]. Welche pathologischen Veränderungen Einfluss auf die Entstehung von Krebs haben, soll im nächsten Abschnitt besprochen werden.

1.3 Pathologische Veränderungen im PI3K/AKT Signalweg

Die Störung des Gleichgewichts zwischen Zellteilung und programmiertem Zelltod (Apoptose) ist die Ursache für die Entwicklung und das Fortschreiten von Krebserkrankungen. Der PI3K-Signalweg spielt bei beiden Prozessen eine wichtige Rolle.

Viele Komponenten dieses Signalwegs sind bei einer großen Anzahl von Tumoren dereguliert [5] und eine Überaktivierung des Signalwegs führt zudem zur Resistenz gegenüber verschiedenen Krebstherapien [7, 8]. Zum einen kann eine Veränderung des Signalweges bereits oberhalb von PI3K und AKT stattfinden, andererseits können die Moleküle PI3K, AKT und PTEN selbst betroffen sein.

Die Überexpression des erbB2 Tyrosin-Kinase-Rezeptors als ein Resultat von Genamplifikation ist ein gut untersuchtes Beispiel für die Überexpression von Zelloberflächenrezeptoren, was in der Folge zu einer verstärkten Aktivierung von downstream-Signalwegen u.a. auch des PI3K-Signalweges führt [3].

Bei der Betrachtung von PI3K, AKT und PTEN ist festzustellen, dass es Mutationen bei PI3KCA, welches für eine der p110 α Untereinheiten von PI3K codiert, gibt. Zudem führen Mutationen von PTEN und auch dessen vollständige Inaktivierung dazu, dass PIP3 nicht mehr zu PIP2 dephosphoryliert werden kann. Das vollkommene Ausschalten von PTEN wird oft in primären Tumoren und Krebszelllinien beobachtet [9, 10, 11]. Die genannten Veränderungen führen zu erhöhter Aktaktivität. Ebenso resultieren Abwandlungen von Wachstumsfaktorrezeptoren und Ras in Hyperaktivität von AKT in Tumorzellen [12] und vermitteln dadurch antiapoptotische Wirkungen auf Krebszellen.

Großangelegte Sequenzierungen konnten zur Identifizierung von Keimbahnpolymorphismen und somatischen Mutationen bei AKT2 und AKT3 beitragen [13, 14]. Es gibt in der PH-Domäne von AKT1 eine Mutation, die sehr selten ist und zunächst für Brust-, Kolorektal- und Eierstockkrebs beschrieben wurde [15] Später wurde diese Mutation auch für andere Krebserkrankungen nachgewiesen [16, 17, 18].

Die folgende vereinfachte Abbildung zeigt, dass alle entscheidenden Moleküle des PI3K-Signalweges von genetischen Veränderungen bei Krebserkrankungen betroffen sein können.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 3 Genetische Veränderungen des PI3K-Signalweges [19]

Komponenten des PI3K/AKT-Signalweges, die von genetischen

Veränderungen betroffen sein können

Die Überaktivierung bzw. unkontrollierte Aktivierung von AKT durch Genamplifikation von PI3K, AKT in Hirntumoren [20, 21, 22, 23] und anderen Tumorerkrankungen [24, 25, 5] oder durch Mutation bzw. Funktionsverlust von PTEN [20, 26, 27] steht mit der Entwicklung von Krebserkrankungen in Zusammenhang. Diese Tatsache führt zu dem Schluss, dass Möglichkeiten der Inaktivierung des PI3K/AKT-Signalweges durch Inhibitoren wie Wortmannin, LY294002 oder auch durch die gezielte Ausschaltung der Gene durch Transfektion mit siRNA, einen wichtigen therapeutischen Ansatz für die Behandlung von Krebserkrankungen darstellen können [3].

1.4 RNA-Interferenz

Das Abschalten von Genen mit molekularbiologischen Methoden ist in der Grundlagenforschung ein Standardverfahren geworden. Das Phänomen des Stilllegens von Genen ist ein natürlicher Mechanismus in eukaryotischen Zellen, der die Expression einzelner Gene hemmt. Entdeckt wurde dieser RNA-Interferenz genannte Mechanismus 1990, als ein Forscherteam versuchte, die Blütenfärbung von Petunien zu verstärken, indem eine zusätzliche Kopie des Gens für die Chalkonsynthase – einem Schlüsselenzym der Anthocyansynthese und somit der Farbstoffproduktion – in die Pflanzen eingeschleust wurde. Allerdings zeigte sich nicht der erwartete Effekt der Farbverstärkung, sondern einzelne Pflanzen zeigten hellere oder sogar weiße Bereiche auf den Blütenblättern. In diesen Pflanzen war das zusätzlich eingebrachte Gen, das für das farbstoffproduzierende Enzym codiert, reduziert worden. Dieses Phänomen wurde als Cosuppression bezeichnet [33]. Einige Jahre später zeigten Arbeiten, dass die Gene nicht nur auf Ebene der Transkription abgeschaltet wurden, sondern dass zusätzlich die von ihnen produzierte mRNA in den Zellen abgebaut wurde. Diesen Vorgang bezeichnete man dann als „Post-Transcriptional Gene Silencing“ (PTGS). 1998 wurde nach einer Vielzahl von Untersuchungen bestätigt, dass die mRNA maßgeblich an dem Phänomen des PTGS beteiligt ist. Im selben Jahr veröffentlichten Andrew Fire und Craig Mello die Technik der RNA-Interferenz, bei der doppelsträngige RNA (dsRNA) in C. elegans zu einem effizienten und spezifischen Gen-knockdown führt [34]. 1999 konnten Hamilton und Balcombe kurze RNAs mit einer Länge von ca. 25 Nukleotiden isolieren, die in direktem Zusammenhang zu den regulierten RNAs stehen: die siRNAs [35].

Folgende molekularen Mechanismen der RNA-Interferenz führen zum Stilllegen von Genen. SiRNAs entstehen, indem das sog. Enzym Dicer die ursprünglich eingebrachte dsRNA in kleine doppelsträngige Fragmente teilt. Hierbei handelt es sich um eine RNAse mit Homologie zur bakteriellen RNAse III. Die doppelsträngigen siRNAs werden mithilfe einer Helicase entwunden und ein Einzelstrang wird in den Proteinkomplex RISC (RNAi-induced silencing complex) eingebaut. Dieser Einbau führt dazu, dass RISC Spezifität für eine mRNA erhält, die komplementär zur eingebauten siRNA ist. Nun kann dieser Komplex über die siRNA an eine spezifische Zielsequenz binden und diese mithilfe der Untereinheit „Slicer“ des RISC-Komplexes zerschneiden. Der gesamte Prozess läuft unter Energieverbrauch ab und wird zudem auch erst durch diesen aktiviert. Die siRNAs bleiben dabei erhalten [36].

In der folgen Abbildung ist der eben beschriebene Mechanismus bildlich dargestellt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb.4 Mechanismus der RNA-Interferenz [57]

A. Aufbau der siRNA

B. Mechanismus der RNA-Interferenz

Die RNA-Interferenz stellt im Labor eine wichtige Methode dar, um gezielt Gene zu inaktivieren. Mithilfe der siRNA Transfektionen ist es dann möglich die funktionelle Bedeutung dieser Gene weitergehend zu untersuchen und analysieren.

1.5 Zielstellung der Arbeit

Die Überaktivität des PI3K/AKT-Signalweges ist ein Merkmal vieler Krebserkrankungen. Eine entscheidende Rolle spielt dabei insbesondere die Aktivität von AKT. Ziel dieser Arbeit war es, diese Rolle näher zu untersuchen, indem das Protein spezifisch ausgeschaltet wurde. Anwendung fand dabei die im Labor bereits etablierte Methode der Transfektion mittels Elektroporation. Durchgeführt wurde diese Methode an der ALL-Zelllinie Jurkat. Die möglichen Veränderungen hinsichtlich der Effekte von AKT wurden mithilfe von Untersuchungen zur Zellproliferation, Apoptoseinduktion und Proteinexpression charakterisiert. Diese sollten dabei helfen, die Wirkungen von AKT innerhalb des PI3K/AKT Signalweges besser zu verstehen und mögliche Rückschlüsse auf seine Bedeutung für Tumorzellen zulassen.

Zudem sollten die Ergebnisse zeigen, ob das gezielte Ausschalten des AKT-Gens neben der Verwendung von Aktinhibitoren einen möglichen therapeutischen Ansatz zur Behandlung von akuter lymphatischer Leukämie darstellt.

2. Material und Methoden

2.1 Materialien

2.1.1 Geräte

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.2 Verbrauchsmaterialien

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.3 Medien, Puffer und Lösungen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.6 siRNAs

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