Die Xenotransplantation vom Schwein auf den Menschen ist mit dem Risiko der Übertragung von porzinen endogenen Retroviren (PERVs) verbunden, die im Genom jeder Zelle des Schweins integriert sind und sich nicht durch DPF-(designated pathogen free) Zucht eliminieren lassen. PERVs infizieren humane Zellen in vitro, womit die Möglichkeit einer in vivo Infektion des humanen immunsuppremierten Rezipienten nicht ausgeschlossen werden kann. In den letzten Jahren wurde deshalb nach Möglichkeiten gesucht, die Übertragung zu verhindern. Die RNA-Interferenz stellt hierbei eine vielversprechende Strategie dar, da sie die Replikation von PERV posttranskriptional unterbinden kann. So gelang es, transgene Schweine zu generieren, die in der Lage waren, shRNAs stabil zu exprimieren.
In isolierten primären Fibroblasten der transgenen Schweine wurde das fluoreszierende GFP mittels Fluoreszenzmikroskopie sowie die Integration des Transgens mittels PCR nachgewiesen, indem zum einen das gfp-Gen und der verwendete lentivirale Vektor, als auch die Expressionskassette der shRNA detektiert wurden. Alle entnommenen primären Fibroblasten enthielten Proviren der Subtypen A, B und C, die mittels PCR nachgewiesen wurden. Zudem konnte die Expression der Volllängen-mRNA sowie gespleißter env-mRNA mittels RT-PCR gezeigt werden. Um die Sensitivität der Nachweismethoden der PERV-Expression zu erhöhen, wurde eine neue one-step RT real-time PCR unter Verwendung neuer Primer und Sonde etabliert. Dadurch konnte eine verbesserte Detektion der shRNA-induzierten Hemmung der PERV-Expression um bis zu 93 % anstelle früherer 70 % nachgewiesen werden.
Um die Effektivität der RNA-Interferenz weiter zu erhöhen, wurden neue PERV-mRNA-spezifische shRNAs generiert und mit der bisher verwendeten shRNA zu Tandems kombiniert. Nach der Klonierung der Expressionskassetten in einen retroviralen Vektor und der Transfektion in eine Verpackungszelllinie, konnten keine retroviralen Partikel nachgewiesen werden. Die Zielzellen PK15- und PERV-A/C-infizierten 293 wurden daraufhin direkt transfiziert. Die quantitative Bestimmung der PERV-Expression erfolgte molekularbiologisch mittels one-step RT real-time PCR und proteinchemisch mittels Western Blot...
Inhaltsverzeichnis
- Einleitung
- Xenotransplantation
- Mangel an Allotransplantaten
- Alternativen zur Allotransplantation
- Risiken der Xenotransplantation
- Immunologische Abstoßungsreaktionen
- Physiologische Inkompatibilität
- Potentielle Übertragung von porzinen Mikroorganismen
- Retroviren
- Taxonomie der Retroviren
- Morphologie der Retroviren
- Retrovirale Genomstruktur
- Retrovirale Replikation
- Porzine endogene Retroviren (PERVs)
- RNA-Interferenz
- Zielsetzung
- Material und Methoden
- Material
- Bakterienstämme
- Enzyme
- Oligonukleotide
- Plasmide
- Antikörper
- Eukaryotische Zellen
- Versuchstiere
- Nährmedien und Lösungen
- Kommerzielle Kits
- Hersteller
- Methoden
- Mikrobiologische Methoden
- Stammhaltung von Bakterien
- Kultivierung von Bakterien
- Herstellung kompetenter Bakterien und Transformation durch Hitzeschock
- Molekularbiologische Methoden
- Isolierung von Plasmid-DNA
- Isolierung genomischer DNA aus eukaryotischen Zellen
- Phenol-Chloroform-Extraktion
- Isolierung von Gesamt-RNA aus eukaryotischen Zellen
- Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
- Restriktion von DNA
- Ligation von DNA-Fragmenten
- Agarosegelelektrophorese
- Gelextraktion linearer DNA-Fragmente
- PCR (Polymerase Chain Reaction)
- one-step RT (Reverse Transcriptase) PCR
- one-step RT (Reverse Transcriptase) real-time PCR
- DNA-Sequenzierung
- Proteinchemische Methoden
- Isolierung von Gesamtprotein aus eukaryotischen Zellen
- Bestimmung der Proteinkonzentration
- SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE)
- Western Blot-Analyse
- Zellbiologische Methoden
- Kultivierung eukaryotischer Zellen
- Kryokonservierung eukaryotischer Zellen
- Zellzählung und Vitalitätsbestimmung mit Trypanblau
- Transfektion eukaryotischer Zellen mit Plasmid-DNA
- Ergebnisse
- Hemmung der PERV-Expression in Fibroblasten Pol2-shRNA-transgener Schweine
- Generierung shRNA-transgener Schweine mittels Nukleus-Transfer
- Nachweis der Transgen-Integration mittels Fluoreszenz
- Nachweis der Transgen-Integration mittels PCR
- Etablierung einer one-step RT real-time PCR zur Quantifizierung der PERV-mRNA
- Qualitativer Nachweis von PERV in primären Fibroblasten transgener Schweine
- Quantitativer Nachweis der PERV-Expression in primären Fibroblasten transgener Schweine
- Hemmung der PERV-Expression in PK15- und PERV-A/C infizierten 293-Zellen mittels neu synthetisierter shRNAs
- Selektion eines PERV-A/C infizierten 293-Klons zur Generierung einer Zelllinie mit gleicher Provirusintegration
- Generierung und Klonierung neuer Expressionskassetten für PERV-spezifische-shRNAs
- Stabile Transfektion von PK15- und PERV-A/C-infizierten 293-Zellen mit shRNA-Expressionskassetten
- Nachweis der shRNA-Expressionskassetten in PK15- und PERV-A/C-infizierten 293-Zellen
- Xenotransplantation und ihre Risiken, insbesondere die Übertragung von PERVs
- Die Funktionsweise von RNA-Interferenz und ihre Anwendung in der PERV-Hemmung
- Die Entwicklung und Validierung von shRNA-Expressionskassetten zur gezielten PERV-Silencing
- Die Untersuchung der Effektivität der shRNA-vermittelten PERV-Hemmung in verschiedenen Zellmodellen
- Die potentielle Anwendung der Ergebnisse für die zukünftige Entwicklung von PERV-resistenten Spenderorganen
Zielsetzung und Themenschwerpunkte
Die vorliegende Diplomarbeit beschäftigt sich mit der Hemmung der Expression von porzinen endogenen Retroviren (PERVs) mittels RNA-Interferenz. Ziel ist es, neue Ansätze zur Reduktion des PERV-Risikos in der Xenotransplantation zu entwickeln.
Zusammenfassung der Kapitel
Die Einleitung gibt einen Überblick über die Xenotransplantation, ihre Risiken und die Rolle von PERVs in diesem Kontext. Die RNA-Interferenz als potenzielles Werkzeug zur PERV-Hemmung wird vorgestellt und die Zielsetzung der Arbeit erläutert.
Das Kapitel "Material und Methoden" beschreibt die verwendeten Materialien, inklusive Bakterienstämme, Enzyme, Oligonukleotide, Plasmide, Antikörper, eukaryotische Zellen, Versuchstiere, Nährmedien und Lösungen. Die wichtigsten molekularbiologischen und zellbiologischen Methoden werden detailliert dargestellt.
Die Ergebnisse der Arbeit werden im Kapitel "Ergebnisse" präsentiert. Es werden die Ergebnisse der Generierung shRNA-transgener Schweine, die Validierung der shRNA-Expressionskassetten und die Untersuchung der PERV-Hemmung in verschiedenen Zellmodellen dargestellt.
Schlüsselwörter
Xenotransplantation, porzine endogene Retroviren (PERVs), RNA-Interferenz, shRNA, PERV-Hemmung, Zellkultur, Transfektion, PCR, real-time PCR, Western Blot
- Arbeit zitieren
- Christoph Kruse (Autor:in), 2009, Hemmung der Expression von porzinen endogenen Retroviren (PERVs) mittels RNA-Interferenz, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/147451
