Mutationsanalyse des hSNF5/INI1-Tumorsuppressorgens in humanen Hepatoblastomen

Inhaltsverzeichnis

Verzeichnis der Abkürzungen

1. Einleitung
1.1 Molekulare Entstehungsmechanismen von Tumoren
1.1.1 Protoonkogene und Onkogene
1.1.2 Tumorsuppressorgene
1.2 Das Hepatoblastom
1.2.1 Definition und Inzidenz des Hepatoblastoms
1.2.2 Genetik des Hepatoblastoms
1.2.3 Histologie des Hepatoblastoms
1.2.4 Klinik und Diagnostik des Hepatoblastoms
1.3 Das hSNF5/INI1 -Gen
1.3.1 Das hSNF5/INI1 -Genprodukt innerhalb des SWI/SNF-Komplex
1.3.2 Das hSNF5/INI1 -Gen als Tumorsuppressorgen
1.3.3 Das hSNF5/INI1 -Gen in verschiedenen humanen Tumoren
1.4 Ziel dieser Arbeit

2. Material und Methoden
2.1 Untersuchungskollektiv
2.1.1 Hepatoblastom-Biopsien
2.1.2 Geräte
2.1.3 Chemikalien
2.2 DNA-Isolierung
2.2.1 Isolierung von genomischer DNA aus Leukozyten
2.2.2 Isolierung von genomischer DNA aus Tumor- und Lebergewebe
2.3 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
2.4 Verwendete Primer-Paare
2.5 Agarose-Gelelektrophorese von DNA
2.6 Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus (SSCP)-Analyse
2.7 Silberfärbung von Polyacrylamidgelen
2.8 Isolierung der aberrant laufenden Banden aus dem SSCP-Gel und Reamplifizierung durch
PCR
2.9 Aufreinigung der PCR-Produkte über Affinitätssäulen
2.10 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren mittels Photo metrie
2.11 Ethanolpräzipitation von Nukleinsäuren
2.12 Sequenzierung

3. Ergebnisse
3.1 Mutationsanalyse des hSNF5/INI1 -Gens
3.2 SSCP-Analyse
3.3 Sequenzierung der PCR-Produkte aus Exon 7 des hSNF5/INI1 - Gens
3.4 Korrelation zur Histologie und Klinik der Patienten

4. Diskussion
4.1 Die Untersuchung des hSNF/INI1- Gens in Hepatoblastomen zeigt keine Mutationen
4.2 Die Bedeutung von hSNF5/INI1 als Tumorsuppressorgen

5. Zusammenfassung

6. Literaturverzeichnis

7. Anhang

Danksagung

Verzeichnis der Abkürzungen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1 Einleitung

1.1 Molekulare Entstehungsmechanismen von Tumoren

Trotz ihrer Verschiedenartigkeit entstehen verschiedene Tumoren offenbar durch recht ähnliche grundlegende Prozesse. Ob sich eine Zelle vermehrt oder nicht, unterliegt dem Einfluß anderer benachbarter Zellen. Tumorzellen dagegen folgen ihrem eigenen Vermehrungsprogramm, wobei Tumore aus bösartigen Zellen im Verlauf ihrer Entwicklung aggressiver werden können. Sie entstehen von einer gemeinsamen Ursprungszelle, die sich der kontrollierten Teilung entzogen hat (Weinberg R.A., 1994). Der Wandel zur Malignität kommt dadurch zustande, daß sich in der Linie einer solchen Zelle Mutationen anhäufen, die bestimmte Klassen von Genen betreffen. Es handelt sich um Protoonkogene, Tumorsuppressorgene oder DNA-Reparaturgene. Protoonkogene fördern das Zellwachstum, Tumorsuppressorgene hemmen es. Zusammen sind diese beiden Klassen für einen Großteil der unkontrollierten Zellvermehrungsprozesse in menschlichen Tumoren verantwortlich. Mutiert ein Protoonkogen in der Regulator- oder in der Strukturregion, kann ein Onkogen entstehen und es zu einer Tumorbegünstigung kommen. Demgegenüber tragen Tumorsuppressorgene zur Tumorentstehung bei, wenn sie durch Mutation inaktiviert werden und so funktionsfähige Suppressor-Proteine ausfallen. Während Onkogene durch eine Mutation ein Plus an Aktivität erhalten, können Tumorsuppressorgene durch eine Mutation an Aktivität (sog. "loss of function") verlieren. Solche Mutationen verhalten sich genetisch rezessiv , d.h. beide Kopien des Gens müssen in der Regel betroffen sein (biallelische Inaktivierung), damit die tumorunterdrückende Wirkung aufgehoben ist (sog. Knudson´sche "two hit" – Theorie; Knudson et al.1985). Knudson entwickelte 1971 diese Theorie, nachdem er familiäre und sporadische Formen des Retinoblastoms eingehend untersucht hatte. Bei der familiären Form dieser Krankheit ist es bereits in der Keimbahn zu einem Funktionsverlust eines Allels gekommen. Dieser hemizygote Zustand alleine reicht noch nicht für den Ausbruch der Krankheit aus. Kommt es aber im weiteren Verlauf zu einer zusätzlichen Mutation im zweiten Allel, kann sich das Retinoblastom ausbilden, da nunmehr beide Allele funktionsuntüchtig sind (biallelische lnaktivierung). In nicht hereditären Fällen ist der Funktionsverlust beider Tumorsuppressorgenkopien die Folge somatischer (also nicht auf Keimbahnebene ablaufender) Mutationen.

Verschiedene Untersuchungen haben gezeigt, daß Tumoren häufig einen mehrstufigen Prozeß durchlaufen, der sich aus Tumorinitiation, Promotion, Progression und in einigen Tumoren der Metastasierung zusammensetzt. Ein solches Stufenmodell ist 1990 von Fearon und Vogelstein am Beispiel von Dickdarmkarzinomen beschrieben worden. Hier wird die Erkrankung durch das Auftreten von Mutationen und der Inaktivierung des APC (Adenomatosis Polyposis Coli)-Gens initiiert. In mehr als 85% der sporadisch auftretenden kolorektalen Karzinome ist dieses mutiert.

1.1.1 Protoonkogene und Onkogene

Protoonkogene kodieren für Proteine, die Zellen zur Vermehrung anregen. Dies können z.B. Rezeptorproteine auf der Zelloberfläche sein, die Wachstumsfaktoren binden und die Signale ins Zellinnere weiterleiten. Durch andere Protoonkogenprodukte wird die Weiterleitung der Signale innerhalb der Zelle bewerkstelligt. Wieder andere wirken im Zellkern und steuern den Zellzyklus. Mutationen können die nützlichen Protoonkogene in entartete Onkogene verwandeln. Die Entartung kann auch durch Translokation eines Allels hervorgerufen werden, und sie kann auch in Gegenwart des zweiten, normalen Allels wirksam werden (dominante Onkogene). Die Onkogenprodukte können gemäß ihrer zellulären Funktion unterteilt werden in Wachstumsfaktor-Rezeptoren (die wichtigste Gruppe sind die Protein-Tyrosin-Kinasen), die signalübertragenden Proteine bzw. ihre Gene, die im Zytoplasma wirksam sind und schließlich Gene für die Transkriptionsregulatoren. Onkogene für Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren sind zum Beispiel PDGF, erb-B, erb-B2 und RET, solche für cytoplasmatische Übermittlerproteine innerhalb stimulatorischer Signalwege sind das Ki-ras und das N-ras. Onkogene für Transkriptionsfaktoren, die wachstumsfördernde Gene aktivieren sind c-myc, N-myc und L-myc, dagegen codieren Bcl-2, Bcl-1 und MDM2 für andere Proteine.

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Tab. 1 Ausgewählte Onkogene ( in der Literatur gebräuchliche Abkürzungen der Gene ) und die

dazugehörigen Genfunktionen mit Angabe der Auswirkung auf entsprechende Organe.

1.1.2 Tumorsuppressorgene

Die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen hat für die Entstehung von Tumoren eine ebenso große Bedeutung wie die Aktivierung von Onkogenen. Im Gegensatz zu den Onkogenen kodieren sie für Proteine, die die Zellvermehrung hemmen. Mutationen solcher Gene sind rezessiv, d.h. sie haben nur dann funktionell Konsequenzen, wenn beide Allele geschädigt sind. Als Beispiel eines häufig in sporadischen Tumoren veränderten Tumorsuppressorgens ist das TP53 -Gen zu nennen, welches ein 53 kb großes nukleäres Protein kodiert, das die Zellproliferation unterdrückt und an der Zelldifferenzierung teilnimmt. TP53 findet sich nicht nur in sporadischen Tumoren häufig inaktiviert, sondern ist auch anlagebedingt bei Patienten mit Li-Fraumeni-Tumor-Prädispositions-Syndrom mutiert.

Von zahlreichen anderen Tumorsuppressorgene sind u.a. das WT1, APC, DCC, NF1, NF2 und MEN2A gut charakterisiert. Tumorsuppressorgene für cytoplasmatische Proteine sind APC, DPC4, NF-1 und NF-2, solche für Proteine im Zellkern sind MTS1, RB1 und WT1. Weitere Tumorsuppressorgene sind BRCA1, BRCA2 sowie VHL.

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Tab. 2 Ausgewählte Tumorsuppressorgene (in der Literatur gebräuchliche Abkürzungen der

Gene) und die dazugehörigen Genfunktionen mit Angabe der Auswirkung auf entsprechende

Organe.

1.2 Das Hepatoblastom

1.2.1 Definition und Inzidenz des Hepatoblastoms

Das Hepatoblastom ist der häufigste maligne Lebertumor des Kindesalters. Die Inzidenz beträgt 0,6-1 auf 1.000.000 Kinder, der Anteil an allen malignen Tumoren des Kindesalters beträgt 0,8 – 1,0%. Jungen erkranken etwa 1,5 mal häufiger als Mädchen (Weinberg et al., 1983). Der Altersgipfel liegt zwischen 6 Monaten und 3 Jahren (Ishak et al., 1967). Das Hepatoblastom findet sich selten extrahepatisch, Lymphknoten und Fernmetastasen treten meist erst bei fortgeschrittener Tumorerkrankung auf. Das Hepatoblastom ist wegen des unterschiedlichen biologischen Verhaltens und der damit verbundenen anderen Therapiemöglichkeiten streng vom hepatozellulären Karzinom zu trennen (Ishak und Glunz, 1967; von Schweinitz et al, 1997). Die meisten Hepatoblastome treten sporadisch auf. Assoziationen mit angeborenen Syndromen, wie z.B. dem Beckwith-Wiedemann-Syndrom konnten festgestellt werden (Byrne et al.,1993). Ebenso zeigten Patienten mit der familiären Polyposis coli (Hughes et al., 1994) und der von Gierke´schen Krankheit eine erhöhte Inzidenz für die Entwicklung von Hepatoblastomen (Davit-Spraul et al., 1994). Ein Zusammenhang zwischen Frühgeburtlichkeit und der Entwicklung von Hepatoblastomen wurde gefunden (Ikeda et al. 1997).

1.2.2 Genetik des Hepatoblastoms

Hepatoblastome gehören wie Wilms´ Tumore und Rhabdomyosarkome zu den embryonalen Tumoren und stellen die häufigsten primär malignen Tumore der Leber im Kindesalter dar. Über die Ursachen für ihre Entstehung ist bisher wenig bekannt. Eine Reihe von Kandidatengenen wurde im Laufe der letzten Jahre, auch durch Untersuchungen an anderen Tumorentitäten, identifiziert und deren Status in Hepatoblastomen analysiert. Zu diesen Genen gehören unter anderem Komponenten von Signaltransduktionswegen wie z.B. cyclin D1 und cdk4, welche in über 75 % dieser Tumore überexprimiert gefunden wurden (Kim et al., 1998). Neben überexprimierten Genen finden sich auch andere Regulationsmechanismen wie z.B. beim Gen H19, das monoallelische Expression zeigt, und dessen Expression vermindert ist (Fukuzawa et al., 1999). In zytogenetischen Studien konnten in 5 von 6 untersuchten Fällen Trisomien der Chromosomen 2 und 20 demonstriert werden (Sainiti et al., 1998). In einer weiteren Untersuchungsreihe, bestehend aus 28 Hepatoblastomen, wurde in 44% der Fälle eine Trisomie des Chromosoms 20 entdeckt. Dies scheint die häufigste zytogenetische Veränderung in Hepatoblastomen darzustellen. Diese Veränderungen spiegeln offenbar einen Mehrschritt-Prozess wieder, in dessen Verlauf auch Trisomien der Chromosomen 2, 8 und 20 eine Rolle spielen. Schneider et al. haben darüberhinaus in vier untersuchten Hepatoblastomen eine wiederkehrende partielle Trisomie des Chromosoms 1q gefunden. Dabei wurde eine Translokation der Chromosomenregion 1q zur distalen Region des Chromosoms 4q identifiziert. Sie vermuten, daß hierdurch eine Onkogen-Aktivierung induziert wird oder ein Tumorsuppressor-Gen in der distalen Region des Chromosoms 4q inaktiviert wird. Während bislang kein Tumorsuppressor- oder Onkogen-Kandidat dieser chromosomalen Region zugeordnet werden konnte, sind mehrere interessante Gene, die im zellulären Wachstum und Regulation eine Rolle spielen, auf dem Chromosom 4q lokalisiert (z.B. Interferon Regulatory Factor 2, Guanylatcyclase 1, Electron Factor Flavoprotein). Eine direkte Involvierung dieser Gene konnte bislang nicht gezeigt werden und der Bruchpunkt der Translokation ist noch nicht kloniert (Schneider et al. 1997)­.

Die erhöhte Inzidenz von Hepatoblastomen bei der FAP führte zur Untersuchung sporadisch auftretender Hepatoblastome bezüglich Veränderungen im APC -und b-Catenin -Gen, da das b-Catenin mit dem APC-Gen interagiert. APC kodiert für einen zentralen Bestandteil eines Signaltransduktionswegs, dem sogenannten WNT- Signalweg, in dem b-Catenin eine entscheidende Komponente darstellt. In 48% der Fälle zeigte die Mutationsanalyse des b-Catenin -Gens in Hepatoblastomen aktivierende Mutationen. Die hohe Inzidenz von Mutationen legt den Schluß nahe, daß einer Überaktivierung von b-Catenin eine wesentliche Rolle bei der Entstehung des Hepatoblastoms zukommt (Koch et al.1999). Desweiteren konnten Wei et al. in 67% (2000), und Jeng et al. in 89% (2000) der Fälle Mutationen im b-Catenin -Gen bei Hepatoblastomen nachweisen. Diese Studien führten zu der Annahme, daß Veränderungen im APC/b-Catenin-Signalweg zur Pathogenese von Hepatoblastomen beitragen.

Mittels LOH-Analysen konnten auf Chromosom 1 (Kraus et al., 1996) und 11p (Koufos et al., 1985; Byrne et al., 1993) Allelverluste beschrieben werden. Bei einem Drittel wurde ein Fragment-Verlust des kurzen Arms von Chromosom 11 mit einer überlappenden Region bei 11p15.5 von unterschiedlicher Größe beschrieben. Hierbei ging immer das mütterliche Allel verloren (Albrecht et al., 1994). Anhand dieser Ergebnisse kam man zu dem Schluß, daß in dieser chromosomalen Region ein monoallelisch exprimiertes Tumorsuppressorgen ausgeschaltet wird. Diese betroffene Region auf Chromosom 11p15 zeigt genomisches Imprinting und enthält verschiedene Tumorsuppressorgene, insbesondere H19, p57KIP2 und das wachstumsfördernde Gen IGF2 (das Insulin-like-growth-factor 2-Gen). Sie zeigt nicht nur in kindlichen embryonalen Tumoren, sondern auch in häufigen Tumoren des Erwachsenenalters wie Mamma-, Lunge-, Ovar-, Hoden-, Leber-, Magen-Karzinomen sowie Astrozytomen, Allelverluste (Schwienbacher et al.1998).

In einem Kollektiv von 56 Hepatoblastomen und 5 Hepatoblastomzellinien konnte desweiteren keine Mutation im p57KIP2 (KIP2) gefunden werden, was gegen die Rolle eines Hepatoblastom-assoziierten Tumorsuppressorgens spricht (Hartmann et al., 2000).

1.2.3 Histologie des Hepatoblastoms

Das Hepatoblastom ist ein maligner, embryonaler Lebertumor, der entweder aus einer rein epithelialen oder aus einer zusätzlichen mesenchymalen Komponente aufgebaut ist. Dabei gleichen die epithelialen Zellelemente primitiven Leberparenchymzellen. An mesenchymalen Strukturen können sich fibröse Areale, Knorpel, osteoidähnliche Herde, selten auch glatte Muskulatur, rhabdomyoblastenartige Elemente oder melaninhaltige Zellen finden. Die epitheliale Komponente initiiert unreife Leberzellen während der Embryonal- oder Fetalzeit. Je nach Zusammensetzung der epithelialen Komponente entspricht diese einer embryonalen, fetalen oder gemischt embryonal-fetalen Differenzierung. Beim embryonalen Typ besteht die epitheliale Komponente aus kleinen epithelialen Zellen, die rosetten- und strangförmig angeordnet sind. Eine bessere Differenzierung weist die epitheliale Komponente des fetalen Typs auf. Zwischen den Tumortrabekeln kann man oft typische Blutbildungsherde erkennen. Makroskopisch ist der Tumor oft sehr groß, gut abgegrenzt und auf der Schnittfläche von Blutungen und Nekrosen durchsetzt. Selten liegt ein sogenanntes anaplastisches Hepatoblastom vor, welches aus undifferenzierten Zellen besteht .

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Abb. 1 Hepatoblastom mit typischen epithelialen Zellelementen und zentral gelegenen mesen-chymalen Komponenten (fibröse Areale, Knorpel, osteoidähnliche Herde) im mikroskopischen Bild.

1.2.4 Klinik und Diagnostik des Hepatoblastoms

Zu den Leitsymptomen des Hepatoblastoms zählen Fieber, eine Störung des Eß- und Trinkverhaltens, Pubertas praecox und Thrombozytose. Seltener wird von Übelkeit oder Ikterus berichtet. Der Tumor breitet sich häufig lokal aus und metastasiert in die Lunge. Dagegen ist eine Knochen- oder Lymphknotenmetastasierung eher selten. Der rechte Leberlappen ist häufiger betroffen als der linke. In über 50% der Fälle sind sowohl rechter als auch linker Leberlappen betroffen. Spezifische Tumormarker sind das alpha-Fetoprotein (erhöht in 90-95 % der Fälle), beta-HCG (erhöht in 20 % der Fälle) sowie erhöhte Transaminasen und Bilirubin (20 % der Fälle). Eine histopathologische Diagnose wird aus Tumorresektat oder Biopsie gestellt. Die Prognose ist von der Resektabilität und dem Vorhandensein von Fernmetastasen abhängig (von Schweinitz et al., 1997; Bhattacharya et al., 1998 ; Herzog et al., 2000).

Nach neueren Erfahrungen haben Kinder zwischen 6 Monaten und 3 Jahren mit einem Serum-alpha-Fetoprotein über 1.000 ng/ml immer ein Hepatoblastom, so daß in dieser Situation auf eine bioptische Sicherung der Diagnose verzichtet werden kann, insbesondere wenn die unspezifische Labordiagnostik (Thrombozyten, Ferritin, LDH, Leberenzyme) entsprechend pathologische Werte ergeben hat (Jung et al., 2001).

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Abb.2 CT-Bilder eines 22 Monate alten Mädchens mit bilobärem Hepatoblastom im klinischen Verlauf von 3 Monaten unter Chemotherapie. Darunter Abnahme der mit einem Pfeil gekennzeichneten Tumormasse (The Oncologist; 5:445,2000).

1.3 Das hSNF5/INI1 -Gen

1.3.1 Das hSNF5/INI1 -Genprodukt innerhalb des SWI/SNF-Komplex

Das hSNF5/INI1 -Gen (human Sucrose Non Fermenting/lntegrase Interactor 1 ) kodiert einen 385 Aminosäuren langen Bestandteil des menschlichen SWI/SNF-Komplexes, welcher nach gegenwärtigem Wissensstand mindestens 9-12 Proteine umfaßt (Wang et al., 1996a). Es befindet sich in der Chromosomen-Region 22q11.2, besteht aus neun Exonen und umfasst 50 Kilobasen (Versteege et al., 1998). Da die Anordnung von eukaryotischer DNA in Nukleosomen Transkription, Replikation und Reparatur erschweren, sind sowohl Chromatin-Umbaukomplexe, wie der SWI/SNF-Komplex, als auch Prozesse wie Histon-Acetylierung an der Genaktivierung beteiligt (Biegel et al. 1999). Der SWI/SNF5-Komplex ist ein Chromatin-Umbaukomplex, der in einem ATP-abhängigen Prozess durch Veränderung der Histon-DNA-Bindung die Konformation von Nukleosomen verändert. Dadurch können der hemmende Einfluss der Nukleosomen antagonisiert und der Zugang von Transkriptionsfaktoren erleichtert werden. Der SWI/SNF-Komplex ist aus zwei Bestandteilen mit mehreren Untereinheiten aufgebaut. Beide teilen die meisten Komponenten, unterscheiden sich aber durch ihre SWI2/SNF2-gebundene ATPase/Helicase-abhängige katalytische Untereinheit, welche zum einen als Brm (SNF2a) oder Brg1 (SNF2ß) auftritt (Wang et al., 1996b). Der Säugetier-SWI/SNF-Komplex ist etwa zwei Megadalton groß und besteht insgesamt aus elf Untereinheiten, wovon bislang acht identifiziert werden konnten: SWIl/ADR6, SWI2/SNF2, SWI3, SNF5, SNF6, SNFll, TFG3/ANCl, SWP73 (Kadonaga, 1998a). Das Molekulargewicht von SNF5 beträgt 47 Kilodalton (Wang et al., 1996c). Dieser Komplex, der anfangs als ein Co-Faktor für Kernrezeptoren beschrieben wurde, ist vor kurzem mit der Steuerung des Zellwachstums in Zusammenhang gebracht worden. Wie der SWI/SNF-Komplex an einen spezifischen Chromosomenort dirigiert wird und welche Untereinheit des Komplexes mit den Transkriptionsfaktoren interagiert, ist bislang unklar. Es konnte ein Zusammenhang zwischen dem SWI/SNF-Komplex und dem RNA-Polymerase-II-Holoenzym nachgewiesen werden, wobei der Komplex als Komponente des RNA-Holoenzyms gefunden wurde. Man vermutet, daß das SWI/SNF beinhaltende RNA-Holoenzym die Bindung der sequenzspezifischen Transkriptionsfaktoren am Promoter ermöglicht (Kadonaga, 1998b).

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Abb.3 Zusammenspiel von SWI/SNF-Komplex (mit der Untereinheit hSNF5/INI1) und Transkriptionsfaktoren. Dadurch erfolgt eine Einwirkung auf die Histon-DNA-Bindung.

Wie eine Vielzahl von Studien belegen, geht das SNF5/INI1-Protein mit anderen DNA-bindenden Proteinen Wechselwirkungen ein: Im Rahmen von Untersuchungen an der HIV-Integrase isolierte man das menschliche Homolog des Hefe-Transkriptionsfaktors SNF5 (genannt hSNF) und nannte ihn INI1. INI1 (Integrase Interactor 1) ist ein Protein, das mit HIV-1-Integrase interagiert und dieser Beobachtung seinen Namen verdankt (Kalpana et al., 1994). Es wurde beschrieben, dass INI1 die Integration retroviraler RNA in das Genom der Wirtszelle und damit HIV-1 Partikel-Produktion und -Nachbildung begünstigt, indem es als ,,host-Protein’’ HIV-1-Integrase bindet. Mutationen im INI1 -Gen heben diese Wirkung auf. Diese Beobachtungen zeigen, dass INI1 für die HIV-1 Nachbildung wichtig ist und liefern damit mögliche Ansätze neuer Strategien für die Entwicklung von Virostatika. Offenbar triggern retrovirale Präintegrationskomplexe den zytoplasmatischen Export von INIl (Turelli et al., 2001).

In einer anderen Studie wurde durch die Beobachtungen von in-vitro DNA-Replikation und Immunprezipitation bestätigt, dass das Protein E1 im humanen Papillomavirus (HPV) direkt mit hSNF5/INI1 interagiert und so auf dessen DNA-Replikation Einfluss nimmt: Die Zugabe von hSNF5/INI1 stimulierte die in-vitro HPV-DNA-Replikation, Entzug reduzierte sie. Inwieweit hier hSNF5/INI1 allein die Replikation dirigiert oder noch andere Faktoren eine Rolle spielen, bleibt ungeklärt. Innerhalb des SWI/SNF-Komplexes übt hSNF5/INI1 scheinbar einen sehr bestimmenden Einfluss auf das Ausmass der HPV-DNA-Replikation aus (Lee et al.,1999).

Das ALL-1 -Gen wurde aufgrund seiner Beteiligung an menschlicher akuter Leukämie entdeckt. Sein Drosophila-Homologon ist das Trithorax (TRX)-Gen, ein Mitglied der TRX-Polycomb-Genfamilie. Beiden Genen gemeinsam ist die Aktivierung der Expression sogenannter ‚,homeotischer’’ (HOM)-Gene. Diese Gene sind für die korrekte Ausbildung von Elementen innerhalb einzelner schon angelegter Bereiche während der embryonalen Entwicklung zuständig. In Hefekulturen mit kultivierten Zellen transgener Fliegen konnte man die Interaktion zwischen einer bestimmten Domäne (genannt SET -Domäne) von ALL-1 und dem hSNF5/INI1 - Protein beobachten. Sowohl das TRX-, als auch das ALL-1 Protein interagieren dabei mit der jeweiligen Variante des INI1-Proteins. Studien über das hSNF5/INI1 -Drosophila-Korrelat [ SNR1 ] zeigten, dass es in hohem Maße während der frühen Embryogenese und in der späteren Entwicklung im ZNS exprimiert wird (Dingwall et al. 1995; Rosenblatt-Rosen et al., 1998a). Roberts et al. (2000) gelang es, ein Mausmodell für Untersuchungen des hSNF5/INI1 -Gens zu entwickeln. Sie konnten zeigen, dass SNF5 während der gesamten Embryonalphase v.a. im ersten Schlundbogen und im ZNS exprimiert wird. Humanes und murines SNF5 sind identisch in 384 von 385 Aminosäuren. Knockout-Mäuse sterben am 7. Tag der Embryogenese, wenn sie für das hSNF5/INI1 -Gen homozygot sind. Heterozygote Knockout-­Mäuse sind zwar lebensfähig, entwickeln aber zum Teil schon ab der 5. Lebenswoche Tumoren, die MRTs beim Menschen stark ähnlich sind (Roberts et al., 2000). Eine Variante der akuten Leukämie wird durch chromosomale Aberrationen im ALL-1 -Gen hervorgerufen. Bei Menschen führt insbesondere eine reziproke Translokation von ALL-1 mit einer Vielzahl anderer Komponenten zu einem chimerisch verschmolzenen Eiweiß, welches besonders häufig bei akuter Leukämie von Säuglingen nachweisbar ist. Allerdings ist die Rolle der INI1-ALL-1-Interaktion und deren genaue Initiierung und Auswirkung auf die Erkrankung noch weitestgehend unbekannt (Rosenbratt-Rosen et al., 1998b).

In etwa 90% der Fälle chronisch myeloischer Leukämie (CML) liegt eine reziproke Translokation des cABL Protoonkogens (paternales Chromosom 9q34) und der BCR (breakpoint cluster region/maternales Chromosom 22q11) vor. Grand et al. (1999) konnten demonstrieren, dass die Region 22q11, auf der das hSNF5/INI1- Tumorsuppressorgen liegt, unterhalb des BCR-ABL -Fusionsgens häufig bei Patienten mit CML inaktiviert ist. Zwar wurden hier keine funktionell wirksamen Mutationen identifiziert, man fand aber eine große Zahl heterozygoter Deletionen im hSNF5/INI1 -Gen. Die Deletionen von 22q11 waren hier auf dem 9q+ Chromosom der Patienten mit CML lokalisiert. Dies war bei 5 von 21 Patienten (24 %) während der chronischen Phase des klinischen Verlaufs der CML und bei 9 von 25 Patienten (36 %) in der akzelerierten Phase der Fall. Scheinbar ist die Inaktivierung des hSNF5/INI1- Gens häufig in Patienten mit CML zu finden. Eine damit verbundene Veränderung der Chromatin-vermittelten transkriptionalen Kontrolle durch den SWI/SNF-Komplex könnte demnach zur Leukämogenese beitragen. Alternativ wäre es denkbar, dass diese Deletionen auch ein anderes bislang unbekanntes Gen in der Region 22q11 beeinflussen, welches eine Rolle in der Pathogenese der CML spielen könnte (Grand et al., 1999). Die Suche nach INI1-interagierenden Proteinen führte zur Isolierung von c-MYC, einem Transaktivator. Es zeigte sich, daß der SWI/SNF-Komplex für c-MYC vermittelte Transaktivation notwendig ist und daß die c-MYC-INI1-Interaktion hilft, den SWI/SNF-Komplex zu rekrutieren. Zu den Aufgaben der Mitglieder der c-MYC-Gruppe zählen sowohl die Kontrolle von Zellwachstum und Zellentwicklung als auch die Regulation von Transformation, Differenzierung und Apoptose (Cheng et al., 1999). Bei der Untersuchung der Funktion des SWI/SNF-Komplex stellte man im Experiment an murinen embryonalen Stammzellen fest, daß die Inaktivierung des hSNF5/INI1- Gens durch Ersatz von Exon 1 und Exon 2 durch ein lac Z-Reportergen einen Entwicklungsstillstand bewirkt. Dieses Ergebnis zeigte, daß der SWI/SNF-Komplex für die frühe Entwicklung und Lebensfähigkeit von früh-embryonalen Zellen sehr wichtig ist. Desweiteren entwickelten diese Mäuse Tumore im ZNS und Sarkome, ein mögliches Indiz für die Rolle des hSNF5/INI1- Gen als Tumorsuppressorgen (Klochendler-Yeivin et al., 2000).

1.3.2 Das hSNF5/INI1 -Gen als Tumorsuppressorgen

Maligne Rhabdoidtumoren (MRT) besitzen drei klinisch-pathologische Merkmale: junges Alter des Betroffenen (im Allgemeinen zwischen Geburt und 2 Jahren), ein typisches histologisches und immunhistochemisches Muster sowie ein aggressiver infiltrativer Charakter (Ogino et al., 2000). Weniger als 25% der Säuglinge und jungen Kinder mit Rhabdoidtumoren überleben (Forth et al., 1994). Zytogenetische und molekulargenetische Untersuchungen von MRTs zeigten häufig Monosomie von Chromosom 22 und Deletionen der Chromosomenregion 22q11.2, was auf ein Tumorsuppressorgen in dieser Region hindeutete (Douglass et al., 1990; Sashi et al., 1994; Fort et al., 1994; Biegel et al., 1996).

Für Rhabdoidtumore konnten folgende genetische Ursachen ausgemacht werden: Eine Translokation t(12;15) und Mutationen im hSNF5/INI1- Tumorsuppressorgen (Bennicelli et al., 1999). Rhabdoidtumore kommen renal und extrarenal im ZNS als atypische Teratoid-Tumore (AT/RTs) vor (Rorke et al., 1996).

Die Analyse von dreizehn MRT-Zelllinien konnte zeigen, dass die chromosomale Verlustregion in den Bereich des hSNF5/INI1- Gens fällt. In 12 von 13 Rhabdoidtumor-Zellinien waren beide Allele betroffen, was die Hypothese des hSNF5/INI- Gens als ein neues Tumorsuppressorgen unterstützt (Versteege et al., 1998) . Das Kriterium der Knudson-2-Treffer-Theorie für Tumorsuppressorgene ist somit erfüllt. Das hSNF5/INI1- Gen stellt demnach ein Rhabdoidtumorsuppressorgen dar. Untersuchungen an atypischen Teratoid-Tumoren (AT/RTs), eine den MRTs ähnliche Tumorentität des ZNS und malignen Rhabdoid-Tumoren der Niere zeigten Deletionen oder Translokationen, die die Region 11.2 des langen Arms von Chromosom 22q betrafen (Rosty et al., 1998, Sawyer et al., 1998). Studien an 29 AT/RTs zeigten bei allen Tumoren Mutationen oder homozygote Deletionen des hSNF5/INII- Gens, wobei allein auf Exon 1 zehn der fünfzehn homozygoten Deletionen entfielen (Biegel et al., 1999).

Bei der Untersuchung von fünf Rhabdoidtumorzelllinien konnte in keiner der Zelllinien das hSNF5/INI1 -Protein gefunden werden. Alle Proben mit fehlendem Genprodukt wiesen eine Mutation oder Deletion im hSNF5/INI1 - Gen auf (De Cristofaro et al., 1999). Mitotische Rekombination im proximalen Teil von Chromosom 22q und homozygote Deletion wurden in einer Untersuchung an zwölf Zelllinien als Hauptmechanismen der Inaktivierung des hSNF5/INII- Gens bei Rhabdoidtumoren identifiziert (Rousseau-Merck et al., 1999).

Das Vorhandensein von Veränderungen im hSNF5/INI1 -Gen definiert also Rhabdoidtumoren, möglicherweise aber auch seltene andere Tumoren der Kindheit. Diese Vermutung wurde durch die Beobachtung an drei Familienstammbäumen mit gehäuft auftretenden histopathologisch verschiedenen Neoplasien verstärkt: Hier konnte bei allen der an einem Tumor erkrankten Familienangehörigen eine konstitutionelle hSNF5/INI1- Mutation gefunden werden. Der Begriff "Rhabdoid Predisposition Syndrome" wurde zur Beschreibung dieses Befundes zum einen gewählt, um den Zusammenhang der mit der hSNF5/INI1- Mutation in allen Tumoren zu verdeutlichen und zum anderen, um damit ein neu entdecktes Tumorprädispositionssyndrom zu benennen (Sevenet et al.1999).

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