Molecular characterization and identification of antigen 32-5B6 as enzyme S-Adenosyl-L-Homocystein-Hydrolase from Xenopus laevis oocyte nuclei
Claudia Mohl
Diploma thesis in Biochemistry, Eberhard-Karls-University, Tübingen, 1996
and Max-Planck-Institut for Development Biology, Tübingen
(Title and Abstract in english; Original work in german)
Abstract:
The aim of my diploma thesis work (1996) was molecular characterization and identification of late migrating antigen
32-5B6 on a molecular level. Antigen 32-5B6 is a protein that is distributed in cytoplasm during Blastula stage and transported into oocyte cell nuclei at Gastrula stage 12 during embryonic development of Xenopus laevis (Dreyer et al. 1982; 1983). To isolate cDNA sequences that encode the late migrating antigen
32-5B6, I screened, isolated and sequenced five cDNA clones from placques with positive antibody reaction from a Xenopus laevis ovar lambda zap II cDNA expression library. Sequence analysis showed that two cDNA clones encode the enzyme S-Adenosyl-Homocystein-L-Hydrolase (clone 10) from Xenopus laevis (Seery et al. 1994) and an isoform of this enzyme (clone 8). Molecular weight and IEP of S-Adenosyl-Homocystein-L-Hydrolase are nearly identical with those of antigen 32-5B6. To get further evidence in regard to sequence of antigen 32-5B6, proteins were isolated from original Xenopus laevis oocyte nuclei for protein microsequencing. For this reason I established a new protein purification strategy purifying proteins from original oocyte nuclei of Xenopus laevis proteom by means of anion-exchange chromatography and 2-dimensional gel electrophoresis. By means of western blot analysis I could detect two enzyme isoforms those IEPs lie in range between pH 6.02 - 6.2 and with molecular weights between 46 and 47.7 kDa. Protein microsequencing were performed by Prof. Dr. Klaus Weber and Uwe Plessmann (MPI for Biophysical Chemistry, Göttingen, Germany) and confirmed result of screening of Xenopus laevis ovar lambda zap II cDNA expression library. Eight peptides of different lenght were to 100% identical with protein sequences of enzyme S-Adenosyl-L-Homocystein-Hydrolase from Xenopus laevis (Seery et al. 1994) and peptides derived from cDNA sequences of clone 8 and 10. Following the antigen 32-5B6 is identical with the enzyme S-Adenosyl-Homocystein-L-Hydrolase from Xenopus laevis (Seery et al. 1994) and a new isoform of this enzyme could be identified during this diploma thesis.
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1.1. Der Proteintransport in den Zellkern
1.2. Die Kernlokalisationssequenz
1.3. Modell für den Transport eines Proteins in den Zellkern
1.4. Zeitlich regulierter Kerntransport während der Frühentwicklung
1.5. Aufgabenstellung
2. Ergebnisse
2.1. Screening einer aus Xenopus laevis Ovar stammenden cDNA-Bibliothek
2.2. „in vivo excision“ der pBluescript(-) Plasmide aus dem Lambda Zap II Vektor
2.3. Überprüfung der pBluescript(-)Plasmide auf darin enthaltene cDNA
2.4. Restriktionskartierung der cDNA
2.5. Plasmid-Doppelstrang-Sequenzierung
2.6. Aufreinigung des Antigens 32-5B6 über Anionenaustauscher-Chromatographie
2.7. Die zweidimensionale Gelelektrophorese
2.8. Protein-Mikrosequenzierung
3. Diskussion
4. Zusammenfassung
5. Material und Methoden
5.1. Material
5.1.1. Medien und Lösungen für Bakterien
5.1.2. Lösungen für DNA-Präparationen
5.1.3. Lösungen für Proteinextraktion
5.1.4. Puffer und Lösungen für die Sequenzierungsreaktion
5.1.5. Puffer für Elektrophoresen
5.1.6. Agarplatten
5.1.7. Herstellung von Glycerinkulturen
5.1.8. Herstellung von ÜN-Kulturen
5.1.9. Puffer und Lösungen der zweidimensionalen Gelelektrophorese
5.2. Methoden
5.2.1. Bestimmung des Phagentiters
5.2.2. Antikörperscreening der Xenopus-Ovar-cDNA-Bibliothek
5.2.3. Vereinzelung der Kolonien
5.2.4. „in vivo excision“
5.2.5. Plasmidpräparation nach Quiagen
5.2.6. Behandlung von DNA mit Restriktionsendonukleasen
5.2.7. Agarosegelelektrophorese
5.2.8. DNA-Sequenzierung mit dem A.L.F-express
5.2.9. Zweidimensionale Gelelektrophorese (praktische Durchführung)
5.3. Anionenaustauscherchromatographie über Source Q unter FPLC-Einsatz
5.3.1. Herstellung von Oocyten-Proteinextrakt
5.3.2. Aufreinigung des Antigens 32-5B6 über die Anionenaustauschersäule Source Q unter FPLC-Einsatz
5.3.3. Dot Blot-Analyse des Antigens 32-5B6
Zielsetzung & Themen
Die vorliegende Arbeit zielt auf die molekulare Charakterisierung des Antigen 32-5B6 ab, welches in Oocyten des Krallenfrosches Xenopus laevis vorkommt. Dabei steht die zentrale Forschungsfrage im Mittelpunkt, ob dieses Protein eine spezifische Kernlokalisationssequenz besitzt, die den Transport in den Zellkern während der Embryonalentwicklung steuert.
- Molekulare Charakterisierung des Antigens 32-5B6
- Isolierung und Sequenzierung entsprechender cDNA-Klone
- Protein-Mikrosequenzierung und Abgleich mit Gendatenbanken
- Analyse des Proteintransports und der Kernlokalisationssignale
- Untersuchung der Expression und Funktion im Kontext der frühen Embryonalentwicklung
Auszug aus dem Buch
1.1. Der Proteintransport in den Zellkern
Der Transport der Proteine in den Zellkern erfolgt über den Kernporenkomplex. Dabei handelt es sich um einen energie- und rezeptorabhängigen Prozeß, der äußerst selektiv ist, und sich in zwei Schritten vollzieht: Im ersten erfolgt das Andocken des Substrates an den Kernporenkomplex. Dieser Schritt ist energie- und temperaturunabhängig. Im zweiten Schritt wird das gebundene Substrat durch den Kernporenkomplex geschleust. Der Translokationsschritt ist jedoch temperatur- und energieabhängig. [Newmeyer, 1986; 1988] Voraussetzung für den Transport eines Proteins in den Zellkern ist jedoch, daß das Protein eine Kernlokalisationssequenz besitzt. Sollte ein Protein jedoch keine Kernlokalisationssequenz besitzen, kann es trotzdem in den Zellkern gelangen, indem es von einem Protein mit einer Kernlokalisationssequenz „Hucke-Pack“ genommen wird. Außer dem Vorhandensein eines Rezeptors sind noch mindestens drei weitere cytosolischer Faktoren für den Kerntransport erforderlich: Hsp 70, Ran-GTPase und NTF 2. [Silver, 1991; Melchior, 1995; Görlich, 1996]
Die Kernproteine besitzen keine allgemein übereinstimmende Kernlokalisationssequenz, d.h., eine strikte Consensus-Sequenz ist nicht vorhanden. Trotzdem können für die Kernlokalisationssequenzen folgende Übereinstimmungen festgestellt werden.
Zusammenfassung der Kapitel
1. Einleitung: Dieses Kapitel erläutert den Mechanismus des Proteintransports in den Zellkern sowie die Bedeutung von Kernlokalisationssequenzen und die Aufgabenstellung der Arbeit.
2. Ergebnisse: Hier werden die experimentellen Schritte zur Isolierung, Sequenzierung und Charakterisierung der cDNA sowie die biochemische Aufreinigung und Analyse des Antigens 32-5B6 dargestellt.
3. Diskussion: Das Kapitel vergleicht die gewonnenen Sequenzdaten mit bestehenden Datenbanken und diskutiert die Identität des Antigens 32-5B6 als S-Adenosyl-L-Homocystein-Hydrolase.
4. Zusammenfassung: Eine komprimierte Darstellung der erzielten Ergebnisse, die die Identifizierung des Antigens und die noch offenen Fragen hinsichtlich des Kerntransports zusammenfasst.
5. Material und Methoden: Dieser Abschnitt beschreibt detailliert die verwendeten Chemikalien, Puffer, Medien und die wissenschaftlichen Protokolle für die molekularbiologischen und biochemischen Analysen.
Schlüsselwörter
Xenopus laevis, Antigen 32-5B6, Kernlokalisationssequenz, Proteintransport, cDNA-Bibliothek, S-Adenosyl-L-Homocystein-Hydrolase, Gelelektrophorese, Protein-Mikrosequenzierung, Embryonalentwicklung, DNA-Methylierung, FPLC, Anionenaustauscherchromatographie, Molekularbiologie, Gensequenzierung, Antikörper-Screening.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Diplomarbeit primär?
Die Arbeit befasst sich mit der molekularen Charakterisierung des Antigens 32-5B6 aus Oocytenkernen des Krallenfrosches Xenopus laevis.
Was sind die thematischen Schwerpunkte der Forschung?
Zentrale Themen sind der Proteintransport in den Zellkern, die Sequenzanalyse von cDNA-Klonen und die Identifizierung des untersuchten Proteins im biochemischen Kontext.
Welche Forschungsfrage steht im Zentrum?
Es wird untersucht, ob das Antigen 32-5B6 eine spezifische Kernlokalisationssequenz besitzt, die seine Aufnahme in den Zellkern während der Embryonalentwicklung steuert.
Welche wissenschaftlichen Methoden kommen zum Einsatz?
Verwendet wurden unter anderem cDNA-Bibliotheks-Screening, Plasmid-Sequenzierung, zweidimensionale Gelelektrophorese und Anionenaustauscher-Chromatographie.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Der Hauptteil dokumentiert die Isolierung der cDNA, die Restriktionskartierung, die Sequenzvergleiche mit Gendatenbanken und die Proteinreinigung mittels FPLC.
Welche Begriffe charakterisieren die Arbeit am besten?
Wichtige Begriffe sind Xenopus laevis, Kernlokalisationssequenz, Proteintransport, cDNA-Bibliothek und S-Adenosyl-L-Homocystein-Hydrolase.
Wie wurde die Identität des Antigens 32-5B6 bestätigt?
Die Identität wurde durch den Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz der cDNA-Klone mit Protein-Mikrosequenzierungsdaten sowie den Abgleich mit in der Genbank gelisteten Sequenzen der S-Adenosyl-L-Homocystein-Hydrolase bestätigt.
Welche Rolle spielt die S-Adenosyl-L-Homocystein-Hydrolase in dieser Untersuchung?
Die Analysen legen nahe, dass das Antigen 32-5B6 dieses Enzym oder eine nahe verwandte Variante ist, welche eine wichtige Rolle im Stoffwechsel der Schwefelgruppen-Übertragung spielt.
- Citar trabajo
- Dr.rer.nat. Claudia Mohl (Autor), 1996, Molecular characterization and identification of antigen 32-5B6 as enzyme S-Adenosyl-L-Homocystein-Hydrolase from Xenopus laevis oocyte nuclei , Múnich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/140329
