Adaptation und Phosphorylierung in Cyanobakterien

Inhaltsverzeichnis

A. Einleitung

B. Kompensatorische Phosphorylierung
I. Reversible Phosphorylierung als Grundlage
1. Massenwirkungskinetik
2. Michaelis-Menten-Kinetik
a. Einstellung des Fließgleichgewichts
b. Veränderung von v1 und v2
c. Signalantwortverhalten
II. Beeinflussbarkeit der Konzentration des aktiven Enzyms
III. Kompensation von Konzentrationsschwankungen
1. Unabhängigkeit von K/P durch Bifunktionalität
2. Unabhängigkeit von ET durch Autokatalyse
3. Unabhängigkeit von ET durch einseitige Sättigung
a. Heuristisches Modell mit Michaelis-Menten-Kinetik
b. Problematik der Anwendung von Michaelis-Menten-Kinetik
c. Anwendung von Massenwirkungskinetik bei zwei Bindungsstellen
aa. Kinaseaktivität des Dreierkomplexes und geordnete Bindung
bb. Kinase- und Phosphataseaktivität sowie ungeordnete Bindung
IV. Kompensatorische Phosphorylierung in E.coli und Cyanobakterien
1. Glyoxylatabzweigung in E.coli
2. Glyoxylatabzweigung in Cyanobakterien
3. Pyruvatdehydrogenasekomplex in Cyanobakterien

C. Zweikomponentensysteme
I. Mechanismus der Invarianz

D. Multiple Phosphorylierung in zweikomponentigen Systemen
II. Vorkommen in E.coli und in Cyanobakterien

I. Multiple Phosphorylierung

II. Regulation der Glutaminsynthetase über PII in E.coli

III. Regulation von PII und der Glutaminsynthetase in Cyanobakterien

E. Zusammenfassung

A. Einleitung

Homöostase ist eine wichtige Eigenschaft aller Lebewesen. Durch Anpassung an veränderte Umweltbedingungen, gelingt es dem Organismus die Schwankungen in seiner Umgebung auszugleichen. Im Laufe der Evolution haben sich Möglichkeiten entwickelt, auf kurzfristige und langfristige Veränderungen der Umwelt adäquat zu reagieren. Es hat sich dabei herausgestellt, dass der posttranslationalen Veränderung von Proteinen wie der Phosphorylierung bei vielen Anpassungsprozessen eine bedeutende Rolle zukommt¹. Um eine genaue Regulierung sicherzustellen tritt bei all diesen Vorgängen eine Kompensation von Schwankungen der beteiligten Komponenten auf. Während über Phosphorylierungen und deren Invarianz beim Menschen und E.coli einiges bekannt ist, weiß man bisher nur relativ wenig darüber in Cyanobakterien. Dieser Aufsatz stellt exemplarisch einzelne Phosphorylierungsmethoden sowie deren robuste Regulierung bei E.coli vor und vergleicht sie mit dem bekannten Wissen über derartige Vorgänge in Cyanobakterien.

Phosphorylierungen sind die wichtigsten Regulierungsmechanismen in Zellen. Am bekanntesten ist der MAP-Kinaseweg mit mindestens drei sich nacheinander phosphorylierenden Kinasen². Der MAP-Kinaseweg ist unter anderem an der Regulation der Embryogenese, der Zelldifferenzierung, des Zellwachstums und des Programmierten Zelltodes beteiligt.

Durch reversible Phosphorylierung werden Proteine in Stoffwechselprozessen zur Dirigierung von Verzweigungen oder in Adaptationsprozessen wie der Chemotaxis an- und abgeschaltet. Grund für den diskreten Aktivierungsprozess ist die bei bestimmten Parametern auftretende Ultrasensitivität des zu aktivierenden Proteins auf ein externes Signal³. Es ist der Zelle dadurch möglich, genau zwischen zwei unterschiedlichen Zuständen zu unterscheiden. Dies gilt nicht nur für die kurzfristige, sondern auch für die langfristige Einstellung auf Umweltveränderungen durch Genaktivierung.

Bei der langfristigen Antwort registriert in so genannten Zweikomponentensystemen eine Sensorkinase in der Membran bestimmte Botenstoffe, phosphoryliert sich und überträgt die Phosphorylgruppe auf einen Regulator, der dann meist Gene aktiviert oder deaktiviert⁴. Beispielsweise werden dadurch Porenproteine synthetisiert, mit deren Hilfe bestimmte neu im Milieu vorhandene Stoffe aufgenommen und verwertet werden können.

Kurz- und langfristige Regulierung unterscheiden sich in ihrer Geschwindigkeit und ihrer Nachhal- tigkeit. Die langfristige Antwort erfordert durch Transkription und Translation mehr Zeit als die kurzfristige Antwort, bei der lediglich Phosphorylgruppen verknüpft und abgetrennt werden. Dafür stehen bei der langfristigen Antwort die neusynthetisierten Proteine für längere Zeit zur Verfügung, bevor sie dann proteolytisch wieder abgebaut werden.

Beide Methoden haben gemeinsam, dass sie gemessen an ihrem Eingabe-/Ausgabeverhältnis immer gleich erfolgen müssen, da die Antwort nicht von der Konzentration einer beteiligten Komponente abhängen soll. Denn diese neigen in der Zelle unter anderem wegen des ungerichteten Transports und ungleichen Zellteilungen zu starken Schwankungen⁵. Um dennoch Ressourcenverbrauch, wie er sich zum Beispiel bei überhöhter Nutzung des Transkriptionsapparates bemerkbar machen würde, und Fehlleitungen etwa bei Verzweigungen entgegenzuwirken, muss die Zelle über Mechanismen zur präzisen und konstanten Regelung verfügen.

In dieser Arbeit soll aufgezeigt werden, wie Cyanobakterien durch Phosphorylierung lang- und kurz- fristig auf Umweltveränderungen reagieren und wie sie sich an interne sowie externe Schwankungen anpassen. Zu diesem Zweck werden sowohl die kurzfristig wirkende Kompensatorische Phosphory- lierung als auch Zweikomponentensysteme zur langfristigen Anpassung an mehreren Beispielen be- sprochen. Im Anschluss daran werden Zweikomponentensysteme mit multiplen Phosphorylierungen erklärt. Ausgangspunkt der Untersuchungen ist in jedem Fall E.coli, da es im Vergleich zu Cyano- bakterien besser untersucht ist.

B. Kompensatorische Phosphorylierung

Kompensatorische Phosphorylierung ist der Ausgleich von Konzentrationsschwankungen durch reversible Phosphorylierung⁶. Für das Verständnis der kompensatorischen Wirkung sind daher zunächst die grundlegenden Eigenschaften der reversiblen Phosphorylierung zu untersuchen. Davon ausgehend werden die beiden bisher bekannten Möglichkeiten der Erhaltung konstanter Konzentrationen des aktiven Enzyms vorgestellt. Es handelt sich dabei um Autokatalyse und um einseitige Sättigung einer der beiden Reaktionen.

I. Reversible Phosphorylierung als Grundlage

In der einfachsten Form der Phosphorylierungsmöglichkeiten wird ein Protein durch Dephosphory- lierung mittels einer Phosphatase aktiviert und durch Phosphorylierung mittels einer Kinase deakti- viert (Grafik 1) bzw. umgekehrt. Bei diesem Mechanismus wird insgesamt mehr von dem benötigten Enzym produziert, aber nur ein bestimmter Teil durch Phosphorylierung aktiviert. Auf diese Art und Weise kann sich die Zelle schnell auf wechselnde Umweltbedingungen einstellen, indem sie einfach das Protein durch ein Signal an die Kinase bzw. Phosphatase ein- und ausschaltet.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Grafik 1: Signalinduzierte reversible Dephosphorylierung zur Aktivierung von Protein E.

Die reversible Phosphorylierung, wie sie hier dargestellt ist, ist chemisch gesehen eine so genannte O-Phosphorylierung. Als O-Phosphorylierung wird die ATP-abhängige Phosphorylierung von Serin-, Threonin- und Tyrosinresten unter Ausbildung einer Phosphomonoesterbindung bezeichnet. Diese Art der Phosphorylierung wurde zuerst in Eukaryonten entdeckt. Die Bedeutung in Bakterien und Archaea tritt aufgrund biochemischer und genomischer Analysen zunehmend zutage. Die O-Phosphorylierung spielt in Cyanobakterien eine wichtige Rolle bei Adaptionsprozessen unter verschiedenen Bedingungen wie z.B. bei verschiedenen Beleuchtungen, bei Salzstress, bei der Hete- rocystenbildung und bei unterschiedlichen Nährstoffangeboten⁷. In Cyanobakterien wurden diverse Serin-, Threonin- und Tyrosinkinasen und -phosphatasen identifiziert⁸. Ihre physiologischen Bedeu- tungen sind aber bisher nicht bekannt. Die komplette Sequenzierung des Genoms von Anabaena va- riabilis zeigte 76 putative Kinasen und Phosphatasen auf⁹. Das ist bisher die größte Anzahl unter den prokaryontischen Genomen und lässt auf komplexe Signaltransduktionen schließen. Die Dynamik von Signalübertragungsketten (Kinetik) wird gemeinhin durch Differentialgleichungen dargestellt. Im Folgenden werden auf die reversible Phosphorylierung in Grafik 1 zwei verschiedene Differentialgleichungen angewendet. Die Massenwirkungskinetik beruht auf einfacher Stöchiometrie, während die Michaelis-Menten-Kinetik darauf aufbauend noch die Möglichkeit der Sättigung an ei- nem Enzym-Substrat-Komplex berücksichtigt.

1. Massenwirkungskinetik

Unter Außerachtlassung des Signals ergibt sich für Grafik 1 folgende Differentialgleichung mit Massenwirkungskinetik:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Grafik 2: Einstellung des Fließgleichgewichts von E.¹⁰

Die Veränderungen von vP bei verschiedenen Signalstärken (S1<S2<S3) und die Veränderungen von vK in dem System (1) (Grafik 1) können in Abhängigkeit von Ea (bzw. t) separat betrachtet werden (Grafik 3):

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Grafik 3: vP bei verschiedenen Signalstärken und vK in Abhängigkeit von Ea.

Mit steigendem Ea verlagert sich der Fluss zu vK, welches proportional ansteigt, während vP indirekt proportional abnimmt. Mit steigender Signalstärke wird die Abnahme von vP (S) verstärkt. Die Schnittpunkte von vP und vK in Grafik 3 stellen die Fließgleichgewichte dar. An diesen Stellen gilt: vK = vP. Daraus folgt in (1):

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2. Michaelis-Menten-Kinetik

Die Michaelis-Menten-Kinetik berücksichtigt, dass bei enzymatisch katalysierten Reaktionen sich immer ein Enzym-Substrat-Komplex bildet. Durch die Komplexbildung ist es möglich, dass bei Ü- berfluss des Substrates eine Sättigung an der Bindungsstelle des Enzyms eintritt und dadurch eine Höchstgeschwindigkeit vmax = kcat·ET nicht überschritten wird. Diese Kinetik findet sich aufgrund der daraus resultierenden Regulierbarkeit durch ET und der Unabhängigkeit von Schwankungen an vielen enzymatisch gesteuerten Stoffwechselwegen.

Durch Anwendung von Michaelis-Menten-Kinetik ergibt sich für die Aktivierung in Grafik 1 folgen- des Schema, wenn man annimmt, dass ein Enzym B sowohl phosphoryliert als auch dephosphory- liert¹¹:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

In dem von Gleichung (2) beschriebenen System, stellt sich mit der Zeit ein Fließgleichgewicht ein (Grafik 4)¹²:

Grafik 4: Einstellung des Fließgleichgewichts von Ea.

Das Fließgleichgewicht kann man durch Variation der Parameter in (3) ändern (Grafik 5)¹³:

Grafik 5: Einstellung des Fließgleichgewichts von Ea bei verschiedenen Konzentrationen der Phosphatase P.

Um die vollständige Abhängigkeit des Fließgleichgewichts von P zu erhalten, muss Gleichung (3) im Fließgleichgewicht umgestellt werden (mit KmP = KmK = Km) zu:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Mit dem Befehl „fzero“ kann in Matlab die Nullstelle numerisch berechnet werden. Wenn man dies mehrmals hintereinander für verschiedene P ausführt, erhält man ein Feld mit den jeweiligen Fließgleichgewichten von Ea¹⁴:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Grafik 6: Veränderung des Fließgleichgewichts von Ea in Abhängigkeit von P.

Es zeigt sich in Grafik 6, dass

‾‾‾

Ea linear von P abhängig ist.

‾‾‾

Ea kann daher durch P bzw. ein

Signal exakt eingestellt werden. Dies ist für die Regulierung der Phosphorylierung bzw. der Verzweigung nötig.

b. Veränderung von v1 und v2

Die Veränderungen von v2 und v1 bei verschiedenen Signalstärken (Kinasestärken) lassen sich darstellen (Grafik 7). Dabei ist das Verhalten ähnlich zu dem unter Massenwirkungskinetik (Grafik 3), nur dass keine linearen, sondern hyperbolische Kurven zu beobachten sind. Auch hier nimmt v1 bei höherem S von einem höheren Niveau schneller ab.

Grafik 7: v1 (durchgezogen) und v2 (gestrichelt) bei verschiedenem S in Abhängigkeit von Ea.

c. Signalantwortverhalten

Das Signalantwortverhalten lässt sich darstellen (Grafik 8)¹⁵, indem man (3) mit der Annahme E + Ea = ET = konst. = 1 im Fließgleichgewicht umformt:

kP·P

SK =

(KmP + Ea)(1 -Ea)

kK·K = Ea(KmK + 1 - Ea)

SK (P) stelle bei festgehaltener Kinase K das Signal dar.

Es gelte wieder: Km = KmP = KmK:

Grafik 8: Signalantwortverhalten bei reversibler Phosphorylierung. Je kleiner der Km-Wert, desto abrupter ist die Antwort. Ultrasensitivität tritt bei Km=0.01 auf.

Es tritt bei der Aktivierung von E "Ultrasensitivität" auf, wenn der Km-Wert klein ist (Grafik 8). In diesem Spezialfall schnellt bei einer kritischen Signalstärke die Signalantwort, vergleichbar einem Schalter, abrupt in die Höhe. Das Phänomen ist bekannt als Goldbeter-Koshland-Schalter¹⁶. Dadurch können binäre Einstellungen hervorgerufen werden. Eine solche Art der Regulierung dient Zellen zum An- und Abschalten von Enzymen und anderen Proteinen.

II. Beeinflussbarkeit der Konzentration des aktiven Enzyms

Die Konzentration des aktiven Proteins ist Schwankungen ausgesetzt¹⁷. Um die Störfaktoren zu zei- gen, reicht es, das System mit Massenwirkungskinetik gemäß (1) im Fließgleichgewicht zu betrach- ten:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

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¹ Kennelly et al. 1999.

² Pearson et al. 2001.

³ Goldbeter et al. 1981.

⁴ Stock et al. 1989.

⁵ Kaufmann et al. 2007.

⁶ LaPorte et al. 1985.

⁷ Sanders et al. 1989; Hagemann et al. 1993; Mann 1994.

⁸ Zhang et al. 2005.

⁹ Zhang et al. 2005, Table 1.

¹⁰ Anhang zu Grafik 2.

¹¹ Shinar et al. 2009.

¹² Anhang zu Grafik 4.

¹³ Anhang zu Grafik 5.

¹⁴ Anhang zu Grafik 6.

¹⁵ Anhang zu Grafik 8.

¹⁶ Goldbeter et al. 1981.

¹⁷ Kaufmann et al. 2007.