Untersuchung der Bildung von 4-Hydroxyvaleriansäure innerhalb des Lävulinsäuremetabolismus von "Ralstonia eutropha"

INHALTSVERZEICHNIS

1. Einleitung
1.1 Das Bakterium Ralstonia eutropha
1.2 Bildung, Vorkommen und industrielle Bedeutung von Polyhydroxyfettsäuren (PHF)
1.3 Der Lävulinsäurestoffwechsel in Ralstonia eutropha
1.4 Zielsetzung dieser Arbeit

2. Material und Methoden
2.1 Organismen und Plasmide
2.2 Nährmedien
2.2.1 Mineralmedium (SCHLEGEL ET AL., 1961)
2.2.2 Spurenelementlösung SL6 (PFENNIG, 1974)
2.2.3 NB-Medium (SAMBROOK ET AL., 1989)
2.2.4 Luria-Bertani (LB)-Medium (SAMBROOK ET AL., 1989)
2.2.5 X-Gal-Medium (SAMBROOK ET AL., 1989)
2.2.6 M9-Medium (SAMBROOK ET AL., 1989)
2.2.7 Antibiotika
2.3 Herstellung von Substraten
2.3.1 Synthese von 4-Hydroxyvaleriansäure
2.3.2 Synthese von Acyl-Coenzym-A-Thioestern
2.3.2.1 Synthese von Lävulinyl-CoA (KAWAGUCHI ET AL., 1981)
2.3.2.2 Synthese von 4-Hydroxyvaleryl-CoA
2.3.2.3 Nachweis der Acyl-CoA-Synthese (PULLMANN, 1973)
2.4 Stammkonservierung und Reinheitskontrolle
2.5 Zellanzucht
2.5.1 Wachstumsbedingungen und Zellernte
2.5.2 Wachstumsparameter
2.6 Herstellung von Rohextrakten
2.7 Reinigung der Butyratkinase und der Phosphotransbutyrylase aus E. coli pJC7 (LIU UND STEINBÜCHEL, 2000)
2.8 Proteinbestimmung (BRADFORD, 1976)
2.9 Photometrische Bestimmung von Enzymaktivitäten
2.9.1 Lävulinyl-CoA-Reduktase
2.9.2 Lävulinyl-CoA-Transferase
2.9.3 Butyratkinase
2.9.4 Phosphotransbutyrylase
2.10 Gaschromatographie
2.10.1 Veresterung mit Methanol/Schwefelsäure
2.10.2 Analyse mittels Gaschromatographie
2.11 Denaturierende, diskontinuierliche SDS-PAGE (LAEMMLI, 1970)
2.11.1 Unspezifische Proteinfärbung mit Coomassie Brilliant Blue in Polyacrylamidgelen (WEBER und OSBORN, 1969)
2.12 Zweidimensionale Proteinelektrophorese mit immobilisiertem pH- Gradienten (CORBETT, 1994, HANNA ET AL., 2000)
2.12.1 Zellanzucht
2.12.2 Zellernte
2.12.3 Zellaufschluß und Proteinfällung
2.12.4 Vorbereitung der Proben für die isoelektrische Fokussierung
2.12.5 Quellen der isoelektrischen Fokussierungsstreifen
2.12.6 Isoelektrische Fokussierung (1. Dimension)
2.12.7 Denaturierende SDS-PAGE (2. Dimension)
2.12.8 Kolloidale Coomassie-Färbung (NEUHOFF ET AL., 1985)
2.12.9 Analyse von Proteinproben
2.13 Gel-Elektrophoresen zur Trennung von DNA-Fragmenten
2.13.1 Agarosegel-Elektrophorese (AGE)
2.13.2 Polyacrylamidgel-Elektrophorese für die nichtradioaktive DNA- Sequenzierung
2.14 Isolierung von DNA
2.14.1 Schnelle Präparation von Gesamt-DNA
2.14.2 Isolierung von Gesamt-DNA (MARMUR, 1961)
2.14.3 Isolierung von Plasmid-DNA (BIRNBOIM & DOLY, 1979)
2.14.4 Isolierung von Plasmid-DNA für die Sequenzierung
2.14.5 Isolierung von DNA-Fragmenten durch Adsorption an "Glasmilch" (VOGELSTEIN & GILLESPIE, 1979)
2.15 Reinigung und Konzentrierung von DNA
2.15.1 Extraktion mit Phenol/Chloroform
2.15.2 Ethanol-Präzipitation
2.15.3 Filterblatt-Dialyse
2.16 Aufarbeitung von DNA
2.16.1 Verdauung von DNA durch Restriktionsendonucleasen
2.16.2 Ligation von DNA-Fragmenten
2.17 Analyse von DNA-Präparationen
2.17.1 Konzentrationsbestimmung von DNA
2.17.2 Größenbestimmung von DNA-Fragmenten
2.18 Transfer von DNA
2.18.1 Herstellung und Konservierung dauerhaft kompetenter Zellen (HANAHAN, 1983)
2.18.2 Herstellung kompetenter Zellen von E. coli durch die CaCl2-Methode (SAMBROOK ET AL., 1989)
2.18.3 Transformation von E. coli-Zellen
2.18.4 Konjugation („Spotmating“) (FRIEDRICH ET AL. 1981)
2.19 Polymerasekettenreaktion (PCR)
2.20 DNA-Sequenzierung
2.20.1 Sequenzier-Reaktion
2.20.2 Auswertung der Sequenzdaten
2.21 Chemikalien, Biochemikalien und Enzyme

3. Ergebnisse
3.1 Amplifizierung und Klonierung des ler-Gens
3.2 Heterologe Expression von ler
3.3 Konstruktion einer „Knock-out“-Mutante von R. eutropha HF39 im ler- Gen
3.4 Phänotypische Charakterisierung der ler-Deletionsmutante
3.5 Analyse des Proteinmusters von R. eutropha HF39 nach Disruption des ler-Gens
3.6 Synthese von Lävulinyl-CoA und 4-Hydroxyvaleryl-CoA
3.7 Enzymtests
3.7.1 In-vitro-Test: Reduktion von Lävulinsäure zu 4-Hydroxyvalerat bzw. Lävulinyl-CoA zu 4-Hydroxyvaleryl-CoA durch Rohextrakte von E. coli XL1- Blue (pBluescript SK-/ler) und R. eutropha HF39
3.7.1.1 Bestimmung der Enzymaktivität von Ler mit Lävulinsäure und NADH+H+ bzw. NADPH+H+ als Cofaktoren im Rohextrakt von E. coli XL1- Blue (pBluescript SK-/ler)
3.7.1.2 Bestimmung der Enzymaktivität von Ler mit Lävulinyl-CoA und NADH+H+ bzw. NADPH+H+ als Cofaktoren im Rohextrakt von E. coli XL1- Blue (pBluescript SK-/ler)
3.7.1.3 Bestimmung von Lävulinsäure-/Lävulinyl-CoA-Reduktaseaktivität im Rohextrakt von R. eutropha HF39
3.7.2 Nachweis der 4HV-CoA-Bildung mittels Gaschromatographie (GC)
3.7.3 Synthese von Lävulinyl-CoA durch Rohextrakt von R. eutropha HF39
3.8 Quantifizierung des 4-HV-Umsatzes durch Mutanten von R. eutropha HF39
3.9 Identifizierung Lävulinat-induzierter Enzyme mittels zweidimensionaler (2-D-) Gelelektrophorese
3.9.1 Präparation von 2-D-Gelen
3.9.2 Analyse Lävulinat-spezifischer Proteine
3.9.3 Analyse 4-HV-spezifischer Proteine
3.9.4 Zeitliche Änderung des Proteinmusters von R.xeutropha-Rohextrakten nach Induktion mit Lävulinsäure

4. Diskussion
4.1 Amplifizierung, Klonierung und heterologe Expression des ler-Gens
4.2 Konstruktion einer „Knock-out“-Mutante von R. eutropha HF39 im ler- Gen
4.3 Phänotypische Charakterisierung der ler-Deletionsmutanten
4.4 Synthese von Lävulinyl-CoA bzw. 4HV-CoA
4.5 In-vitro-Test: Reduktion von LA zu 4HV bzw. LA-CoA zu 4HV-CoA durch Rohextrakte von E. coli XL1-Blue (pBluescriptxSK-/ler) und R.xeutropha HF39
4.6 Nachweis der Bildung von 4HV-CoA mittels Gaschromatographie (GC)
4.7 Synthese von Lävulinyl-CoA durch Rohextrakt von R. eutropha HF39 .
4.8 Quantifizierung des 4-HV-Umsatzes durch die fadE- und ler-Mutanten von R. eutropha HF39
4.9 Identifizierung von Proteinen mittels 2-D-Gelelektrophorese
4.9.1 Analyse von Proteinen, die spezifisch auf LA gebildet werden
4.9.2 Analyse von Proteinen, die spezifisch auf 4HV gebildet werden
4.9.3 Zeitliche Änderung des Proteinspektrums von R. eutropha nach Induktion der Zellen mit Lävulinsäure
4.9.4 Abschließende Bemerkungen zur Identifizierung unbekannter Proteine mittels 2-D-Gelelektrophorese
4.10 Hypothesen zum alternativen Abbau von LA
4.10.1 Potentielle Reduktion von Lävulinyl-CoA durch unspezifische Ketoacyl- Reduktasen
4.10.2 Modell eines alternativen Stoffwechselweges
4.10.3 Beteiligung von Glutathion-S-Transferasen am LA-Abbau
4.10.4 Mögliche Beteiligung einer Glutaryl-CoA-Dehydrogenase und einer Crotonase am Lävulinsäurekatabolismus
4.11 Ausblick
4.11.1 Test auf Lävulinyl-CoA-Reduktaseaktivität anderer Enzyme
4.11.2 Weiterführende Experimente mittels 2-D-Elektrophorese
4.11.3 Reinigung der Lävulinat-Reduktase
4.11.4 Identifizierung des Lävulinat-Reduktasegens mittels DNA- Schutzexperimenten

5. Zusammenfassung

6. Literatur

1. Einleitung

1.1 Das Bakterium Ralstonia eutropha

Bei R. eutropha handelt es sich um ein Gram-negatives aerobes Bakterium mit stäbchenförmiger Gestalt. Es zeichnet sich durch eine peritriche Begeißelung aus. Als Vertreter der Wasserstoff-(H2)-oxidierenden Bakterien ist es in der Lage, sich chemolithoautotroph zu ernähren. Hierbei werden die Elektronen des H2 auf NAD+ übertragen und das NADH+H+ zur Fixierung von CO2 über den Calvin-Zyklus genutzt. Die Hydrogenase, die den Elektronentransfer von H2 auf NAD+ katalysiert, kann entweder als membrangebundenes (Arten von Pseudomonas) oder als cytoplasmatisches Enzym (Nocardia opaca) auftreten. R. eutropha zeichnet sich durch den Besitz sowohl einer membrangebundenen als auch einer cytoplasmatischen Hydrogenase aus. Neben Chemolithoautotrophie ist auch chemoorganotrophes Wachstum möglich. Hexosen und Gluconat werden dabei über den Entner-Doudoroff- Weg abgebaut. Wie auch viele andere H2-oxidierende Bakterien kann R. eutropha eine Vielzahl von Kohlenstoffquellen zum Wachstum nutzen u.a. aromatische und heterozyklische Ringsysteme. (SCHLEGEL, 1992). Aufgrund seiner Fähigkeit, Poly-β- hydroxybuttersäure in hoher Konzentration zu akkumulieren, wurde R. eutropha, nicht zuletzt wegen seiner Apathogenität und seiner leichten Kultivierbarkeit, ein Mikroorganismus von industrieller Bedeutung.

1.2 Bildung, Vorkommen und industrielle Bedeutung von Polyhydroxyfettsäuren (PHF)

PHF treten in der Natur hauptsächlich als Poly(3-hydroxyfettsäuren) auf. Es handelt sich hierbei um lineare Polyester, die ein Molekulargewicht zwischen 50 und 1.000 kDa aufweisen. Das häufigste Polymer, das man in Bakterien findet, ist die Poly-3- hydroxybuttersäure (PHB). Die 3-Hydroxybutyrat (3HB)-Moleküle werden über Esterbindungen zwischen der Carboxylgruppe des einen Monomers und der 3-Hydroxygruppe des anderen Monomers verknüpft. Die Hydroxygruppe am C-3-Atom liegt dabei in der R-Konfiguration vor. PHB wurde 1926 von Lemoigne in Bacillus megaterium entdeckt. Während man zunächst annahm, dass sich das Auftreten von PHF auf wenige Bakterienarten beschränkte, wurde später festgestellt, dass PHF’s in den verschiedensten Bakteriengattungen gefunden werden können (BRANDL, 1990). Neben phototrophen, aeroben, organotrophen und lithotrophen Bakterien wurden PHF’s auch in Cyanobakterien und den Archaea entdeckt (DOI UND STEINBÜCHEL, 2001). Das Vorkommen von PHF beschränkt sich nicht nur auf Prokaryoten. Auch in Mikrosomen und Mitochondrien pflanzlicher und tierischer Zellen konnten PHF entdeckt werden (REUSCH, 1989; REUSCH, 1992). Hierbei muss zwischen Speicherpolymeren, die nur bei Bakterien vorkommen, und komplexen PHF, die sowohl bei Prokaryoten als auch bei Eukaryoten auftreten, unterschieden werden. Es kommt zur Bildung von Speicherpolymeren in Bakterien, wenn eine Kohlenstoffquelle im Überschuss vorliegt und ein essentielles Makroelement wie z.B. Stickstoff (DOUDOROFF, 1966), Sulfat, Phosphat oder Magnesium (KALTWASSER, 1962; REPASKE UND REPASKE, 1976; SUZUKI ET AL., 1986) limitiert ist. Unter unwirtlichen Bedingungen stellt die Bildung eines Energie- und Kohlenstoffspeichers für Bakterien einen Selektionsvorteil dar; bei Verbesserung der Wachstumsbedingungen kann das Bakterium dann schnell auf seinen C-Speicher zurückgreifen. Neben der Bedeutung als Speichersubstanz erfüllt PHB auch eine wichtige Rolle als Redoxregulator (SENIOR UND DAWES, 1971). Dies konnte anhand des Bakteriums Rhizobium etli CE3 verdeutlicht werden, das aufgrund einer Auxotrophie bezüglich Biotin und Thiamin, den Cofaktoren der Pyruvat- und α-Ketoglutarat-Dehydrogenase, einen Defekt im Tricarbonsäurezyklus aufweist. Um ein ausgeglichenes Redoxpotential aufrecht zu erhalten, kommt es zur Anhäufung großer Mengen an PHB (ENCARNACION ET AL., 1995). Komplexe PHF (cPHF) kommen sowohl bei Prokaryoten als auch bei Eukaryoten vor. Sie besitzen einen Polymerisationsgrad von weniger als 150 Monomeren und binden an Makromoleküle. Die cPHF werden nach Art ihrer Bindung, ob kovalent oder nicht- kovalent, unterschieden. Nicht-kovalent gebundene cPHF findet man in der Zellmembran, wo sie zusammen mit Polyphosphatsalzen Membrankanäle ausbilden. 99x% der cPHF liegen allerdings in kovalent gebundener Form, hauptsächlich in Verbindung mit Proteinen, vor (DOI UND STEINBÜCHEL, 2001).

Bei R. eutropha kann unter Speicherbedingungen der Anteil von PHB an der Zelltrockenmasse 80 % überschreiten. Die PHB wird in Form von Grana gespeichert, die zu 97-98 % aus PHB, zu 2 % aus Proteinen und zu 0,5 % aus Lipiden bestehen (GRIEBEL ET AL., 1968). Der Durchmesser der Grana liegt zwischen 200-700 nm (ELLAR ET AL., 1968). Die PHF-Grana sind amorph und besitzen hydrophobe Eigenschaften. Sie sind von einer Membran aus Proteinen und Lipiden umgeben. Bei den Proteinen handelt es sich um PHF-Synthasen, PHF-Depolymerasen und Phasine. Phasine wurde eine ähnliche Rolle wie den Oleosinen in Pflanzen zugeteilt, die das Verschmelzen von Öltröpfchen verhindern. Phasine zeichnen sich durch amphiphile Eigenschaften aus, wobei der hydrophobe Teil an die PHF-Grana bindet und der hydrophile Teil in Verbindung mit dem Cytoplasma steht (STEINBÜCHEL ET AL., 1995).

3HB ist zwar das mengenmäßig häufigste Monomer in natürlich vorkommenden Polyestern. Allerdings können durch Bakterien auch 3-Hydroxyfettsäuren mit Kettenlängen zwischen 3 und 16 C-Atomen polymerisiert werden und auch das Vorkommen von 4-, 5- und 6-Hydroxyfettsäuren in PHF wurde beobachtet. Mittlerweile sind weit über 100 PHF bekannt (STEINBÜCHEL UND VALENTIN, 1995). Besteht ein Polymer nur aus einer bestimmten Hydroxyfettsäure, so spricht man von einem Homopolyester. Heteropolyester werden in Mischpolyester und Copolyester unterteilt. In Copolyestern sind die Polymerketten aus verschiedenen Bausteinen aufgebaut, während in Mischpolyestern, sogenannten „blends“, die Monomere innerhalb einer Polymerkette identisch sind, jedoch unterschiedliche Monomere im Polymer auftreten können. Die Zusammensetzung des Polymers hängt dabei stark davon ab, welche C-Quellen dem Bakterium zur Verfügung stehen. Die Existenz einer großen Bandbreite von Polyestern ergibt sich aus der geringen Substratspezifität der PHF-Synthasen. Die PHF-Synthase von R. eutropha toleriert Coenzym A-Thioester von z. B. 3-Hydoxybutyrat, 3-Hydroxyvalerat, 4-Hydroxyvalerat und 5-Hydroxyvalerat als Substrat. Bislang wurde angenommen, dass sie für kurzkettige Fettsäuren mit drei bis fünf C-Atomen spezifisch ist, doch neuere Studien haben ergeben, dass sie auch CoA- Thioester von 3-Hydroxyfettsäuren mittlerer Kettenlange nutzt (DENNIS ET AL., 1998; ANTONIO ET AL., 2000). Sie wird als Typ I-PHF-Synthase bezeichnet und besitzt ein Molekulargewicht von ca. 65 kDa. Der Typ II von PHF-Synthasen, der bislang ausschließlich bei Spezies der Gattung Pseudomonas nachgewiesen wurde, nutzt zwar nur 3-Hydroxyfettsäuren, allerdings kann diese PHF-Synthase unterschiedliche Hydroxyfettsäuren mittlerer Kettenlänge einbauen. Als mittellang werden solche Fettsäuren bezeichnet, deren Kohlenstoffkette zwischen 6- und 16-C-Atomen lang ist. Der Einbau von Fettsäuren mit Kettenlängen bis zu 14-C-Atomen in Polymere konnte durch PHF Typ-II-Synthasen nachgewiesen werden. Die PHF Typ-II-Synthase besteht wie auch die PHF-Typ-I-Synthase aus einer einzigen Peptidkette, die ein Molekulargewicht von 65 kDa besitzt. Ein weiterer Typ von PHF-Synthasen wurde in photosynthetischen Schwefelpurpurbakterien und Cyanobakterien entdeckt. Diese PHF Typ-III-Synthasen bestehen aus zwei unterschiedlichen Peptidketten mit Molekulargewichten von jeweils etwa 40 kDa, von denen eine Untereinheit hohe Homologien zu den PHF Typ-I- und Typ-II-Synthasen aufweist (STEINBÜCHEL UND JUNG, 2001). Die PHF Typ-III-Synthase gleicht in ihrer Substratspezifität der PHF Typ- I-Synthase.

Die Aussage, welche PHF-Synthase für welche Substrate spezifisch ist, wurde bislang dadurch getroffen, dass die Zusammensetzung der Polymere in den jeweiligen Organismen untersucht wurde. Allerdings müssen die hierbei gewonnenen Ergebnisse kritisch hinterfragt werden, weil die Polymerzusammensetzung stark von den physiologischen Umständen und der Fähigkeit des Bakteriums, CoA-Thioester von Hydroxyfettsäuren zur Verfügung zu stellen, abhängt (DOI UND STEINBÜCHEL 2001). Bislang konnte nur eine PHF-Synthase in vitro auf ihre Substratspezifität getestet werden (HAYWOOD ET AL., 1989).

Die Synthese von PHB in R. eutropha erfolgt ausgehend von zwei Molekülen Acetyl- CoA. Diese werden über eine β-Ketothiolase (PhaA) zu Acetoacetyl-CoA kondensiert. Acetoacetyl-CoA wird anschließend über eine NADPH-abhängige Acetoacetyl-CoA- Reduktase (PhaB) zu (R)-3- Hydroxybutyryl-CoA reduziert und dieses dann über die PHF Typ-I-Synthase (PhaC) ins Polymer eingebaut. Die Gene phaA, phaB und phaC sind in einem gemeinsamen Operon lokalisiert (SCHUBERT ET AL., 1988; SLATER ET AL. 1988; PEOPLES UND SINSKEY, 1989).

Ein anderer Stoffwechselweg wurde bei Rhodospirillium rubrum entdeckt, wo eine NADH-abhängige Acetoacetyl-CoA-Reduktase zunächst (S)-3-Hydroxybutyryl-CoA bildet, das anschließend durch zwei Enoyl-CoA-Hydratasen in (R)-3-Hydroxybutyryl- CoA umgewandelt wird (MOSKOWITZ UND MERRICK, 1969).

Wird R. eutropha unter Speicherbedingungen gleichzeitig mit Gluconat und Propionat gefüttert, kommt es zur Bildung eines Copolyesters aus 3-Hydroxyvalerat und 3- Hydroxybutyrat, Poly(3HB-co-3HV). Dieser Polyester ist bereits zu industrieller Vermarktung gekommen (s. u.). An der Synthese dieses Polymers ist ein weiteres Gen beteiligt (bktB), das 4 Kilobasenpaare (kBp) stromabwärts des phaCAB-Operons liegt. Es codiert für eine 3-Ketovaleryl-CoA-Dehydrogenase (SLATER ET AL., 1998), die Propionyl- CoA mit Acetyl-CoA kondensiert.

Während bei R. eutropha die PHF-Monomere großteils durch Fettsäure de novo Synthese entstehen, können Pseudomonas-Arten auch auf Intermediate der β-Oxidation zugreifen. Als Beispiel sei hier Pseudomonas oleovorans angeführt, bei dem die Speicherung von PHF’s mittlerer Kettenlänge zuerst beobachtet wurde (DE SMET ET AL., 1983). Wird P. oleovorans unter Speicherbedingungen mit Octanoat gefüttert, kommt es zur Bildung eines Copolymers, das zu 89 % aus (R)-3-Octanoat und zu 11 % aus (R)-3- Hexanoat besteht.

Die chemischen und physikalischen Eigenschaften von PHF wie z. B. UV- und Hydrolysebeständigkeit (STEINBÜCHEL UND JUNG, 2001) gleichen denen von Polypropylen. Weitere Eigenschaften wie ein hoher Polymerisationsgrad, Wasserunlöslichkeit, Enantiomerenreinheit, thermoplastische Verformbarkeit, Elastizität und biologische Abbaubarkeit (HOCKING UND MARCHESSAULT, 1994) machten PHF für eine kommerzielle Nutzung interessant. Zunächst waren PHF vorrangig für die Verpackungsindustrie als biologisch abbaubarer Rohstoff von Interesse. Das Chemieunternehmen Imperial Chemical Industries (ICI) produziert mit R.xeutropha ein Copolymer aus 3HB und 3HV, das unter dem Handelsnamen Biopol auf den Markt kam und zur Herstellung von Plastikflaschen, Joghurtbechern, Einwegrasierern etc. genutzt wurde. Später rückten PHF verstärkt in den Blickpunkt spezieller Anwendungen wie z. B als Gerüstsubstanz zur Herstellung organischer Herzklappen durch Gewebekulturen (STOCK ET AL., 2000) oder als Bindemittel für die Herstellung von Latexfarben (VAN DER WALLE ET AL., 1999).

Die Herstellung von Biopolymeren über die Fermentation von Mikroorganismen ist eine Sekundärproduktion, da auf pflanzliche Rohstoffe zurückgegriffen werden muss. Zwar stehen hier industrielle Abfallstoffe wie z. B. Melasse aus der Zuckerherstellung zur Verfügung, doch tragen noch andere Faktoren dazu bei, dass die Produktion von Biopolymeren mit Bakterien sehr teuer ist. Hier seien die hohen Kosten für Antibiotika und der hohe Energiebedarf für die Sterilisierung von Medium und Bakterienkulturen genannt. Für eine effiziente Produktion von Biopolymeren müssten die PHF- Synthesegene in Pflanzen transferiert werden. Ein Modell ist, dass PHF in den Blättern von Kartoffeln gespeichert werden könnten, während die Knollen weiterhin Stärke liefern würden. Allerdings wurden bislang nur transgene Kartoffeln erhalten, die bis zu 3 % ihrer Trockenmasse an PHB speichern. Für eine effiziente Produktion müsste der Ertrag bei mindestens 15 % (w/w) liegen (STEINBÜCHEL UND JUNG, 2001). In anderen Pflanzen konnten bereits höhere PHB-Ausbeuten erzielt werden. So wurden transgene Rapspflanzen entwickelt, die einen Anteil von 7 % PHB am Trockengewicht erreichten, und im Modellsystem Arabidopsis thaliana konnten sogar 13 % PHB-Ausbeute erzielt werden (SLATER ET AL., 1999). Bakterielle Systeme werden aber weiterhin für die Entwicklung und Verbesserung von PHF-Synthesewegen von Bedeutung sein.

1.3 Der Lävulinsäurestoffwechsel in Ralstonia eutropha

Lävulinsäure (LA) (gleichbedeutend mit 4-Ketovaleriansäure, 4-Oxopentansäure, 4- Oxovaleriansäure oder β-Acetopropionsäure) tritt unter natürlichen Bedingungen als Abbau- oder Stoffwechselnebenprodukt bei verschiedenen Mikroorganismen auf. LA ist ein Abbauprodukt im Steroidkatabolismus von Nocardia opaca (SCHUBERT ET AL., 1975) und im 3-Methylpyridinabbau von Gordonia nitida LE31 (LEE ET AL., 2001). Desweiteren tritt es als Nebenprodukt im Mycophenolatstoffwechsel von Penicillium brevicompactum auf (NULTON UND CAMPBELL, 1978). LA hat auch große industrielle Bedeutung und wird deshalb schon seit langer Zeit auf chemischem Wege hergestellt. Die bedeutendsten Produkte sind Methyltetrahydrofuran, das als Lösungsmittel und Benzinstreckmittel genutzt wird, δ-Aminolävulinsäure, ein Insektizid und Pestizid und Diphenolsäure, das für die Synthese von Polymeren und anderen Materialien interessant ist. Früher wurden Verfahren zur Synthese von LA genutzt, für die teure Ausgangssubstrate gebraucht wurden und es kam zur Bildung vieler unerwünschter Nebenprodukte. Die Kosten für LA lagen zwischen 8 und 12 $ pro kg (BOZELL ET AL., 2000). Durch ein neuartiges Verfahren, bei dem LA aus der sauren Hydrolyse von C-6- Zuckern gewonnen wird (BIOFINE CORPORATION, USA), könnte der Preis in Zukunft auf 0,08-0,2 $ pro kg fallen. Cellulose-haltige Abfallprodukte aus der Papierindustrie oder Landwirtschaft könnten als Ausgangsmaterialien genutzt werden.

LA kann auch für die Produktion von Biopolymeren eingesetzt werden, weshalb dieses Substrat aufgrund des sinkenden Preises für die Fermentation von Mikroorganismen interessant wurde. Mit LA als Substrat werden große Mengen an 4-Hydroxyvalerian- säure (4HV) in ein Terpolyester aus 3HB-co-3HV-co-4HV eingebaut (3HB, 3- Hydroxybutyrat; 3HV, 3-Hydroxyvalerat) (SCHMACK ET AL., 1998). Ein hoher Anteil an 4HV führt zu einer höheren Flexibilität des Polymers.

Die Bildung dieses Terpolyesters wurde zunächst unter Zufütterung von 4HV in R.xeutropha HF39 untersucht (VALENTIN UND STEINBÜCHEL, 1995). Dabei speicherte der Wildtyp nur 3,1 Prozent 4-HV im Bezug auf den Gesamtgehalt an PHF (88,7 % Anteil an der Zelltrockenmasse). Durch verschiedene Transposon-Mutantionen konnte der 4HV-Anteil am Polymer auf bis zu 32,9 % gesteigert werden, wobei der Polymergesamtgehalt aber stark verringert war. 4HV ist kommerziell nicht erhältlich und muss daher durch die alkalische Hydrolyse aus dem teuren γ-Valerolacton synthetisiert werden. Ein weiterer Nachteil neben dem hohen Preis ist die Bildung eines Racemates bei der chemischen Synthese, von dem die PHF-Synthase vermutlich nur ein Isomer (direkt) nutzen kann.

LA wurde bereits erfolgreich für die Produktion eines 4HV-haltigen Copolyesters eingesetzt. Hierbei wurde ein rekombinanter Stamm von Pseudomonas putida, der eine plasmidcodierte PHF Typ-III-Synthase aus Thiocapsa pfennigii trug, verwendet (SCHMACK ET AL., 1998). Die Zellen wurden auf Octansäure angezogen, und während der Speicherphase wurde mit LA gefüttert. Dabei wurde ein 4HV-Anteil von 23,9 % am Gesamtpolymer erzielt. Der Polymergehalt in den Zellen erreichte 52,3 %.

Langfristiges Ziel, zu dem auch diese Arbeit einen Beitrag leisten soll, ist die Entwicklung eines rekombinanten E. coli-Stammes, der in der Lage ist, mit LA als Substrat einen Homopolyester aus 4HV zu produzieren. Hierfür könnte ein Plasmid genutzt werden, das für eine Butyratkinase und eine Phosphotransbutyrylase aus Clostridium acetobutylicum codiert. Diese Enzyme können 4HV-Coenzym A (4HV- CoA) produzieren, welches dann ebenfalls über eine plasmidcodierte PHF Typ-III- Synthase aus Thiocapsa pfennigii polymerisiert wird. Die Bildung eines 4HV- Homopolyesters mit einem Anteil von 1,3 % an der Zelltrockenmasse konnte bereits beobachtet werden, wenn 4HV als Substrat angeboten wurde (LIU UND STEINBÜCHEL, 1999). Mit einem Enzym, das die Carbonylgruppe der LA reduzieren kann, könnte 4HV zur Verfügung gestellt werden. Da bei Fütterung mit LA unter Speicherbedingungen große Mengen an 4HV gebildet werden, ist es wahrscheinlich, dass ein solches Enzym existiert.

Nach einem hypothetischen Stoffwechselweg für 4HV in R. eutropha (VALENTIN UND STEINBÜCHEL, 1995) wird 4HV zunächst durch eine Acyl-CoA-Synthetase oder CoA- Transferase zu 4HV-CoA aktiviert und anschließend über einen unbekannten Weg in 3HV-CoA umgewandelt. 3HV-CoA wird anschließend durch eine 3-Hydroxyacyl-CoA- Dehydrogenase zu 3-Ketovaleryl-CoA oxidiert und dieses durch eine β-Ketothiolase in Acetyl-CoA und Propionyl-CoA gespalten. Zwei Moleküle Acetyl-CoA kondensieren mittels einer weiteren β-Ketothiolase zu Acetoacetyl-CoA, das über eine AcetoacetylCoA-Reduktase zu 3-Hydroxybutyryl-CoA reduziert wird. Somit stehen alle Komponenten zur Verfügung, die zum Poly(3HB-co-3HV-co-4HV)-Terpolyester durch die PHF Typ-I-Synthase polymerisiert werden.

Molekulare Daten über den Stoffwechsel von 4HV-CoA zu 3HV-CoA wurden zum ersten mal durch BRÄMER (2002) geliefert. Es konnte gezeigt werden, dass Acetyl-CoA und Propionyl-CoA im Katabolismus von Lävulinsäure entstehen, die über den Citrat- bzw. 2-Methylcitratzyklus weiter verstoffwechselt werden (BRÄMER UND STEINBÜCHEL, 2001). Enzyme der β-Oxidation sind an der Umsetzung von LA durch R. eutropha beteiligt, weil der Zusatz von Acrylsäure das Wachstum inhibiert. Acrylsäure ist ein Inhibitor der β-Ketothiolase, die Acetyl-CoA von 3-Ketoacyl-CoA im Zuge der β- Oxidation abspaltet (THIJSSE, 1964).

Die Untersuchung von Tn5-Mutanten von R. eutropha HF39 mit Defekten im LA- Metabolismus führte zur Entdeckung von drei offenen Leserahmen (ORFs) (BRÄMER, 2002). ORF1 hat eine Größe von 1.263 bp und zeigte 84 mol% Übereinstimmung mit einer möglichen Acyl-CoA Dehydrogenase aus Ralstonia solanacearum (SALANOUBAT ET AL., 2001). ORF1 wurde deshalb als fadE bezeichnet. 157 bp stromaufwärts befindet sich in colinearer Orientierung ORF3 mit einer Größe von 732 bp, der ein 26 kDa großes Protein mit einem theoretischen pI von 6,39 codiert. Dieses Protein zeigte 80 % Homologie zu einer putativen Glutathion-S-Transferase aus R. solanacearum (SALANOUBAT ET AL., 2001), weshalb ORF2 gst genannt wurde. 189 bp stromaufwärts von fadE liegt in antilinearer Orientierung ein ORF2 mit einer Größe von 942 bp, der für ein Protein mit theoretischem Molekulargewicht von 35 kDa und theoretischem pI von 9,91 codiert. Dieses Protein zeigte 72 % Identität zu einem putativen Transkriptionsregulator aus R.xsolanacearum (SALANOUBAT ET AL., 2001). Da eine Deletion in diesem Gen das Wachstum von R. eutropha auf LA inhibiert, wurde vermutet, dass ORF2 ein möglicher Transkriptionsregulator von LA abbauenden Enzymen ist. Dieser ORF wurde daraufhin als levR bezeichnet. Eine Mutation im fadE- Gen (Stamm SK7291) führt dazu, dass R. eutropha nicht mehr mit LA als Substrat wachsen kann. Erst nach langer Inkubation auf Mineralmediumplatten mit LA (> 215 h) kann SK7291 wieder auf LA wachsen. Die Deletion des gst-Gens erzeugt keinen Phänotyp.

Wird R. eutropha auf LA angezogen, kommt es zur Bildung eines 32,3 kDa Proteins mit theoretischem pI von 5,29, das mit anderen Substraten nur in geringen Konzentrationen synthetisiert wird. Dieses Protein wird durch einen 882 bp-ORF codiert. Die Aminosäuresequenz dieses Proteins zeigte 60 mol% Übereinstimmung zu einem hypothetischen HNS-reprimierten Protein aus verschiedenen E. coli Stämmen (HAYASHI ET AL., 2001; PERNA ET AL., 2001) und 59 bzw. 55 mol% Identiät zu hypothetischen Proteinen aus Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus (STOVER ET AL., 2000; KURODA ET AL., 2001). Aufgrund eines Glycin-reichen Proteinsegmentes mit 75 % Identität zur NAD+-Bindestelle von 2-Hydroxyfettsäure- Dehydrogenasen wurde eine direkte Beteiligung des Enzyms an der Reduktion von LA vermutet, weshalb das Protein als Lävulinat-Reduktase (Ler) bezeichnet wurde. 194 bp stromaufwärts des ler-Gens liegt ein 903 bp ORF, der 41 mol% Identität zu einer Crotonase (Crt) aus Mesorhizobium loti (KANEKO ET AL., 2000) und 30 mol % Identität zu einer Enoyl-CoA-Hydratase aus Sulfolobus solfataricus zeigte.

Diese und andere Daten führten zur Entwicklung folgenden Stoffwechselschemas (Abb. 1.1, S. 10). Vor der Aufnahme von LA wird diese durch eine CoA-Transferase aktiviert. Anschließend erfolgt eine Reduktion von LA-CoA zu 4HV-CoA, wobei dieser Schritt möglicherweise durch Ler katalysiert wird. 4HV-CoA wird durch eine Acyl- CoA-Dehydrogenase, potentiell FadE, zu 4-Hydroxy-2-pentenoyl-CoA umgesetzt. Eine Dehydratisierung, potentiell durch Crt katalysiert, resultiert in der Bildung von 2,4- Dipentenoyl-CoA, woran sich eine NADH-abhängige Reduktion zu 2-Pentenoyl-CoA über eine 2,4-Dienoyl-CoA-Reduktase anschließt. 2-Pentenoyl-CoA wird über die β- Oxidation weiter zu Acetyl-CoA und Propionyl-CoA abgebaut, welche weiter über den Citronensäurezyklus bzw. den 2-Methylcitratzyklus verstoffwechselt werden. Analoge Reaktionen, die im fermentativen Stoffwechsel von Clostridium aminovalericum beobachtet wurden, unterstützen diese These (EIKMANNS UND BUCKEL, 1991). In diesem Bakterium katalysiert eine grüne, FAD enthaltende 5-Hydroxyvaleryl-CoA- Dehydrogenase/-Dehydratase die Oxidation von 5-Hydroxyvaleryl-CoA zu 5-Hydroxy- 2-pentenoyl-CoA, welches weiter zu 2,4-Dipentenoyl-CoA dehydratisiert wird (BRÄMER, 2002).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1.1: Möglicher Abbauweg von Lävulinsäure nach Brämer (2002). LA wird zu Propionyl-CoA und Acetyl-CoA abgebaut, die in den 2-Methylcitronensäure-(MCC) bzw. Citronensäurezyklus (TCC) münden.

1.4 Zielsetzung dieser Arbeit

Unter Speicherbedingungen kommt es in R. eutropha zur Akkumulation eines Terpolyesters aus Poly(3HB-co-3HV-co-4HV), wenn LA als Substrat angeboten wird. Es gilt dabei als sehr wahrscheinlich, dass 4HV auf direktem Wege durch die Reduktion der LA gebildet wird. Ziel dieser Arbeit war die Verifizierung dieser Hypothese. Ausgangspunkt dieser Arbeit war die Entdeckung eines 32,3 kDa Proteins, das spezifisch bei Wachstum von R. eutropha auf LA gebildet wird. Da dieses Protein bei Wachstum auf 4HV, dem nachfolgenden Substrat im hypothetischen Abbauweg der LA, nicht gebildet wird, lag die Vermutung nahe, dass es sich um eine Lävulinatreduktase (Ler) handeln könnte. Diese These sollte überprüft werden, indem das zugehörige ler-Gen in Escherichia coli exprimiert und die Auswirkungen auf den Phänotyp untersucht werden sollten. Ferner sollte das ler-Gen in R. eutropha deletiert und die Auswirkungen auf das Wachstum der Mutante analysiert werden. Falls sich kein Nachweis dafür finden ließe, dass Ler LA zu 4HV reduziert, sollten über zweidimensionale SDS-PAGE Proteine identifiziert werden, die beim Wachstum von R.xeutropha auf LA spezifisch exprimiert werden. Diese Proteine sollten massenspektrometrisch analysiert werden und die Daten mit theoretischen Massenspektren von Proteinen aus der R. eutropha H16 Datenbank (GOTTSCHALK, GÖTTINGEN) abgeglichen und über diese Methode eine LA-Reduktase identifiziert werden.

2. Material und Methoden

2.1 Organismen und Plasmide

Folgende Stämme wurden in der vorliegenden Arbeit verwendet:

Tabelle 2.1: Verwendete Stämme von Ralstonia eutropha

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

a)Phänotypenbezeichnungen: Läv, Verwertung von Lävulinsäure; r, resistent; Tn5, Transposon Tn5::mob; - bzw. +, Eigenschaft fehlend bzw. vorhanden; Sm, Streptomycin; Km, Kanamycin; SK, Nmmer in der Stammkultursammlung der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. A. Steinbüchel.

Tabelle 2.2: Verwendete Stämme von Escherichia coli

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a) Phänotypbezeichnungen: F, Fertilitäts-Faktor; Tcr, Tetracyclinresistenz; Apr, Ampicillinresistenz; + bzw. - , Eigenschaft vorhanden bzw. fehlend. Genotypenbezeichnungen: s. BACHMAN, 1987.

b) Nummer in der Stammkultursammlung der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. A. Steinbüchel.

c) Stratagene, San Diego, USA

Folgende Vektoren wurden in dieser Arbeit verwendet:

Tabelle 2.3.: Verwendete Vektoren

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

a)Phänotypbezeichnungen: Cmr, Chloramphenicolresistenz; Apr, Ampicillinresistenz; buk+, ButyratKinase aus Clostridium acetobutylicum, ptb+, Phosphotransbutyrylase aus Clostridium acetobutylicum, MCS, Polylinker; Genotypenbezeichnungen: s. BACHMANN, 1987.

b)Stratagene, San Diego, USA.

c) New England Biolabs, Beverly, USA.

d)Nummer in der Stammkultursammlung der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. A. Steinbüchel.

Folgende Hybridplasmide/Hybridcosmide wurden im Laufe dieser Arbeit konstruiert:

Tabelle 2.4.: Im Rahmen dieser Arbeit konstruierte Hybridplasmide/Hybridcosmide

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

a)Nummer in der Stammkultursammlung der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. A. Steinbüchel.

Es wurde eine „Knock-out Mutante“ von R. eutropha HF39 hergestellt:

Tabelle 2.5: Im Rahmen dieser Arbeit konstruierte Mutante von R. eutropha HF39

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

a)Phänotypenbezeichnungen: Sm, Streptomycinresistenz; Km, Kanamycinresistenz

b)Nummer in der Stammkultursammlung der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. A. Steinbüchel.

2.2 Nährmedien

Nachfolgend sind die verwendeten Nährlösungen aufgeführt. Sie wurden vor Verwendung für 20 min bei 120 °C autoklaviert. Feste Medien wurden durch Zusatz von 1,5 % (w/v) Agar zu einer entsprechenden Nährlösung hergestellt.

2.2.1 Mineralmedium (SCHLEGEL ET AL., 1961)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Für heterotrophes Wachstum wurde eine getrennt autoklavierte oder sterilfiltrierte C- Quelle in den jeweils angegebenen Konzentrationen zugesetzt.

2.2.2 Spurenelementlösung SL6 (PFENNIG, 1974)

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2.2.3 NB-Medium (SAMBROOK ET AL., 1989)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.2.4 Luria-Bertani (LB)-Medium (SAMBROOK ET AL., 1989)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.2.5 X-Gal-Medium (SAMBROOK ET AL., 1989)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.2.6 M9-Medium (SAMBROOK ET AL., 1989)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Nach dem Autoklavieren wurden folgende, getrennt sterilisierte Komponenten zugesetzt:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.2.7 Antibiotika

Die Antibiotika-Stammlösungen wurden nach SAMBROOK ET AL. (1989) angesetzt, sterilfiltriert und in Aliquots bei -20 °C aufbewahrt. Die Antibiotika wurden den autoklavierten Nährmedien nach Abkühlen auf ca. 50 °C in folgenden Endkonzentrationen zugesetzt:

Tabelle 2.6: Verwendete Antibiotika

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.3 Herstellung von Substraten

4-Hydroxyvaleriansäure ist nicht im Handel erhältlich und wurde deshalb aus γ- Valerolacton synthetisiert.

2.3.1 Synthese von 4-Hydroxyvaleriansäure

4-Hydroxyvaleriansäure (4HV) wurde durch alkalische Hydrolyse des korrespondierenden Lactons (γ-Valerolacton) hergestellt. Die Hydrolyse erfolgte durch Zusatz von 10 N NaOH zu einer eisgekühlten wässrigen Suspension des Lactons (50 %, v/v) unter Rühren, bis ein pH-Wert von 11 bis 12 erreicht war. γ-Valerolacton wurde 1 h bei pH 11 bzw. pH 12 auf Eis gerührt. Die Umsetzung war vollständig, wenn keine Phasentrennung mehr auftrat und der eingestellte alkalische pH-Wert stabil blieb. Nach vollständiger Hydrolyse des Lactons wurde der pH-Wert mit 1 N HCl auf pH 7 eingestellt.

2.3.2 Synthese von Acyl-Coenzym-A-Thioestern

Acyl-Coenzym-A(CoA)-Thioester wurden auf chemischem Wege hergestellt, indem zunächst aktivierte Acylimidazole synthetisiert wurden. Die Imidazolgruppe wurde dann durch CoA substituiert.

2.3.2.1 Synthese von Lävulinyl-CoA (KAWAGUCHI ET AL., 1981)

1 mmol Carbonyldiimidazol (CDI) wurden in 10 ml Tetrahydrofuran (THF) suspendiert und 1,1 mmol Lävulinsäure (LA) (Konz. >98 %) zugegeben. Unter Gasentwicklung entstand eine klare Lösung. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur durchgeführt und war beendet, wenn die Gasentwicklung stoppte (ca. 5-10 min).

10 µmol CoA wurden in 9 ml 100 mM NaHCO3 gelöst und 1 ml der frischen Acylimidazol-Lösung in THF zugegeben. Der Reaktionsansatz wurde 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend durch die Zugabe von 2 ml 1 M HCl angesäuert.

Das Substrat wurde über eine C18-Säule (Fa. Waters, USA) gereinigt. Eine 500 mg C18- Säule wurde mit 1 ml Methanol und mit mindestens 2 ml 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) in H2Obidest. equilibriert. Der angesäuerte Syntheseansatz wurde auf diese Säule aufgetragen und danach mit mindestens 2 ml 0,1 % TFA gewaschen. Das fertige Produkt wurde mit 50 % Acetonitril in 0,1 % TFA in 0,5 ml Fraktionen eluiert. Der CoA-Ester war normalerweise in den Fraktionen 2 bis 3 bereits eluiert. Das Acetonitril wurde für 10 - 30 min im Rotationsverdampfer bei Raumtemperatur abgezogen. Das Produkt wurde bei -70 °C eingefroren und dann gefriergetrocknet. Die erfolgreiche Synthese wurde durch die Konzentrationsabnahme von CoA festgestellt. Die Konzentration an CoA wurde mittels 5,5’-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) (DTNB) im photometrischen Test bei 412 nm bestimmt (ε = 13,6 cm₂ µmol-₁ )

2.3.2.2 Synthese von 4-Hydroxyvaleryl-CoA

Einige Hydroxysäuren sind nur als die entsprechenden Salze in wasserfreier Form zugänglich. Da für die Synthese über das Carbonylimidazol die freie Säure nötig ist, wurde die Vorgehensweise gegenüber 2.3.2.1 etwas modifiziert.

Natrium-4-Hydroxyvalerat (Na-4HV) wurde durch alkalische Hydrolyse mittels NaOH aus dem Lacton hergestellt (2.3.1) und das Wasser durch Lyophylisieren entzogen. 1,5 mmol Na-4HV wurden in 10 ml THF suspendiert und dann 1,1 mmol HCl in Diethylether zugegeben. Der Ansatz wurde für 10 min im Ultraschallbad behandelt. Unter diesen Bedingungen war die freie Säure in THF gelöst, während NaCl ausfiel. Anschließend wurde das Salz abfiltriert und 1 mmol CDI als Feststoff zugegeben. Die weiteren Schritte entsprechen denen, die unter 2.3.2.1 beschrieben sind.

2.3.2.3 Nachweis der Acyl-CoA-Synthese (PULLMANN, 1973)

Der lyophylisierte Acyl-CoA-Ester wurde in einem Gemisch aus Dichlormethan, Methanol, und konzentrierter Salzsäure (3 : 1 : 0,1) extrahiert. Dabei wurde 1 ml Lösungsmittel pro 5 µl CoA-Ester eingesetzt. Der Extrakt wurde auf ein Drittel seines Volumens unter einem Stickstoffstrom auf ein Drittel eingeengt und ausgefallene Substanz durch Zentrifugation (13.000 Upm, 5 min) entfernt. Es wurden 20 - 50 µl auf eine Dünnschichtchromatopraphie-Folie, die mit Cellulose beschichtet war, aufgetragen (Maße: 20 cm x 20 cm, Merck). Die Platte wurde in einer Laufkammer mit Butanol, Essigsäure und Wasser im Verhältnis 5 : 2 : 3 entwickelt. Nach fünf Stunden Laufzeit wurde die Folie an Luft getrocknet. Allgemein wurden die auftretenden Banden in Iodatmosphäre angefärbt. Banden, die CoA-Anteile enthielten, wurden spezifisch unter einer UV-Lampe bei einer Wellenlänge von 254 nm sichtbar. Spots von Interesse wurden ausgekratzt und die jeweilige Fettsäure per Gaschromatographie nachgewiesen.

2.4 Stammkonservierung und Reinheitskontrolle

Stämme von R. eutropha wurden als Lyophilisate bei -70 °C gelagert. Mit 1 ml einer sterilen Lösung aus 10 % (w/v) Magermilch und 5 % (w/v) meso-Inosit wurden Zellen von der Agaroberfläche einer gut bewachsenen NB-Platte abgeschwemmt, mit autoklavierten Antibiotika-Testplättchen (∅ 6mm, Nr. 321260, Schleicher & Schüll, Dassel) aufgesogen und über Nacht bei -20 °C in sterilen Zentrifugenröhrchen eingefroren. Die gefrorenen Plättchen wurden für 18 - 24 h gefriergetrocknet (Gefriertrocknungsanlage Typ 1120, Christ, Osterode) und in Schraubdeckelröhrchen (Ruhman, Troisdorf), die mit getrocknetem Kieselgel befüllt waren, bei -70° C aufbewahrt.

Die Reaktivierung eines konservierten Stammes erfolgte durch Inkubation eines Filterplättchens auf einem Rotationsschüttler in 20 ml NB-Medium ü. N. bei 30 °C. Stämme von E. coli wurden als Glycerin- bzw. DMSO-Suspensionen bei -70 °C gelagert. Die Anzucht der Zellen erfolgte über Nacht in LB-Medium, gegebenenfalls unter Zusatz eines Antibiotikums. Ein Aliquot der ausgewachsenen Kultur wurde mit sterilem Glycerin (Endkonzentration: 20 %, v/v) bzw. DMSO (Endkonzentration: 7 %, v/v) versetzt und bei -70 °C in einem Schraubdeckelröhrchen (Ruhman, Troisdorf) gelagert.

Die Reaktivierung eines konservierten Stammes wurde durch einen Ausstrich auf einer LB-Agar-Platte (gegebenenfalls unter Zusatz eines Antibiotikums) erreicht. Lebendkulturen wurden, sofern möglich, unter Selektionsdruck auf festen Medien bei 4x°C gelagert und spätestens alle 3 Wochen überimpft.

Reinheitskontrollen wurden mikroskopisch vorgenommen sowie durch Ausstreichen der Kulturen auf Mineral-, LB- oder NB-Festmedien, die zur Kontrolle stammspezifischer, phänotypischer Eigenschaften selektive Substrate oder Antibiotikazusätze enthielten.

2.5 Zellanzucht

2.5.1 Wachstumsbedingungen und Zellernte

Anzuchten in Flüssigmedien wurden in Erlenmeyerkolben vorgenommen, mit einem Volumenverhältnis Gefäß : Flüssigkeit von in der Regel 1:10. Die Hauptkulturen wurden mit gut gewachsenen Vorkulturen beimpft, wobei das Inokulum 0,5 - 5 % (v/v) des Volumens der Hauptkultur betrug.

Zellen von R. eutropha wurden auf einem Rotationsschüttler (Kühner AG, Birsfelden, Schweiz) bei 30 °C angezogen. Zellen von E. coli wurden bei 37 °C auf einem Rotationsschüttler (New Brunswick Scientific Co. Inc, Model G25) angezogen. Die Zellernte aus größeren Kulturvolumina erfolgte mittels Minifuge RF (Fa. Heraeus Instruments GmbH, Germany) bei 4.000 Upm und 4 °C für 15-30 min. Zellen in kleineren Kulturvolumina wurden in Eppendorfreaktionsgefäßen durch Zentrifugation bei 13.000 Upm bei Raumtemperatur für 5 min in einer Biofuge A (Biofuge 13, Heraeus Instruments GmbH, Germany) geerntet.

2.5.2 Wachstumsparameter

Die Aufnahme von Wachstumskurven erfolgte in Klettkolben. Die optische Dichte wurde mittels eines Klett Colorimeters (Manostat Corporation Cat Nr 76-550-220, USA) bei 520 - 580 nm (Filter Nr. 54) oder mit einem Ultrospec 2000 Photometer (Pharmacia Biotech) bei einer Wellenlänge von 436 nm (R. eutropha) bzw. 600 nm (E. coli) gegen steriles Medium bestimmt.

2.6 Herstellung von Rohextrakten

Nach der Zellernte wurden die Zellen gewaschen und im doppelten Volumen Puffer resuspendiert. Die Pufferzusammensetzung ist bei dem jeweiligen Versuch aufgeführt. Der Zellaufschluß wurde mit einer eisgekühlten „French“-Presse (Fa. Amicon, Silver Spring, Maryland, USA) bei einem Druck von 1000 MPa unter Zusatz von 10 µg/ml DNAse I durchgeführt. Bei einem Volumen von 300 µl bis 1 ml wurden die Zellen routinemäßig durch Ultraschall mit einem Branson Sonifier 250 (Sonic Power Company, USA) bei einer Amplitude von 16 Micron (1 min/ml) aufgeschlossen. Die Zellsuspension wurde während der Beschallung mit einem Eis/Kochsalz-Gemisch gekühlt.

2.7 Reinigung der Butyratkinase und der Phosphotransbutyrylase aus E. coli pJC7 (LIU UND STEINBÜCHEL, 2000)

Zellen von E. coli pJC7 wurden in 2 l LB-Medium unter Ampicillinselektion angezogen. Die Zellernte erfolgte bei einer OD600 von 1,7. Die Zellen, ca. 10 g, wurden in 100 ml Puffer A resuspendiert und mittels dreimaliger Passage durch eine French Press bei 1.000 MPa unter Zugabe von DNase I aufgeschlossen. Das Lysat wurde 1 h bei 35.000 Upm und 4 °C zentrifugiert. Zu dem Überstand wurde Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 35 % hinzugefügt und anschließend wiederum 1 h bei 35.000 Upm (4 °C) zentrifugiert. Der Überstand wurde bis auf 65 % mit Ammoniumsulfat gesättigt, und es wurde erneut unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert. Der Bodensatz, in dem sich die Butyratkinase konzentrierte, wurde in 15 ml Puffer A aufgenommen und der Überstand wurde bis auf 90 % mit Ammoniumsulfat gesättigt. Nach erneutem Zentrifugieren unter den gleichen Bedingungen wurde der Bodensatz, in dem die Phosphotransbutyrylase konzentriert war, in 7,5 ml Puffer A aufgenommen.

Die weitere Reinigung erfolgte mit Hilfe einer FPLC (Pharmacia, Upsala, Schweden) bei 8 °C. Die Proteinlösungen wurden auf eine Phenyl-Sepharosesäule CL-4B aufgetragen, die zunächst mit 150 ml Puffer A equilibriert worden war. Anschließend wurde mit 100 ml Puffer A gewaschen (0,3 ml/min). Die Enzyme wurden über einen Ammoniumsulfatgradienten von 0,75 M bis 0 M mit 100 ml Puffer eluiert. Fraktionen mit hoher Enzymaktivität (s. 2.9.3/2.9.4) wurden vereint. Zur Entfernung der Salze wurde eine Ultrafiltration mit einer Aminex PM30 Membran mit Ausschlußvolumen von 30.000 Da durchgeführt. Die Proteine wurden in 30 ml Gesamtvolumen Puffer B aufgenommen und auf eine Matrix-Red-A-Säule, die zuvor mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde mit 100 ml Puffer B gewaschen (1,0 ml/min), und anschließend wurden die Proteine mit einem KCl-Gradienten von 0-1 M eluiert (1,0 ml/min). Fraktionen mit Enzymaktivität, die im SDS-Gel (2.11) Homogenität zeigten, konnten für die Synthese von 4-Hydroxyvaleryl-CoA eingesetzt werden.

Puffer A

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Puffer B

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.8 Proteinbestimmung (BRADFORD, 1976)

Das Versetzen von 10 µl Probe (10 - 150 µg Protein/ml) mit 5 ml Bradford-Reagenz führt zur Bildung eines Farbstoff-Protein-Komplexes, wodurch das Absorptionsmaximum des Farbstoffes von 465 nm auf eine Wellenlänge von 595 nm verschoben wird. 10 min nach der Vermischung wurde die Extinktion bei 595 nm gegen einen Reagenzienleerwert gemessen. Als Referenz diente eine Messung mit BSA im Bereich von 5 - 150 µ g/ml.

Bradford-Reagenz:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.9 Photometrische Bestimmung von Enzymaktivitäten

Enzymaktivitäten werden in Einheiten (Units, U) angegeben, wobei 1 U als 1 µmol umgesetztes Substrat pro Minute definiert ist. Die spezifische Aktivität wird in U/mg Protein angegeben. Für photometrische Messungen wurde ein Ultrospec 2000 Photometer der Firma Pharmacia nebst zugehöriger Software (Upsala / Schweden) verwendet.

2.9.1 Lävulinyl-CoA-Reduktase

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

NADH+H+ bzw. NADPH+H+ haben ihre Absorptionsmaxima bei 340 nm. Im Verlauf der Reaktion wurde die Abnahme der Extinktion pro Zeiteinheit bestimmt.

2.9.2 Lävulinyl-CoA-Transferase

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Nach 0, 10, 20 und 30 min Inkubation bei 30 °C wurde 500 µl DTNB (2mM) zugefügt, wodurch freies CoA abgefangen wurde. Die Reaktion des CoA mit DTNB setzte monomeres 5-Thio-2-nitrobenzoat frei, das eine Gelbfärbung hervorrief. Die Probe wurde unverzüglich 1:10 mit Wasser verdünnt und die Extinktion bei 412 nm bestimmt.

2.9.3 Butyratkinase

Es wurde die Aktivität gemessen, mit der die Butyratkinase aus Buttersäure mit ATP Butyryl-Phosphat bildet. Hydroxylaminchlorid reagierte mit dem gebildeten Butyrylphosphat zu einer Hydroxaminsäure, die mit FeCl3 einen farbigen Eisenhydroxamatkomplex bildete, der bei 540 nm sein Absorptionsmaximum hatte. Der Absorptionskoeffizient ε betrug 0,169 cm₂ µmol-₁ (ROSE, 1955). Der Enzymtest wurde in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml durchgeführt. Nach 5 min Reaktion wurden die Proteine mit 0,5 ml 10 %iger Trichloressigsäure ausgefällt. Nach Abzentrifugieren des Überstandes wurden diesem 2 ml Eisen(III)chlorid hinzugefügt (1,25 %, w/v, in 1 N HCl), und anschließend wurde sofort die optische Dichte bestimmt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.9.4 Phosphotransbutyrylase

Die Aktivität der Phosphotransbutyrylase wurde quantifiziert, indem die Hydrolyse der Thioesterbindung zwischen Butyrat und CoA pro Zeiteinheit beobachtet wurde. Freiwerdendes CoA wurde mit DTNB nachgewiesen. Die Messung der OD erfolgte bei 412 nm (ε = 13,61 cm₂ µmol-₁ ).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.10 Gaschromatographie

2.10.1 Veresterung mit Methanol/Schwefelsäure

Die Gaschromatographie wurde eingesetzt, um den Gehalt an Fettsäuren in Zellüberständen und in Zelltrockensubstanz zu bestimmen. Desweiteren wurde mit dieser Methode die Produktbildung in Enzymtests analysiert.

1 ml Überstand aus Zellkulturen oder Enzymtests wurde in ein PyrexSchraubdeckelröhrchen mit Teflondichtung überführt. Die Probe wurde bei -70 °C eingefroren und anschließend lyophylisiert. Dann wurden 2 ml Chloroform und 2 ml Methanol/Schwefelsäure (85:15, v/v) zugesetzt. Die Fettsäuren wurden 4 h bei 100 °C im Ölbad verestert. Nach dem Abkühlen wurden 2 ml H2Obidest. hinzugefügt und die Probe etwa 2 min durchmischt. Nach der Phasentrennung wurde das Chloroform abgenommen und durch einen Wattefilter in ein GC-Vial überführt.

2.10.2 Analyse mittels Gaschromatographie

Die Trennung der Fettsäure-Methylester wurde mit einem Kapillargaschromatographen (Hewlett Packard, Series 6890 GC System) vorgenommen. Die Identifizierung und Konzentrationsbestimmung bestimmter Fettsäuren erfolgte, indem eine Eichreihe mit Reinsubstanzen mit Fettsäurekonzentrationen von 0,05 - 1,0 mg/ml erstellt wurde. Bei Bedarf konnte das Massenspektrum der Probe mit einem an den Gaschromatographen gekoppelten Massenspektrometer detektiert werden (Hewlett Packard, Series 5973 Elektronenionisations Mass Selective Detector (EI MSD), Waldbronn, Deutschland). Die Trennung der Substanzen erfolgte in einer BP 21 Kapillarsäule (Länge: 50 m; Innendurchmesser: 0,22 mm; Filmdi>mehrstufiges Temperaturprogramm verwendet: 5 min 120 °C; Temperaturanstieg erste Rampe: 3 °C/min auf 180 °C; Temperaturanstieg zweite Rampe: 5 °C/ min auf 210 °C; konstante Temperatur: 29 min 210 °C. Die gesamte Laufzeit betrug für jede Probe eine Stunde bei einer Säuleneinlasstemperatur von 250 °C und einer Säulenausgangstemperatur von 240 °C. Mit Hilfe der „NIST-Mass Spectral Search Program“- und der „Hewlett Packard Chemstation“-Softwareprogramme konnten die unterschiedlichen Fettsäuremethylester in einer Probe mittels Fragmentierung genau bestimmt werden (STEIN ET AL., 1998).

2.11 Denaturierende, diskontinuierliche SDS-PAGE (LAEMMLI, 1970)

Zur Bestimmung, ob klonierte Gene exprimiert wurden oder eine Genexpression nach Mutagenese ausblieb, wurden Proteinrohextrakte hergestellt und die Proteine nach der Größe in einem SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die Größe der einzelnen Proteine konnte durch Auftragen von Markerproteinen mit definiertem Molekulargewicht bestimmt werden.

Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgele setzen sich aus einem Sammelgel (4 %, w/v, pH 6,8) und einem Trenngel (11,5 % w/v, pH 8,9) zusammen. Die Trennung erfolgte in Minigelen (8,5 x 7 cm; BIOMETRA, Göttingen). Zur Herstellung der Gele wurden folgende Lösungen benötigt:

Acrylamidlösung:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Trenngelpuffer:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Sammelgelpuffer:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

[...]