Molecular characterization and identification of antigen 32-5B6 as enzyme S-Adenosyl-L-Homocystein-Hydrolase from Xenopus laevis oocyte nuclei

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung
1.1. Der Proteintransport in den Zellkern
1.2. Die Kernlokalisationssequenz
1.3. Modell für den Transport eines Proteins in den Zellkern
1.4. Zeitlich regulierter Kerntransport während der Frühentwicklung
1.5. Aufgabenstellung

2. Ergebnisse
2.1. Screening einer aus Xenopus laevis Ovar stammenden cDNA-Bibliothek
2.2. „in vivo excision“ der pBluescript(-) Plasmide aus dem Lambda Zap II
Vektor
2.3. Überprüfung der pBluescript(-)Plasmide auf darin enthaltene cDNA
2.4. Restriktionskartierung der cDNA
2.5. Plasmid-Doppelstrang-Sequenzierung
2.6. Aufreinigung des Antigens 32-5B6 über Anionenaustauscher­Chromatographie
2.7 Die zweidimensionale Gelelektrophorese
2.8. Protein-Mikrosequenzierung

3. Diskussion

4. Zusammenfassung

5.Material und Methoden
5.1.1. Medien und Lösungen für Bakterien
5.1.2. Lösungen für DNA-Präparationen
5.1.3. Lösungen für Proteinextraktion
5.1.4. Puffer und Lösungen für die Sequenzierungsreaktion
5.1.5. Puffer für Elektrophoresen
5.1.6. Agarplatten
5.1.7. Herstellung von Glycerinkulturen
5.1.8. Herstellung von ÜN-Kulturen
5.1.9. Puffer und Lösungen der zweidimensionalen Gelelektrophorese
5.2. Methoden
5.2.1. Bestimmung des Phagentiters
5.2.2. Antikörperscreening der Xenopus-Ovar-cDNA-Bibliothek
5.2.3. Vereinzelung der Kolonien
5.2.4. „in vivo excision“
5.2.5. Plasmidpräparation nach Quiagen
5.2.6. Behandlung von DNA mit Restriktionsendonukleasen
5.2.7. Agarosegelelektrophorese
5.2.8. DNA-Sequenzierung mit dem A.L.F-express
5.2.9. Zweidimensionale Gelelektrophorese
(praktische Durchführung)
5.3 Anionenaustauscherchromatographie
über Source Q unter FPLC-Einsatz
5.3.1. Herstellung von Oocyten-Proteinextrakt
5.3.2. Aufreinigung des Antigens 32-5B6 über die Anionen-
austauschersäule Source Q unter FPLC-Einsatz
5.3.3. Dot Blot-Analye des Antigens 32-5B6

6.Literaturverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

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SI-Einheiten

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1. Einleitung

1.1. Der Proteintransport in den Zellkern

Der Transport der Proteine in den Zellkern erfolgt über den Kemporenkom- plex. Dabei handelt es sich um einen energie- und rezeptorabhängigen Pro­zeß, der äußerst selektiv ist, und sich in zwei Schritten vollzieht:

Im ersten erfolgt das Andocken des Substrates an den Kernporenkomplex.

Dieser Schritt ist energie- und temperaturunabhängig. Im zweiten Schritt wird das gebundene Substrat durch den Kemporenkomplex geschleust.

Der Translokationsschritt ist jedoch temperatur- und energieabhängig.

[Newmeyer, 1986; 1988] Voraussetzung für den Transport eines Proteins in den Zellkern ist jedoch, daß das Protein eine Kernlokalisationssequenz besitzt. Sollte ein Protein jedoch keine Kemlokalsisationssequenz besitzen, kann es trotzdem in den Zellkern gelangen, indem es von einem Protein mit einer Kemlokalisatonssequenz „Hucke-Pack“ genommen wird. Außer dem Vorhandensein eines Rezeptors sind noch mindestens drei weitere cytosolische Faktoren für den Kemtransport erfoderlich: Hsp 70, Ran-GTPase und NFT 2. [Silver, 1991; Melchior, 1995; Görlich, 1996]

1.2. Die Kernlokalisationssequenz

De Robertis postulierte 1978 als Erster ein „selektives Eintrittssignal“, das für den Transport von Proteinen aus dem Cytoplasma in den Zellkern verantwortlich ist.

[ De Robertis et al. 1978]

Die Kemproteine besitzen keine allgemein übereinstimmende Kemlokalisationse- quenz, d.h., eine strikte Consensus-Sequenz ist nicht vorhanden. Trotzdem kön­nen fur die Kemlokalisationssequenzen folgende Übereinstimmungen festgestellt werden.

In der Regel stellen sie sehr kurze Sequenzen mit gewöhnlich nicht mehr als 8 -10 Aminosäuren dar. Ihre am höchsten konservierten Charakteristika scheinen die positiv geladenen Aminosäuren Arginin und Lysin zu sein. Diese können in in ihrer direkten Nachbarschaft Aminosäuren mit einer hydrophoben Kohlenwas­serstoff-Seitenkette wie z. B.Prolin oder Valin besitzen. Außerdem sind die Kemlokalisationssequenzen nicht an spezifischen Orten innerhalb eines Proteins lokalisiert und werden auch nicht nach der Lokalisation eines Proteins in den Zellkern abgespalten. Dagegen lassen sie sich mehr als einmal verwenden. [Garcia-Bustos, Heitmann, Hall 1990]

Einfache und zweiteilige Kemlokalisationssequenzen werden unterschieden:Das große T-Antigen des SV 40 besitzt eine einfache kurze Kemlokalisations- sequenz PKKKRKV, die 5 basische Aminosäuren enthält von 127 bis 131.

Eine Mutation in der Kemlokalisationssequenz in Pos. 128, bei der das 2. Lysin durch ein Threonin ersetzt wird, bewirkt, daß das Protein nicht im Kern lo­kalisiert werden kann. Dasselbe läßt sich bei einer Mutation Asparagin in Pos. 128 beobachten. Die Fusion der Kemlokalisationssequenz des großen T-Antigens SV 40 an ein Nicht-Kemprotein, bewirkt dessen Transport in den Zellkern. Der Austausch der Aminosäure Lysin in Pos. 128 gegen ein Threonin verhindert auch in diesem Fall den Kemtransport des Fusionspro­teins.

Nucleoplasmin stellt dagegen das erste Protein dar, bei dem nachgewiesen worden ist, daß eine Domäne den Kemtransport vermittelt.

In der C-terminale Domäne des Nucleoplasmins sind vier potentielle Kemlokalisa­tionssequenzen vorhanden. Wie Selektionsanalysen beweisen, setzt sich die Se­quenz, die fur die Zielsteuerung des Nucleoplasmas verantwortlich ist, aus zwei dieser Kemlokalisationssequenzen zusammen.

1.3. Modell für den Transport eines Proteins in den Zellkern

Das Protein bindet über seine Kernlokalisationsequenz im Cytoplasma an den NLS Rezeptor Importin a.[Göhrlich et. al., 1994] Dieser besitzt an seiner Aminosäurensequenz acht interne Wiederholungseinheiten von ca. 48 hydrophoben Aminosäuren. Jede einzelne Wiederholungseinheit präsentiert ein „Arm“-Motiv, das zuerst bei Armadillo, bei Plakoglobulinen und ß-Cate- nin-Proteinen, entdeckt wurden, [Peifer, 1994], Die „Arm“-Motive sollen Wechselwirkungen zwischen Proteinen vermitteln und sind vermutlich an der Bindung der Kemlokalisationssequenz des Proteins an Importin α beteiligt, [Peifer, 1994], Es ist allerdings noch nicht klar, ob auch Importinßauch an Trans­portschritten beteiligt ist, die dem Andocken der Proteine mit den Kemlokali- sationsequenzen an den Kemporenkomplex folgen. Die Bindung des Substrats an den NLS-Rezeptor Importin α soll zudem noch durch den Chaperon hsp 70 erleichtert oder beschleunigt werden. Dieser soll die Proteinfaltung und damit die Wechselwirkung zwischen dem NLS-tragenden Protein vermitteln. Mög­licherweise erleichtert hsp 70 auch die Freisetzung des NLS-Rezeptors zu ei­nem späteren Zeitpunkt des Kern-Imports, [Yang, De Franco 1994], Importin α, an welches das Substrat gebunden ist, lagert sich an Importinßüber seine IBB-Domäne an. Die Importin ß-bindende Domäne IBB des Importin α ist an deren N- Terminus lokalisiert. Die IBB-Domäne besitzt auch die Eigen­schaften einer Kemlokalisationssequenz und ist charakterisiert durch Cluster basischer Aminosäuren [Görlich, 1996; Weis, 1996], Die IBB-Domäne soll zudem ein archetypisches Signal fur die Zielsteuerung in den Kern darstellen.

Dafür spricht, daß sie strukturelle Ähnlichkeit zu einer Kernlokalisationssequenz besitzt und mit dieser evolutionär verwandt ist. [Görlich, 1996]

Importinßvermittelt das Andocken des Substrat-Rezeptor-Komplexes an den Kemporenkomplex. Unklar ist zur Zeit allerdings noch, an welchen Proteinen des Kernporenkomplexes sich das Importinßbindet. [ Görlich 1995; Moroianu 1995]

Für die Durchschleusung des Substrat-Rezeptor-Komplexes durch den Kernporen­komplex sind die cytosolischen Faktoren Ran GTP und NTF 2 erforderlich. Der cytosolische Faktor NTF 2 soll unter Mitwirkung von Ran-GTP den Substrat-Re­zeptor-Komplex durch den zentralen Kanal schleusen.

Diese Annahme folgt aus der Beobachtung, daß im Cytosol der Heia-Zellen kein NTF 2 mehr vorhanden ist, wenn sie mit dem Nucleoporin p 62 behandelt wurden. [Paschal, Gerace 1995] Da das Nucleoporin p 62 sowohl an der cytoplasmatischen, wie auch an der Kemperipherie des Kemporenkomplexes lokalisiert ist [Gnan et al., 1995] und auch in der Nähe des zentralen Kanals gefunden wird, ist es naheliegend, daß NTF 2 die Überführung des Substrat-Komplexes von der anfäng­lichen Andockstelle zum zentralen Kanal vermitteln könnte. [Melchior,Gerace 1995] NTF 2 sollte außerdem als Regulator des Ran-GTPase-Zykluses fungieren, wenn Ran an den Kemporenkomplex gebunden ist. So könnte NTF 2 den Nucleo- tid-Austausch bei Ran erleichtern, indem es sich an Ran-GDP bindet. Dies sollte in einer solchen Weise geschehen, daß die GTP-Hydrolyse die Durchschleusung des Substrat-Rezeptor-Komplexes entscheidend vorantreibt.[Pante',Aebi, 1996]

Bei Ran handelt es sich um eine kleine GTPase, die im Zellkern reichlich vor­vorhanden ist. [Melchior, 1993; Moore, 1993 und 1994] Ran muß in einem akti­ven GTP-gebundenen Zustand vorliegen, um den Kemimport von Proteinen mit einer Kemlokalisationsequenz zu vermitteln.

Ran füngiert als molekularer Schalter, es liegt sowohl in einer aktiven Form Ran/ GTP und Ran GDP-Form vor. Eine spontane Umwandlung zwischen diesen beiden Zuständen erfolgt nur sehr langsam [Bischoff, 1994], wird „in vivo“ kontrolliert und beschleunigt durch eine Vielzahl regulatorischer Proteine. [Pante'und Aebi, 1996]

Die aktivierte Form von der GTPase Ran wird vermutlich von einigen Nucleopo- rinen oder cytosolischen Faktoren reguliert. Ran-BPl ist z. B. ein cytoplasma­tisches Ran-bindendes Protein, das den Nucleotidaustausch von Ran-GTP hemmt in Abwesenheit von Ran-GAP 1. Bei Ran-GAP 1 handelt es sich um ein cytoplasmatisches Ran-GTPase aktivierendes Protein. Nach der Aktivierung im Cytoplasma durch Ran GAP 1 bindet Ran-GTP an cytoplasmatische Filamente.

Als bevorzugte Kandidaten für eine Bindung der aktiven Ran-GTP-Form werden die Nucleoporine Ran-BP 2 und Nup 358 angesehen. Nup 358 besitzt z. B. acht Ran Bindungs-Motive, an die Ran-GTP „in vitro“ bindet. [Pante', Aebi 1996]

Bei Nup 358 wurden Epitope gefunden, die an den cytoplasmatischen Filamenten des Kemporenkomplexes lokalisiert sind. [Pante', Aebi 1996] Das die Ran-binden- den Nucleoporine zudem eine sehr wichtige Rolle beim nucleoplasmatischen Trans­port zu spielen scheinen, zeigt sich unter anderem dadurch, daß der Anti-Nup 358- Antikörper den Kemtransport hemmt. [Pante ,Aebi 1995]

Einen weiteren Regulator der GTPase Ran stellt das Kemprotein RCC 1 dar, das zugleich die Chromosomen-Kondensation reguliert und als Guanin-Nucleotid-Aus­tauschfaktor GEF füngiert. [Dasso 1993]

Nachdem der Protein-Rezeptor-Komplex den geöffneten zentralen Kanal passiert hat, werden Importin a, NTF 2 und Ran.GDP ins Nucleoplasma freigesetzt. Importinßbleibt dagegen mit dem Kemporenkomplex assoziiert. Während und nach der Freisetzung ins Nucleoplasma disoziiert das Kernprotein von Importin α ab, Ran-GDP wird reaktiviert durch einen von RCC 1 katalysierten Nudeotid- Austausch bevor die Transportfaktoren im Cytoplasma recycelt werden. Es ist nicht klar, in welcher Form die GTPase Ran im Cytoplasma zu diesem Zeitpunkt existiert.[Pante', Aebi 1996]

1. 4. Zeitlich regulierter Kerntransport während der Frühentwicklung

Die Proteine des Oocytenkems von Xenopus laevis verteilen sich im Cytoplasma und werden erst wieder nach der Befruchtung in die embryonalen Kerne aufgenommen. Bemerkenswert ist, daß die Kernproteine während der Frühentwicklung zu unterschiedlichen Zeitpunkten in die Kerne transportiert werden [Übersicht Dreyer, 1989]. Die Kernlokalisation des jeweiligen Antigens erfolgt über einen längeren Zeitraum.. Zwei Klassen werden unterschieden:

Die früh und die spät wandernden Antigene [ Dreyer, 1981; Dreyer, 1987],

Zu den früh wandernden Kemproteinen, die schon in die Vorkeme aufge­nommen werden, zählen die Histon bindenden Proteine wie Nucleoplasmin [Bürglein, 1987, N 1, N 2; Kleinschmidt, 1986, N 4] sowie das Lamin L III, das am Aufbau der Kemmembran beteiligt ist [Stick, 1987].

Zu den spät wandernden Proteinen werden das Zinkfinger-Protein Xnf 7 [Mil­ler, 1989] und das nukleoläre Protein Nukleolin [Messmer, 1993] gezählt. Ihre Zellkerne akkumulieren während der Blastula Stadien.

Ein Großteil der von Dreyer et al. biochemisch und immunologisch untersuchten Kemproteine der Oocyte, sind bislang noch nicht weiter auf molekularem Ni­veau charakterisiert worden. Dazu zählt übrigens auch das spätwandemde Anti­gen 32-5B6. Dieses wird von den Zellkernen der Blastula bis zum Stadium 9 ausgeschlossen [Dreyer, 1987], Ab dem Gastrula-Stadium 12 wird es nach und nach in die Zellkerne geschleust. [ Dreyer et al. 1982; 1983 ]. Außerdem wird das Antigen 32-5B6 in spezifischen Zelltypen nach der Organogenese in einem hohen Ausmaß angereichert, wie z. B. in der Epidermis, den Hautdrüsen, den Nieren, den Makrophagen, den Lymphozyten, im Herzen, in der Lamina propria des Testis, den Sertoli-Zellen und im exokrinen Teil der Pankreas. Es fallt auf, daß das Antigen 32-5B6 im Kern von Zellen mit hoher sekretorischer Aktivität lokalisiert ist, wie z. B, in den Schleim sezernierenden Zellen des Pharyngo- bronchialtraktes, in den Epithelien der Mikrovilli des Gedärms. Auch in den Zellkernen des adulten Mesonephros lassen sich besonders starke Anreicherungen des Antigens 32-5B6 beobachten [Wedlich, Dreyer, 1987].

1. 5. Aufgabenstellung

Ziel der Arbeit ist es, das spätwandernde Antigen 32-5B6 auf molekularem Niveau zu charakterisieren [Dreyer und Hausen, 1983]. Dabei ist die Frage nach dem Vorhandensein einer Kemlokalisationssequenz besonders interes­sant. Vor allem im Hinblick auf die Hypothese, nach der früh in die Kerne eintretende Proteine effizientere Signalsequenzen enthalten sollen als die spät eintretenden [Dingwall et al., 1984].

Um die cDNA-Sequenz zu isolieren, die das spätwandemde Antigen 32-5B6 codiert, wird eine Lambda Zap II cDNA-Expressionsbibliothek mit dem mono­klonalen Antikörper 32-5B6 gescreent. Die eingesetzte cDNA-Expressionsbib- liothek repräsentiert die im Ovar von Xenopus laevis ,transcribierte mRNA.

In der Vergangenheit hat sich der Beweis, daß eine bestimmte cDNA-Sequenz ein gegebenes Antigen codiert als schwierig erwiesen, wenn monoklonale Anti­körper das einzige Selektionskriterium sind. Um einen weiteren Anhaltspunkt hinsichtlich der Sequenz des Antigens 32-5B6 zu bekommen, wird das Antigen 32-5B6 aus Oocytengesamt-Proteinextrakt über die Anionenaustauscher­chromatographie und zweidimensionale Gelelektrophorese für eine Protein­Mikrosequenzierung isoliert. Erst die Übereinstimmung der Ergebnisse aus der Proteinsequenzierung mit der aus der isolierten cDNA abgeleiteten Aminosäure­sequenz kann zu einer gesicherten Identifizierung des Antigens fuhren. .

2. Ergebnisse

2.1. Screening einer aus Xenopus laevis Ovar stammenden cDNA-Bibliothek

Um die cDNA-Sequenz zu isolieren, die das Antigen 32-5B6 codiert, wird die im

Lambda Zap II - Vektor enthaltene cDNA-Bibliothek aus Xenopus laevis Ovar mit dem monoklonalen Antikörper 32-5B6 gescreent.

Das Screening der cDNA-Bibliothek wird, wie unter 5.2.2. beschrieben, durchgeführt. Ins­gesamt werden 10 Platten mit je 50 000 pfu eingesetzt. Die amplifizierten Lambda-Phagen werden nach Beendigung des lytischen Zykluses freigesetzt. Das Wirtsbakterium, das die Fusionsproteine synthetisiert, wird dabei lysiert. Auf diese Weise entstehen feine lytische Plaques im Bakterienrasen. Das Muster der lytischen Plaques wird auf Nitrocellulosefilter übertragen. Der Nachweis des an das Fusionsprotein gebundenen monoklonalen Antikörpers 32-5B6 erfolgt durch einen gegen das IgG gerichteten zweiten Antikörper.

An diesen ist alkalische Phosphatase gekoppelt, die das eingesetzte Substrat zu einem Farbstoff umsetzt. Anhand dieser Farbreaktion können die vermutlich das Antigen 32-5B6 exprimierenden Plaques an ihrer ringförmigen Struktur erkannt werden. Diese wird da­durch verursacht, daß nur die noch nicht lysierten Bakterien am Rande eines Plaques zur Synthese von Fusionsproteinen befähigt sind. Nach dem ersten Screnning zeigen sich Plaques mit positiver Antikörperreaktion auf sechs der zehn eingesetzten Platten. Um Mischkolonien zu verhindern und zur Vereinzelung der Kolonien werden die Plaques mit einer positiven Antikörperreaktion nochmals aufgereinigt. Für das Rescreening wird aus den 6 Platten der Nr. 2,3,5,6,8 und 10 des ersten Screenings je ein Plaque mit positiver Antikörperreaktion ausgewählt und, wie unter 5.2.3. beschrieben, in immer größeren Verdünnungen ausplattiert und auf eine positive Reaktion getestet. Dieses Rescreening wird zweimal wiederholt bis möglichst alle Plaques eine positive Reaktion aufweisen. Eine reproduzierbare positive Antikörperreaktion läßt sich nur für fünf der sechs für das Rescreening ausgewählten Plaques der Nr. 2, 3, 5, 8 und 10 feststellen.

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Abb. 1 : Nitrocellulosefilter mit positiven Signalen aus einem Vereinzelungs­schnitt. Alle Plaques besitzen eine ringförmige Struktur und weisen eine positive Antikörperreaktion auf.

2.2. „In vivo excision“ der pBluescript (-) Plasmide aus dem Lambda Zap II -Vektor

Das pBluescript (-) Plasmid, das die klonierten cDNA-Inserts einschließt, wird aus dem Lambda Zap II-Vektor „in vivo“ entfernt. Zur „in vivo excision“ werden die durch zwei­maliges Rescreening aufgereinigten lytischen Plaques der Platten 2, 3, 5, 8, 10 wie unter 5.2.4. beschrieben, angereichert. Der E.coli XL-1 MRF’ Wirtsstamm wird mit je einem der fünf ausgewählten Lambda Zap II - Vektoren und den M 13 - Helferphagen gleichzeitig in­fiziert vgl. 5.2.4. Der Lambda Zap II - Vektor besitzt zudem einen Initiationsbereich, der normalerweise im f 1 - Bakteriophagen als Replikationsursprung fur die Synthese positiver DNA-Stränge dient und von den Proteinen des M 13 Helferphagen erkannt wird. Es wird in einen der beiden DNA-Stränge ein Bruch eingefuhrt. An der Bruchstelle beginnt die DNA-Synthese eines neuen DNA-Einzelstranges,die sich auch über den Bereich des klonierten DNA-Inserts erstreckt. Die DNA-Einzelstrangsynthese wird erst beendet, wenn die Terminationsstelle erreicht ist. Das Gen-II-Produkt des Ml3 Helferphagen zirkula- risiert das neugebildete DNA-Molekül, das alle Sequenzen des pBluescript (-) Plasmids wie auch die cDNA beinhaltet, falls eines vorhanden ist. Die zirkularisierte, einzelsträngige DNA wird anschließend verpackt und von den E. coli-Wirtszellen se- zemiert, die anschließend durch Erhitzen auf 70 °C abgetötet werden. Als Wirts­zellen für die pBluescript (-) Plasmide dienen die SOLR-Zellen, in denen sie sich im Gegensatz zu den M 13-Helferphagen replizieren können. Zudem sind die SOLR- Zellen resistent gegen die Infektion mit den Lambda-Phagen.

Die pBluescript (-) Plasmid-Stammlösungen werden zusammen mit den SOLR-Zellen inkubiert und dann in unterschiedlichen Konzentrationen auf Ampicillin enthaltenden Agar­platten ausplattiert. Nach der Inkubation ÜN bei 37 °C wachsen Ampicillin-resistente Kolonien auf den Agarplatten. Dies bedeutet, daß die „in vivo excision“ der pBluescript (-) Plasmide aus allen fünf ausgewählten Lambda Zap II-Vektoren funktioniert hat.

2.3. Überprüfung der pBluescript (-)Plasmide auf darin enthaltene cDNA

Um nachzuweisen, daß die über die „in vivo excision“ gewonnenen pBluescript(-) Plasmide eine cDNA enthalten, wurden von jedem der verschiedenen Plasmide ( pBSK 2,3, 5, 8 und 10 Einzelkolonien gepickt und in einer ÜNK vermehrt. Aus diesen ÜNK wurde die Plasmid - DNA isoliert. Anschließend wird die isolierte Plasmid-DNA einem Restriktionsverdau mit den Restriktionsenzymen EcoR I und Xho I unterzogen,der, wie unter 5.2.6. beschrieben, durchgefuhrt wird. Die Restriktionsenzyme EcoR I und Xho I schneiden an den Klonierungstellen der cDNA-Inserts. Wie der Vergleich der Restriktionsfragmente der Spuren a, b, c und d mit dem aufgetragenen DNA- Längenstandard in Abb. 2 zeigt, besitzen die Plasmide der Klone 2, 3, 5 und 8 ein cDNA-Insert mit einer Größe von ca. 2 kb. Die Vektor-DNA ist ca. 3 kb groß.

Wie Spur e in Abb. 2 zeigt, entstehen aus Klon 10 drei Restriktionsfragmente. Das Restriktionsfragment mit einer Größe von 3 kb entspricht der Vektor-DNA. Das Auftreten der Restriktionsfragmente von 1,4 kb und 0,8 kb zeigt, daß innerhalb des cDNA-Inserts von Klon 10 noch eine weitere Schnittstelle für eines der beiden Restriktionsenzyme - EcoR I oder Xho I- vorhanden ist. Deswegen muß angenommen werden, daß Klon 10 sich von den anderen Klonen 2, 3, 5 und 8 unterscheidet. Weil die Klone 2, 3, 5 und 8 ein cDNA-Insert gleicher Größe ( 2 kb) besitzen, soll durch weitere Restriktionsanalysen untersucht werden, ob sie die gleiche cDNA-Sequenz enthalten könnten.

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Abb. 2 Restii ktionsverdau der Klone 2, 3. 5, 8 und K) mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Xho E die an den Klonierungsstellen des d)NA-Inserts schneiden. Die Restriktionsfragmente wurden in einem 0,9% ΓΒΕ-Agarosegel bei 80 - 120 V elektrophoretisch aufgetrennt. Links außen ist der DNA-Längenstandard aulgetragen. Die einge/.eichneten DNA-Fragmente besitzen eine Grotte von 3, 2, 1.6. 1 und 0,517 kb. Spur a, b, c, d : je 2 Restriktionsfragmente des Klons 2, 3, 5 und 8 mit ca. 2 und 3 kb treten nach dem Verdau mit EcoR J und Xho I auf.Spur e : Je 3 Restriktionsfragmente des Klons 10 treten mit ca. 3 kb, 1,4 kb und 0,8 kb auf.

2.4. Restriktionskartierung der cDNA

Um einen weiteren Anhaltspunkt zu bekommen, in wieweit sich die cDNAs der Klone 2, 3, 5, 8 und 10 voneinander unterscheiden, werden weitere Re- striktionsverdaus mit verschiedenen Restriktionsenzymen durchgeführt, wie unter 5.2.6 beschrieben. Hierzu wird die Plasmid-DNA der fünf Klone 2, 3, 5, 8 und 10 mit den acht verschiedenen Restriktionsenzymen Sac I, Xba I, Spe I, BamH I,Pst I, Sma I, Xho I und Cia I verdaut, die alle eine Schnittstelle im Polylinker­bereich des DNA-Vektors aufweisen.

Das Ergebnis des Restriktionsverdaus der Plasmid-DNA der Klone 2, 3, 5 und 8 mit je einem der sechs verschiedenen Restriktionsenzymen Sac I, Xba I, Spe I, BamH I, Pst I, und Sma I ist in Abb. 3 dargestellt.

Wie der Vergleich der Restriktionsfragmente der Spuren a bis p und u bis x mit dem DNA-Längenstandard ergibt, tritt nach dem Restriktionsverdau der Plasmid­DNA der Klone 2, 3, 5 und 8 mit den Restriktionsenzymen Sac I, Xba I, Spe I, BamH I und Sma I bei allen Klonen ein Restriktionsfragment mit einer Größe von 5 kb auf. Dies zeigt zum einen, daß die Plasmid DNA linear vorliegt, zum anderen, daß in den Inserts keine weitere Schnittstelle für das ent­sprechende Restriktionsenzym vorhanden ist. Nach dem Restriktions­verdau der Plasmid-DNA der Klone 2, 3, 5 und 8 mit dem Restriktionsenzym Pst I treten zwei kleine Restriktionsfragmente mit einer Größe von 0,34 kb und 0, 25 kb auf, wie die Spuren q bis t in Abb.3 zeigen. Dies zeigt, daß nicht nur im Polylinkerbereich des Vektors eine Pst I Schnittstelle vorhanden ist, sondern daß das cDNA-Insert der Klone 2, 3, 5 und 8 noch zwei weitere Schnittstellen für Pst I besitzen muß.

Das Ergebnis des Restriktionsverdaus mit den verschiedenen Restriktionsenzymen Sac I, Xba I, Spe I, BamH I, Pst I, und Sma I demonstriert, daß die Klone 2, 3, 5 und 8 ein identisches Schnittmuster besitzen.

[...]