Hemmung der Expression von porzinen endogenen Retroviren (PERVs) mittels RNA-Interferenz

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis

Tabellenverzeichnis

1 Einleitung
1.1 Xenotransplantation
1.1.1 Mangel an Allotransplantaten
1.1.2 Alternativen zur Allotransplantation
1.1.3 Risiken der Xenotransplantation
1.1.3.1 Immunologische Abstoßungsreaktionen
1.1.3.2 Physiologische Inkompatibilität
1.1.3.3 Potentielle Übertragung von porzinen Mikroorganismen
1.2 Retroviren
1.2.1 Taxonomie der Retroviren
1.2.2 Morphologie der Retroviren
1.2.3 Retrovirale Genomstruktur
1.2.4 Retrovirale Replikation
1.2.5 Porzine endogene Retroviren (PERVs)
1.3 RNA-Interferenz
1.4 Zielsetzung

2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Bakterienstämme
2.1.2 Enzyme
2.1.3 Oligonukleotide
2.1.4 Plasmide
2.1.5 Antikörper
2.1.6 Eukaryotische Zellen
2.1.7 Versuchstiere
2.1.8 Nährmedien und Lösungen
2.1.9 Kommerzielle Kits
2.1.10 Hersteller
2.2 Methoden
2.2.1 Mikrobiologische Methoden
2.2.1.1 Stammhaltung von Bakterien
2.2.1.2 Kultivierung von Bakterien
2.2.1.3 Herstellung kompetenter Bakterien und Transformation durch Hitzeschock
2.2.2 Molekularbiologische Methoden
2.2.2.1 Isolierung von Plasmid-DNA
2.2.2.2 Isolierung genomischer DNA aus eukaryotischen Zellen
2.2.2.3 Phenol-Chloroform-Extraktion
2.2.2.4 Isolierung von Gesamt-RNA aus eukaryotischen Zellen
2.2.2.5 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
2.2.2.6 Restriktion von DNA
2.2.2.7 Ligation von DNA-Fragmenten
2.2.2.8 Agarosegelelektrophorese
2.2.2.9 Gelextraktion linearer DNA-Fragmente
2.2.2.10 PCR (Polymerase Chain Reaction)
2.2.2.11 one-step RT (Reverse Transcriptase) PCR
2.2.2.12 one-step RT (Reverse Transcriptase) real-time PCR
2.2.2.13 DNA-Sequenzierung
2.2.3 Proteinchemische Methoden
2.2.3.1 Isolierung von Gesamtprotein aus eukaryotischen Zellen
2.2.3.2 Bestimmung der Proteinkonzentration
2.2.3.3 SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE)
2.2.3.4 Western Blot-Analyse
2.2.4 Zellbiologische Methoden
2.2.4.1 Kultivierung eukaryotischer Zellen
2.2.4.2 Kryokonservierung eukaryotischer Zellen
2.2.4.3 Zellzählung und Vitalitätsbestimmung mit Trypanblau
2.2.4.4 Transfektion eukaryotischer Zellen mit Plasmid-DNA

3 Ergebnisse
3.1 Hemmung der PERV-Expression in Fibroblasten Pol2-shRNA-transgener Schweine
3.1.1 Generierung shRNA-transgener Schweine mittels Nukleus-Transfer
3.1.2 Nachweis der Transgen-Integration mittels Fluoreszenz
3.1.3 Nachweis der Transgen-Integration mittels PCR
3.1.4 Etablierung einer one-step RT real-time PCR zur Quantifizierung der PERV- mRNA
3.1.5 Qualitativer Nachweis von PERV in primären Fibroblasten transgener Schweine
3.1.6 Quantitativer Nachweis der PERV-Expression in primären Fibroblasten transgener Schweine
3.2 Hemmung der PERV-Expression in PK15- und PERV-A/C infizierten 293-Zellen mittels neu synthetisierter shRNAs
3.2.1 Selektion eines PERV-A/C infizierten 293-Klons zur Generierung einer Zelllinie mit gleicher Provirusintegration
3.2.2 Generierung und Klonierung neuer Expressionskassetten für PERV- spezifische-shRNAs
3.2.3 Stabile Transfektion von PK15- und PERV-A/C-infizierten 293-Zellen mit shRNA-Expressionskassetten
3.2.4 Nachweis der shRNA-Expressionskassetten in PK15- und PERV-A/C-infizierten 293-Zellen
3.2.5 Quantitativer Nachweis der PERV-Expression in shRNA-transgenen Zellen auf Molekularebene
3.2.6 Quantitativer Nachweis der PERV-Expression in shRNA-transgenen PK15- Zellen auf Proteinebene

4 Diskussion
4.1 shRNA-spezifische Hemmung der PERV-Expression in transgenen Schweinen
4.2 Effizienzsteigerung der PERV-Expressionshemmung durch neu generierte shRNAs

5 Zusammenfassung

Literaturverzeichnis

Danksagung

Abkürzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1.1: Aufbau eines γ-Retrovirus

Abbildung 1.2: Genomstruktur der Retroviren

Abbildung 1.3: Bildung doppelsträngiger DNA aus einzelsträngiger RNA im Zuge der Retrovirus-Replikation

Abbildung 1.4: Rasterelektronische Aufnahme von porzinen endogenen Retroviren (PERVs)

Abbildung 1.5: Schematische Darstellung des RNAi-Mechanismus

Abbildung 2.1: pSuper [Oligoengine, Seattle, WA, USA]

Abbildung 2.2: RNAi-Ready pSiren-RetroQ [Clontech, Mountain View, CA, USA]

Abbildung 2.3: Funktionsweise der TaqMan-Sonden Hydrolyse

Abbildung 3.1: Schematische Darstellung des lentiviralen Vektors plVTHM

Abbildung 3.2: shRNA-transgene Ferkel unter Bestrahlung mit VIS- und UV-Licht

Abbildung 3.3: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen primärer porziner Fibroblasten

Abbildung 3.4: Schematische Darstellung der Position der verwendeten Primersets im Vektor

Abbildung 3.5: Transgennachweis im Genom primärer porziner Fibroblasten mittels PCR unter Verwendung der GFP-Primer

Abbildung 3.6: Transgennachweis im Genom primärer porziner Fibroblasten mittels PCR unter Verwendung der 3’LTR-Primer

Abbildung 3.7: Transgennachweis im Genom primärer porziner Fibroblasten mittels PCR unter Verwendung der shRNA-Pol2-Primer

Abbildung 3.8: Bestimmung der Effizienz in einer one-step RT real-time PCR

Abbildung 3.9: Qualitativer Nachweis der PERV Provirus-Integration in primären porzinen Fibroblasten, PK15- und PERV-A/C-inf. 293-Zellen

Abbildung 3.10: Qualitativer Nachweis der PERV-Expression in primären porzinen

Fibroblasten, PK15- und PERV-A/C-inf. 293-Zellen

Abbildung 3.11: Quantitativer PERV-Expressionsnachweis in Fibroblasten transgener Schweine

Abbildung 3.12: Provirusnachweis in de novo PERV-A/C-infizierter 293-Zellen

Abbildung 3.13: Bindungsstellen der generierten shRNAs auf der mRNA von PERV

Abbildung 3.14: Schematische Darstellung der Klonierungsstrategie

Abbildung 3.15: Nachweis der shRNA-Expressionskassetten in PK15- und PERV-A/C- infizierten 293-Zellen

Abbildung 3.16: Relative PERV-Expression einzelner Zelllinien

Abbildung 3.17: shRNA-induzierte Hemmung der PERV-Expression in PK15-Zellen

Abbildung 3.18: shRNA-induzierte Hemmung der PERV-Expression in PERV-A/C-infizierten 293-Zellen

Abbildung 3.19: Hemmung der p60Gag-Expression durch stabil transfizierte shRNAs in PK15-Zellen

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1.1: Charakteristische Vertreter der Retroviren (modifiziert nach Modrow, 2003)

Tabelle 2.1: Komponenten und Temperaturprogramm einer Standard-PCR

Tabelle 2.2: Komponenten und Temperaturprogramm einer one-step RT-PCR

Tabelle 2.3: Komponenten und Temperaturprogramm einer one-step RT real-time PCR

Tabelle 2.4: Komponenten und Temperaturprogramm einer Sequenzierungs-PCR

Tabelle 2.5: Komponenten eines Sammel- und Trenngels für die diskontinuierliche SDS- PAGE

Tabelle 3.1: Komponenten und Temperaturprogramm der duplex one-step RT real-time PCR

Tabelle 3.2: Auflistung der transfizierten shRNA-Expressionskassetten

1 Einleitung

1.1 Xenotransplantation

1.1.1 Mangel an Allotransplantaten

Die Allotransplantation (gr. allos: anders), d. h. die Übertragung von Zellen, Geweben und Organen zwischen genetisch verschiedenen Individuen derselben Spezies, hat sich in der Medizin inzwischen zu einer weit verbreiteten Methode etabliert.

Schon 1906 gelang dem österreichischen Augenarzt Zirm die erste erfolgreiche Horn- hauttransplantation mit einer menschlichen Hornhaut[1]. Zu Beginn des 20. Jahrhunderts entwickelten sich mit ausgedehnten Fortschritten auf dem Gebiet der Gefäßchirurgie die Voraussetzungen zur Transplantation von Organen. So führte der Ukrainer Voronoy 1933 die erste Nierentransplantation von einem verstorbenen Spender durch, die jedoch aufgrund von immunologischen Abstoßungsreaktionen des Empfängers nicht erfolgreich war[2]. Erst die Entwicklung von Immunsuppressiva Anfang der sechziger Jahre verhalf der Transplan- tationstechnologie zum Durchbruch. 1967 erfolgte die erste erfolgreiche Herztransplantation durch den südafrikanischen Herzchirurgen Banard[3], der damit einen Meilenstein in der Geschichte der Allotransplantation setzte.

In Deutschland gibt es zurzeit 50 Einrichtungen, die für die Übertragung von Organen zugelassen sind. Von 1963 bis 2007 wurden fast 89 000 Organe transplantiert, darunter hauptsächlich Nieren und Leber, aber auch Herz, Lunge, Pankreas und Dünndarm [Deutsche Stiftung Organtransplantation (DSO) 2007]. Das deutsche Transplantationsgesetz (TPG), welches 1997 in Kraft trat, regelt die Spende, Entnahme, Vermittlung und Übertragung von Organen, die nach dem Tod oder zu Lebzeiten gespendet werden. Trotz europaweiter Koordination und Verteilung von geeigneten Transplantaten [Eurotransplant International Foundation], herrscht ein akuter Organmangel. Im Jahr 2007 warteten ca. 8 000 Dialysepatienten in Deutschland auf eine geeignete Spenderniere. Die Zahl war damit fast dreimal so hoch, wie die der im selben Jahr transplantierten 2907 Nieren. Rund 30 % der Patienten auf der Warteliste verstarben, weil das gewünschte Transplantat nicht zur Verfügung stand [DSO, 2007]. Die schon ohnehin abnehmende Spendenbereitschaft vieler potentieller Organspender wird zusätzlich durch die öffentliche Diskussion des Hirntodes, der in vielen Ländern den Zeitpunkt der Organentnahme festsetzt und die damit verbundene Angst vor einer vorzeitigen Extransplantation[4]erschwert. Zudem fördert das Defizit an Spendertransplantaten den kriminellen Handel mit Organen, vor allem in Ländern, in denen dieser nicht gesetzlich verboten ist[5].

Um dem eklatanten Mangel an Allotransplantaten zumindest zeitweise beizukommen, ist es notwendig, geeignete Alternativen zu finden.

1.1.2 Alternativen zur Allotransplantation

In der modernen Medizin wurden bis heute mehrere Ansätze entwickelt, von denen einige vielversprechende Alternativen zur klassischen Allotransplantation darstellen. Eine Möglichkeit bieten künstliche Transplantate, die die Aufgaben von Organen oder Teile davon übernehmen. Der Herzchirurg DeBakey implantierte schon 1966 einer Mexikanerin eine Pumpe, die temporär die linke Herzkammer unterstützte[6]. Drei Jahre später wurde durch den Amerikaner Cooley erstmals ein total implantierbares, pneumatisch betriebenes Kunstherz einem Patienten eingesetzt, welches für 64 Stunden die Perfusion übernahm, bis dann die Herztransplantation durchgeführt werden konnte[7]. Verschiedene Probleme haben jedoch über Jahrzehnte die Entwicklung der Kunstherzen begleitet, und teilweise sind befriedigende Lösungen bis heute noch nicht vollständig realisiert. Seit 1945, als es dem Internisten Willem Kolff gelang, eine Patientin mit akutem Nierenversagen mit einer eigens entwickelten Trommelniere aus Zellophanröhren zu dialysieren[8], sind auch im Bereich der Dialysebehandlung mit Hilfe der künstlichen Niere große Fortschritte gemacht worden. Dennoch ist die Dialyse keine Dauerlösung, da sich mit der Zeit große Mengen an Schadstoffen im But ansammeln, die zu schweren Folgeerkrankungen führen können. Organe mit komplexen Stoffwechselmechanismen, wie beispielsweise der Leber, sind zurzeit durch maschinelle, künstlich geschaffene Transplantate nicht zu ersetzen. Eine weitere Möglichkeit stellt die Züchtung von morphologisch ähnlichen Organen aus humanen Stammzellen dar. Durch „tissue-engineering“ lassen sich bereits heute einfache autologe Zellverbände im großen Maßstab produzieren. Mit diesem gezüchteten Gewebe können Heilungsprozesse (beispielsweise offene Wunden) unterstützt, funktionsuntauglich gewordenes Gewebe (beispielsweise Knorpelgewebe in den Gelenken) regeneriert, sowie zerstörte Gewebe (beispielsweise verbrannte Haut) ersetzt werden[9]. Auch die Reparatur geschädigter Herzklappen oder der Luftröhre durch „tissue-engineering“ zeigt ermutigende Fortschritte[10]. Das Fernziel ist die Züchtung von komplexen Geweben und Organen. Dafür ist es notwendig, alle für die Ausdifferenzierung notwendigen Faktoren der Zelle zu kennen, um beispielsweise auch das Entstehen von Karzinomen zu unterbinden.

Eine weitere sehr erfolgsversprechende Alternative stellt die Xenotransplantation (gr. xénos: Fremder) dar, bei der es sich um die Übertragung von lebens- und funktionstüchtigen Zellen oder Zellverbänden sowie ganzer Organe zwischen verschiedenen Spezies handelt. Bereits im 17. Jahrhundert gab es Experimente, zerstörte menschliche Haut durch Gewebe von Tieren zu ersetzen. Erste Versuche der Nierentransplantation vom Tier auf den Menschen gab es 1906 durch Mathieu Jabouly, die jedoch scheiterten. Ebenso vergeblich versuchte Unger 1910 die Übertragung einer Rhesusaffenniere auf den Menschen. Bis zur Entwicklung der ersten Immunsuppressiva waren alle weiteren Versuche einer Xenotransplantation aufgrund der hyperakuten Abstoßung des Immunsystems erfolglos. Erst 1964 gelang den Chirurgen Oscar Creech und Keith Reemtsma die Transplantation der Nieren eines Schimpansen[11]. Der Patient lebte noch neun Monate nach der Operation. 1984 verpflanzte der amerikanische Arzt Leonard Bailey ein Pavianherz in ein mit schwerem Herzfehler neugeborenes Mädchen[12], welches nach 21 Tagen an multiplem Organversagen verstarb. In den Jahren 1992 und 1994 folgten weitere Trans- plantationsversuche mit Herz und Leber, die jedoch erneut zu einer hyperakuten Abstoßung mit letalem Ausgang führten[13]. Trotz fortschreitender Weiterentwicklung der Immunsuppressiva und stetig wachsendem Wissen über immunologische Abstoßungsreaktionen, können solide Xenotransplantate derzeit nicht übertragen werden.

Wesentlich weiter ist man schon im Bereich der Transplantation von tierischen Zellen und Zellverbänden auf den Menschen. So verspricht der Einsatz von verkapselten, fötalen porzinen Inselzellen bei Diabetes mellitus Typ I Patienten eine deutliche Verbesserung der Blutzuckerkontrolle[14]. Die Einbettung der Inselzellen in Alginat und die damit verbundene räumliche Trennung des Immunsystems des Rezipienten und des xenogenen Transplantats verhindert die für gewöhnlich auftretende starke Immunantwort, was den Einsatz von Immunsuppressiva überflüssig macht. Zusätzlich wird die Übertragung von porzinen endogenen Retroviren und weiteren Mikroorganismen stark eingeschränkt[15](1.1.3). Auch bei Parkinson- und Huntington-Patienten wurden klinische Studien zur Transplantation porziner Neurone durchgeführt, die zu positiven Ergebnissen führten [16][17]. Des Weiteren wurden schon porzine Hepatozyten als unterstützende Therapie in bioartifiziellen ex vivo Reaktoren eingesetzt, um die lebensbedrohliche Situation nach akutem Leberversagen zu überbrücken [18][19].

1.1.3 Risiken der Xenotransplantation

In der Vergangenheit wurden nicht-humane Primaten aufgrund der nahen Verwandtschaft zum Menschen als Spendertiere für die Xenotransplantation in Erwägung gezogen. Gerade bei Schimpansen weisen Anatomie und Physiologie der Organe sowie die Blutgruppen eine hohe Übereinstimmung mit denen des Menschen auf. Zudem ist die immunologische Abstoßungsgefahr des Rezipienten nach der Organverpflanzung im Vergleich zu anderen Spendertieren nur gering. Allerdings erweist sich die geringe Nachkommenschaft und die lange Tragezeit der Primaten als erheblicher Nachteil, da keine geeignete Anzahl an Spendertieren zu gewährleisten ist. Neben den ethischen Bedenken und dem strengen Artenschutz kommt hinzu, dass die DPF (designated pathogen free)-Haltung und Aufzucht der Tiere extrem kostspielig ist. Das Hauptproblem stellt aber die hohe mikrobielle Durchseuchung der Primaten dar. Aufgrund der phylogenetischen Nähe zum Menschen ist die Gefahr von Zoonosen (Übertragung von Infektionskrankheiten von Tier auf Mensch) besonders groß, insbesondere wenn das Immunsystem des Rezipienten durch Immun- suppressiva geschwächt ist. So wurde in klinischen Studien bei einer Transplantation von einer Pavianleber auf den Menschen die Übertragung des Simian Foamy Virus (SFV), des endogenen Pavian Retrovirus (BaEV) und des Cytomegalievirus (CMV) nachgewiesen [20][21].

Momentan werden daher Schweine als Organquelle für die Xenotransplantation favorisiert. Ihre Physiologie und Organgröße ist denen des Menschen ähnlich [22][23], die Tragezeit ist kurz und die Zahl der Nachkommen liegt etwa bei 10 bis 18 Tieren. Darüber hinaus sind die Kosten für DPF-Haltung und Aufzucht wesentlich geringer. Des Weiteren lassen sich gentechnisch veränderte und transgene Schweine leicht generieren. Dennoch gibt es auch beim Schwein als Spendertier noch einige Hürden zu überwinden, um eine komplikationslose Transplantation zu garantieren.

1.1.3.1 Immunologische Abstoßungsreaktionen

Das erste ernst zu nehmende Problem stellen die Abstoßungsreaktionen durch das Immunsystem des humanen Organempfängers dar. Was ansonsten bei der Abwehr pathogener Keime wie Parasiten, Bakterien und Viren erwünscht ist, führt bei der Transplantation zu einer Zerstörung des xenogenen Organs. Verantwortlich dafür sind unter anderem die T-Zell-Antworten des Menschen gegen die hochpolymorphen MHC (major histocompatibility complex)-Moleküle. Diese unterscheiden sich bei Schweinen deutlich von denen des Menschen, weswegen das Ausmaß der Abstoßungsreaktion im Vergleich zur Allotransplantation noch größer ist.

Die erste Stufe der Abstoßungsreaktion erfolgt schon innerhalb von 24 Stunden nach der Transplantation und wird als hyperakute Abstoßung bezeichnet. Spezifische Immunglobuline (IgGs) des humanen Organismus erkennen Epitope von Galactosyl-α-1,3-galactosyl-Resten auf der Oberfläche von Bakterien und binden an diese. Das daraufhin aktivierte Komplementsystem führt zur Zerstörung der Pathogene. Unglücklicherweise richten sich diese Antikörper auch gegen Epitope von porzinen Endothelzellen der Organgefäße, welche auf der Oberfläche der Zellen aller Säuger mit Ausnahme des Menschen und der Altwelt- Affen zu finden sind[24]. Dabei kommt es durch die Komplement- und Gerinnungskaskade zum Gefäßverschluss im Transplantat und damit zum Absterben des Organs. Um die hyperakute Abstoßung zu verhindern, wurden porzine Oligosaccharide verwendet, die die präformierten Antikörper gegen Gal-α-1,3-gal binden und deren Zytotoxizität vermindern[25]. Mittlerweile ist jedoch gelungen, transgene α-1,3-Galactosyltransferase knock-out- Schweine zu züchten, die das Gal-α-1,3-gal-Epitop nicht mehr auf der Oberfläche von Endothelzellen tragen. Zusätzlich konnten die porzinen Komplement-regulatorischen Proteine wie CD46, CD55 und CD59 durch humane Varianten ersetzt werden [26][27][28].

Einige Tage nach der Xenotransplantation tritt die akut vaskuläre Abstoßung auf, die ebenfalls durch humane Antikörper gegen Kohlenhydrat-Epitope ausgelöst wird. Daraufhin setzt erneut die Komplementaktivierung mit den oben beschriebenen Auswirkungen ein. Zusätzlich kommt es zu einer starken Bildung von Adhäsionsmolekülen, wie Selektinen und Integrinen, was eine vermehrte Anlagerung von natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) und Monozyten als Folge hat und zu einem Verlust der ansonsten antithrombogenen Eigenschaft des Endothels führt[29]. Zudem wurde ein erhöhter Titer von anti-porzinen IgMs im Blut beobachtet. Diese lassen sich inzwischen mittels IgM-Depletion oder mit Einsatz von monoklonalen anti-IgM-Antikörpern neutralisieren.

Da sich MHC-Moleküle bei Schweinen und Menschen auf der Oberfläche von Zellen stark unterscheiden, lösen die fremden MHC-Moleküle auf dem Transplantat eine weitere Immunreaktion aus. Dies führt zur akuten T-Zell-vermittelten Abstoßung des Organs. Die direkte Erkennung des übertragenen Organs erfolgt über T-Zellen, deren Rezeptoren für das xenogene MHC-Klasse-I- oder Klasse-II-Molekül in Kombination mit einem Peptid spezifisch sind. Dabei werden die T-Zellen durch Antigen-präsentierende Zellen (APCs) des Spenders, die gleichzeitig auch kostimulierend wirken, aktiviert. Bei einem zweiten Mechanismus führt die Aufnahme von xenogenen Proteinen durch APCs des Empfängers und Präsentation durch eigene MHC-Moleküle zur Aktivierung der T-Zellen (indirekte Erkennung). In beiden Fällen kommt es zur Degeneration des xenogenen Transplantats und somit zur Abstoßung innerhalb weniger Tage oder Wochen. Obwohl xenogene Zellen vom Schwein auf T-Zellen weitaus immunogener wirken als allogene, sind die gesammelten Erfahrungen auf dem Gebiet der Immunsuppressiva auch bei der Xenotransplantation von großem Nutzen [30][31].

Die Hauptursache für ein nach Monaten oder Jahren eintretendes Organversagen ist die chronische Abstoßung, die durch konzentrische arteriosklerotische Ablagerung in den Blutgefäßen des Transplantats, begleitet von glomerulärer und tubulärerer Fibrose und Atrophie, gekennzeichnet ist. Durch xenoreaktive T-Zellen freigesetzte Mediatoren stimulieren die Expression von Adhäsionsmolekülen im Endothel und locken Monocyten an, die zu Makrophagen reifen. Die Produkte der Leukozyten führen zu einer weiteren Mobilisierung von Makrophagen. Die Mediatoren wirken zusammen und verursachen eine chronische Entzündung mit Narbenbildung, sodass es schließlich zum irreversiblen Organ- versagen kommt. IgG-Antikörper rufen zudem in den übertragenen soliden Organen eine beschleunigte Arteriosklerose hervor.

1.1.3.2 Physiologische Inkompatibilität

Eines der weiteren Probleme ist die physiologische Inkompatibilität des porzinen Spender- organs und des humanen Rezipientenorganismus. Während einige physiologische Mecha- nismen, wie z. Bsp. die Insulinproduktion beim Schwein und beim Menschen sehr ähnlich ablaufen, gibt es andere, die vollkommen inkompatibel sind und keine Interaktion erlauben. Freigesetzte Mediatoren, wie z. Bsp. Hormone, Zytokine, Adhäsionsmoleküle sowie Selektine und Integrine, aber auch Enzyme sind meist artspezifisch und können evtl. nur schwer mit dem Zielorgan wechselwirken[32]. Unterscheiden sich die Aminosäure- sequenzen um mehr als 20 %, sind sie für den Empfänger sogar antigen[33]. Proteasen der Gerinnungskaskade sind artspezifisch und somit inkompatibel, was zu einer ungehinderten Koagulation mit letalem Effekt führt. Auch das porzine Parathormon unterscheidet sich in der Aminosäurezusammensetzung signifikant vom menschlichen Pendant. Im Falle einer Nieren- Xenotransplantation führt dies zu einer Hypophosphatämie im Serum, die für den Menschen lebensbedrohlich werden kann. Die Leber, mit sehr komplexen Stoffwechselfunktionen, benötigt eine optimal eingestellte Steuerung der metabolischen und hormonellen Signale und stellt eine besondere Herausforderung an die moderne Medizin dar. Auch im Bereich der Blutgruppen, Blutgerinnung und Blutviskosität sind noch Hindernisse zu überwinden. Ebenfalls ungeklärt ist die Frage der Anpassung der unterschiedlichen Alterungs- geschwindigkeit porziner und humaner Organe. Herz und Niere scheinen dennoch, gerade wegen der relativ wenigen systemisch hormonellen und enzymatischen Funktionen, die ersten Organe zu sein, die in Zukunft klinisch verwendet werden können.

1.1.3.3 Potentielle Übertragung von porzinen Mikroorganismen

Ein weiteres großes Risiko bei der Xenotransplantation stellt die mögliche Übertragung von porzinen Bakterien, Pilzen, Parasiten und Viren auf den Empfänger dar. Bei der Verpflanzung von Organen werden die physikalischen Barrieren des Organismus als Schutz vor Pathogenen umgangen und das Immunsystem supprimiert, was das Infektionsrisiko des Patienten stark erhöht. Infektionskrankheiten, die auf natürlichem Wege vom Tier auf den Menschen übertragen werden, bezeichnet man als Zoonosen. Im Bereich der Xenotransplantation hat man diesen Begriff auf Xenozoonosen oder kurz Xenosen erweitert. Viele der heute bekannten Infektionskrankheiten sind aus Zoonosen hervorgegangen[34]. Die meisten dieser Mikroorganismen sind im natürlichen Wirt apathogen, können jedoch nach der Übertragung auf den humanen Wirtsorganismus z. Bsp. Leukämien oder Immundefizienzen hervorrufen, während andere asymptomatisch bleiben[35]. Das durch humane Immundefizienzviren (HIV) hervorgerufene Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS)[36] und das durch humanpathogene Coronaviren ausgelöste schwere akute Atemnotsyndrom (SARS, servere acute respiratory syndrome)[37], aber auch das Ebola Virus, das Marburg Virus und das H5N1-Influenza Virus sind bekannte Beispiele für eine Transspeziesübertragung.

Viele nicht-virale humanpathogene Erreger des Schweins, wie Toxoplasma gondii, Cryptosporidium parvum, Trichinella spiralis, Strepptococcus suis, Campylobacter coli, Mycobacterium avium, Leptosira interrogans, Brucella suis, Listeria und Erysipelothrix rhusiopathiae [38, 39], lassen sich durch spezielle Zucht und Haltung unter DPFBedingungen aus den Schweinen eliminieren[40].

Eine viel größere Gefahr, im Hinblick auf die Xenotransplantation, geht von Viren aus. So sind Schweine Wirte von einer Vielzahl von Viren, von denen einige beim Menschen Infektionen mit letalem Ausgang hervorrufen können. Ein Schweineinfluenzavirus steht beispielsweise unter dem Verdacht Auslöser der Spanischen Grippe zu sein, der in den Jahren 1918 und 1919 in Europa über 50 Millionen Menschen zum Opfer fielen[41]. Viele weitere humanpathogene Viren, wie das Nipah-Virus, das Enzephalitis Virus (JEV), das Vesicular Stomatitis Virus (VSV), das Swine Vesicular Virus (SVDV), das Tollwutvirus, das Vacciniavirus, das Schweinepapovirus (PPV), das Schweinepockenvirus, das porzine Enzephalomyocarditisvirus und das Herpesvirus lassen sich jedoch auch durch keimfreie Züchtung und Haltung, aus den für die Xenotransplantation vorgesehenen Schweinen, eliminieren. Schwieriger gestaltet sich dies beispielsweise für die Schweinecircoviren PCV 1 und 2, die wahrscheinlich transplazentar übertragen werden können[42]. Zusätzlich besteht das große Risiko einer Infektion mit unbekannten Erregern, die aufgrund ihrer asymptotischen Merkmale im natürlichen Wirt nicht erkannt werden. Die Folgen einer Infektion mit bis dato unbekannten Viren werden am Beispiel des Ebola- und Marburg-Virus [43]sowie des SARS- und HI-Virus[44]verständlich. Porzine endogene Retroviren (PERVs), die im Genom aller Schweine integriert sind, lassen sich ebenfalls nicht durch Zucht und Haltung unter DPF-Bedingungen eliminieren und stellen somit eine zusätzliche Gefahr der Transspeziesübertragung vom Schwein auf den Menschen bei der Xenotransplantation dar [45].

1.2 Retroviren

Viren sind genetische Elemente, die sich unabhängig von den Chromosomen einer Zelle replizieren können, aber nicht unabhängig von Zellen selbst. Die Klasse der Retroviren (lat. retro: rückwärts) verdankt ihren Namen aufgrund der Tatsache, dass diese eine Art umgekehrte Nukleinsäurereplikation haben. Dabei wird ihre RNA mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase in ein DNA-Zwischenprodukt umgeschrieben und in das Wirtsgenom integriert.

Vor fast 100 Jahren wurden Retroviren zum ersten Mal beschrieben. 1908 konnten die dänischen Pathologen Ellermann und Bang zeigen, dass die Leukämie einer Maus durch Ultrafiltrate auf andere Mäuse übertragbar war. Drei Jahre später gelang es dem Pathologen Rous bei gesunden Hühnern mit dem Ultrafiltrat aus Geflügelsarkomen, Tumore zu induzieren[46]. Einen weiteren Hinweis auf das pathogene Potential der Retroviren und ihre Assoziation mit Tumorerkrankungen wurde 1936 von John J. Bittner mit seinen Untersuchungen zur Entstehung von malignen Milchdrüsenerkrankungen der Maus, verursacht durch das mouse mammary tumor virus (MMTV), erbracht. So fand er heraus, dass MMTV nicht nur konventionell durch exogene Partikel übertragen werden konnte (horizontale Transmission), sondern auch als endogener Bestandteil von Zellen der Keimbahn an nachfolgende Generationen (vertikale Transmission). Die ersten und bis jetzt einzigen humanpathogenen Retroviren wurden Anfang der 80er Jahre des 20. Jahrhunderts entdeckt. Dazu zählen die humanen T-Zell-Leukämie-Viren (HTLV-I und HTLV-II) sowie die humanen Immundefizienzviren (HIV-I und HIV-II) [47-49]. Retrovirus-induzierte Erkrankungen sind mit einer Vielzahl unterschiedlicher Symptome assoziiert, wobei Immundefizienzen, Tumore (Lymphome, Sarkome) und neurologische Defekte am häufigsten auftreten. Die Ursachen der Krankheitsbilder sind vielschichtig und vom Genus der Viren abhängig. Heute gehören die Retroviren zu den intensivsten beforschten Erregern in der Virologie und sind von großer Bedeutung für die Gesundheitswissenschaften.

1.2.1 Taxonomie der Retroviren

Retroviren werden zurzeit durch das International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) basierend auf den Unterschieden in der Morphologie, der Genomsequenz, der Wirtsspezifität, den antigenen Eigenschaften und in der Pathogenese in sieben Genera unterteilt: α-, β-, γ-, δ- und ε-Retroviren sowie Lentiviren und Foamyviren. Zusätzlich zu der oben aufgeführten Unterteilung, kann man bei Retroviren zwischen exogenen und endogenen Viren unterscheiden. Exogene Retroviren sind zur Expression aller retroviraler Proteine und somit auch zur Partikelfreisetzung im Stande und können horizontal von Organismus zu Organismus übertragen werden. Endogene Retroviren sind hingegen im Genom aller Zellen ihrer Wirtsspezies integriert und werden vertikal, aber auch horizontal über die Keimzellen übertragen[50]. Alle untersuchten Vertebraten besitzen hauptsächlich defekte endogene Retroviren als Bestandteil ihres Erbgutes[51], die z. Bsp. bis zu acht Prozent des menschlichen Genoms ausmachen[52]. Die genetische Information der meisten endogenen Retroviren ist soweit deletiert, dass keine intakten Partikel mehr gebildet werden können. Dennoch gibt es einige, wie das porzine endogene Retrovirus (PERV), die in der Lage sind, exogene infektiöse Virionen zu produzieren.

Tabelle 1.1: Charakteristische Vertreter der Retroviren (modifiziert nach Modrow, 2003)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Man fand zudem heraus, dass endogene Retroviren eine wichtige Rolle in der Biologie des Wirtes spielen. So wurde die Regulation von Transkriptions- und Translationsvorgängen[53], die Kontrolle von Zellfusionsprozessen während der plazentalen Entwicklung [54, 55] und die Vermittlung von Resistenzen gegenüber exogenen retroviralen Infektionen[56]beschrieben.

1.2.2 Morphologie der Retroviren

Infektiöse Retroviren gehören zu den RNA- Viren und haben einen Durchmesser von etwa 100 nm. Die diploide RNA ist in einem Kapsid eingeschlossen, das von einer Virus- hülle umgeben ist, die aus der Zytoplasma- membran der Wirtszelle abgeschnürt wurde. In dieser Hüllmembran ist das trans- membrane Hüllprotein (TM, transmembrane subunit) lokalisiert, welches mit dem viralen Glykoprotein an der Oberfläche (SU, surface subunit) nicht-kovalent verbunden ist. Diese Proteine interagieren mit den Rezeptoren der Zielzellen und werden als gemeinsames Vorläuferprotein gebildet und erst später, während der Virusmorphogenese, mit Hilfe zellulärer Proteasen gespalten. An der Innenseite der Virusmembran sind die mit aminoterminal angefügten Myristinsäurereste verankerten Matrixproteine (MA) angeordnet. Im Inneren des Partikels ist das Viruskapsid lokalisiert, welches je nach Genus eine sphärisch-ikosaedrische oder eine konische Form aufweist und aus Kapsidproteinen (CA) zusammengesetzt ist. Dieses umschließt das retrovirale Genom, bestehend aus zwei, mit Nukleokapsidproteinen (NC) komplexierten, identischen RNA-Einzelsträngen. Die Enzyme Integrase (IN), Reverse Transkriptase (RT) und Protease (PR) sind weitere Bestandteile eines jeden Retrovirus und spielen bei dessen Replikation eine essentielle Rolle. In komplexeren Retroviren (Lentiviren, δ-Retroviren) sind zusätzlich noch akzessorische und regulatorische Proteine vorhanden.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1.1: Aufbau eines γ-Retrovirus

SU: Oberflächenprotein, TM: Transmembranprotein, MA: Matrixprotein, CA: Kapsidprotein,

NC: Nukleokapsid-proteine, IN: Integrase, RT: Reverse Transkriptase, PR: Protease [Vogt, 1997]

1.2.3 Retrovirale Genomstruktur

Das retrovirale Genom besteht aus zwei identischen positiv-einzelsträngigen RNAMolekülen, die jeweils eine durchschnittliche Länge von etwa 10 000 Basenpaaren haben. Die RNA besitzt am 5‘-Ende eine Cap-Struktur und am 3‘-Ende eine Polyadenylierung und weist somit alle Charakteristika einer eukaryotischen mRNA auf. Infektiöse Partikel beinhalten in ihrem Genom mindestens drei Regionen, die für die viralen Proteine kodieren. Die Genabschnitte werden als gag, pol und env bezeichnet.

Das Element gag kodiert die Matrixproteine, Kapsidproteine und Nukleokapsidproteine, pol die Enzyme enthält die genetische Information für Integrase, Reverse Transkriptase und virale Protease während env die beiden Hüllproteine kodiert. Am 5'- und am 3'-Ende der RNA befinden sich die R-Regionen („ redundant “), die in identischer Sequenz und Orientierung vorliegen. Sie tragen Signale für den Start bzw. für die Beendigung der Transkription. Auf den 5'-R-Bereich folgt die bei γ-Retroviren ca. 75 nt lange U5-Region („ unique “), die invertierte Sequenzen enthält, welche für die Integration des Provirus in das Zellgenom wichtig sind. In direkter Nachbarschaft findet sich die Primerbindungsstelle (PBS), deren Sequenz von 18 Basen komplementär zum 3'-Ende einer spezifischen zellulären tRNA der Wirtszelle ist, die bei der viralen Replikation von Bedeutung ist. Auf die PBS-Region folgt die sogenannte leader-Region, die eine Spleißdonorstelle (SD) sowie eine ψ-Stelle enthält. Die Spleißdonorstelle wird für die Produktion aller gespleißten mRNA-Moleküle verwendet, wohingegen die ψ-Stelle ein Verpackungssignal darstellt, mittels dessen sich die RNA- Genome bei der Morphogenese an die Nukleokapsidproteine der sich bildenden Viruspartikel anlagern können. Am Ende der Region, die für pol kodiert, befindet sich die Spleißakzeptorstelle (SA). Auf das env -Gen folgt eine Purin-reiche Sequenz (PPT) mit mindestens neun Adenosin- und Guanosinresten, die für die Initiation der DNA-Doppelstrang Synthese bei der reversen Transkription wichtig sind. Die daneben lokalisierte und in der Länge variable U3-Region weist mit Verstärker- und Promotorbereichen wichtige Motive für die Regulation der viralen Transkription auf. In der proviralen DNA treten die U3- sowie die U5-Region aufgrund des besonderen Mechanismus der reversen Transkription an beiden Enden auf und bilden mit den R-Regionen die identisch langen terminalen Wiederholungs- sequenzen (long terminal repeat, LTR) (Abb. 1.2).

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Abbildung 1.2: Genomstruktur der Retroviren

Oben: Die genetische Struktur des Provirus nach der Integration in das zelluläre Genom. Unten: Die transkribierte virale Volllängen-RNA sowie gespleißte env-mRNA. U3, R, U5: long terminal repeat, PBS: Primerbindungsstelle, ψ: Verpackungselement, SD: Spleißdonor, SA: Spleißakzeptor, PPT: Polypurintrakt, FS: frame shift Stelle, pA: Polyadenylierungssignal [Coffin, 1997]

1.2.4 Retrovirale Replikation

Der Erste Schritt der Retrovirusreplikation stellt die Adsorption des Virions an Rezeptoren der Zelle dar. Dies wird durch das Oberflächenhüllprotein vermittelt, indem es spezifisch an ein zelluläres Oberflächenprotein bindet. Dabei kommt es zur Konformationsänderung des SU- und TM-Proteins und anschließend zur Aufnahme des Viruskapsids in das zelluläre Zytoplasma durch Fusion der Virusmembran mit der Zellmembran oder mittels Rezeptor- vermittelter Endozytose.

Nach der Freisetzung des einzelsträngigen RNA-Genoms in der Zelle wird es mit der Hilfe der Reversen Transkriptase in mehreren Schritten in doppelsträngige DNA umgeschrieben, um sie später in das Wirtsgenom zu integrieren (Abb. 1.3). Zu Beginn bindet ein zellulärer tRNA-Primer an die Primerbindungsstelle (PBS) der retroviralen RNA, deren U5- und R- Region daraufhin in DNA revers transkribiert wird. Der Typ der tRNA hängt vom Virus ab und wird von der vorhergehenden Wirtszelle in das Virion eingebracht. Anschließend folgt die Entfernung der endständigen R- und U5-Bereiche der viralen RNA durch die Ribonuklease- H-Aktivität der Reversen Transkriptase und der Transfer von DNA und tRNA zum 3‘-Ende. Die redundanten Bereiche sind komplementär und bilden nun die einzige Verbindungsstelle. Die weitere Synthese der DNA am 3‘-Ende führt zur Verlängerung des Minusstranges, nach dessen Fertigstellung die virale RNA bis auf ein RNA-Fragment vollständig abgebaut wird. Dieses Fragment dient als Primer für die Synthese des komplementären DNA-Plusstranges, der sich in 5‘-3‘-Richtung bis zu der PBS-Region mit hybridisierter tRNA erstreckt. Durch die darauffolgende Entfernung der beiden Primer entsteht ein 3‘-Überhang des Plusstranges, dessen Sequenz komplementär zur PBS-Region des Erststranges ist. Die Hybridisierung dieser beiden DNA-Fragmente liefert die Primärstruktur der nachfolgenden Synthese des DNA-Zweitstranges. Nach dem Auffüllen der einzelsträngigen Enden durch die Aktivität der Reversen Transkriptase und der Ribonuklease H, liegt das Virusgenom als doppelsträngiges DNA-Molekül mit langen endständigen Sequenzwiederholungen (long terminal repeat, LTR) vor. Diese LTRs enthalten starke Promotoren für die Transkription und sind am Integrationsprozess beteiligt. Wegen der fehlenden Fehlerkorrektur der Reversen Transkriptase kommt es bei der Synthese der beiden DNA-Stränge relativ häufig (alle 10[3]bp bis 10[4]bp) zu einem Einbau falsch gepaarter Nukleotide, der für die hohen Mutationsraten der Retroviren verantwortlich ist.

Bis zur Integration der viralen DNA in das chromosomale Genom der Wirtszelle, verbleibt sie mit viralen Proteinkomponenten verbunden. So ist auch erst bei der Zellteilung und der damit einhergehenden Auflösung der Kernmembran eine Infektion der Zelle möglich, da die Kernmembranporen für den 20 nm bis 30 nm großen DNA/Protein-Komplex undurchlässig sind. Lentiviren wie HIV bilden hier eine Ausnahme, da sie über das akzessorische Protein Vpr verfügen, das Teil ihres Präintegrationskomplexes ist und den Transport in die Zellen katalysiert.

Im Zellkern kommt es mit Hilfe des Enzyms Integrase zur unspezifischen Integration der viralen Doppelstrang-DNA in das zelluläre Genom. Dabei entfernt die Integrase ein Dinukleotid von beiden 3‘-Enden der viralen DNA und schneidet durch die Endonuklease- Aktivität die zelluläre DNA an einer unspezifischen Stelle, so dass 5‘-Überhänge entstehen. Im Anschluss werden mittels zellulärer Ligasen die sticky-ends der Wirts-DNA mit denen der Virus-DNA verbunden. Als Provirus kann seine genetische Information exprimiert werden, oder sie kann in einem latenten Zustand verbleiben und nicht exprimiert werden.

Wenn die Promotoren im rechten LTR aktiviert werden, wird die integrierte provirale DNA durch die zelluläre RNA-Polymerase II in Transkripte umgesetzt, die mit einer Cap-Struktur versehen und polyadenyliert sind. Diese RNA-Transkripte können entweder in Viruspartikel verpackt oder prozessiert und in Virusproteine übersetzt werden. Einige Virusproteine werden anfangs durch die Translation der Volllängen-RNA als großes primäres Gag-Pro/Pol- Protein an freien zytoplasmatischen Ribosomen produziert. Dieses wird am aminoterminalen Ende myristiliert und gelangt bei den meisten Retroviren mittels zellulärer Strukturen, wie dem Zytoskelett, zur Plasmamembran, an der die Akkumulation aller viraler Proteine und Nukleotide stattfindet. Zur Translation des Env-Proteins hingegen muss bei γ-Retroviren im Zellkern ein für das env -Gen kodierendes RNA-Molekül mittels Spleißdonor und -akzeptor gespleißt werden (Abb. 1.2). Dieses wird anschließend mittels Signalpeptid an der aminoterminalen Domäne an der Membran des endoplasmatischen Retikulums zum Env-Vor läuferprotein prozessiert. Im Verlauf des weiteren Transportes über den Golgi-Apparat zur Zelloberfläche kommt es zur Glykosilierung und Spaltung in den transmembranen (TM) und externen Teil (SU) des Env-Glykoproteins. Bei den komplexeren Retroviren wie etwa den Lentiviren existieren hingegen mehrere einfach bzw. mehrfach gespleißte mRNA Spezies, die für die regulatorischen und akzessorischen Proteine kodieren. Aufgrund des vorhandenen ψ-Verpackungselements kann sich die Volllängen-RNA spezifisch an das virale Nukleokapsidprotein, das über RNA-bindende Zinkfingermotive verfügt, anlagern.

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Abbildung 1.3: Bildung doppelsträngiger DNA aus einzelsträngiger RNA im Zuge der Retrovirus-Replikation R: redundanter Bereich, PBS: Primerbindungsstelle, LTR: long teminal repeat

[Madigan, 2001]

Die Virus-Proteine sowie zelleigene tRNA-Primer wandern an die Zelloberfläche und es kommt zu Ausstülpungen an der zellulären Plasmamembran, auf die schlussendlich die vollständige Abschnürung von unreifen Viruspartikeln folgt („ budding“). Bei einem pH-Wert von 6,0 bis 6,2 im Inneren des Partikels wird die virale Protease, die noch als Gag-Pro/Pol-Vorläuferprotein vorliegt, aktiviert und spaltet sich autokatalytisch ab. Anschließend sorgt sie für die Prozessierung der Matrix-, Kapsid-, und Nukleokapsidproteine sowie von Reverser Transkriptase und Integrase. Die im weiteren Reifungsprozess einhergehende Umlagerung der Kapsidproteine führt zur Bildung von infektiösen retroviralen Partikeln, so dass der Replikationszyklus erneut beginnen kann.

1.2.5 Porzine endogene Retroviren (PERVs)

Porzine endogene Retroviren (PERVs) wurden erstmals Anfang der 70er Jahre im Kulturüberstand einer porzinen Nieren-Zelllinie (PK15) elektronenmikroskopisch nachgewiesen[57]und konnten auch später bei der Kultivierung anderer porziner Zellen beobachtet werden [58, 59]. Aufgrund ihrer Morphologie wurden sie dem Genus der γ-Retroviren zugeordnet. Die Virionen haben einen Durchmesser von ca. 100 nm und weisen die für alle Retroviren typischen viralen Proteine Gag, Pol und Env auf (Abb. 1.2).

PERVs sind als DNA-Proviren mit mehr als 100 Kopien integraler Bestandteil des Schweine- Genoms [60-62]. Die meisten dieser Proviren sind jedoch defekt und unfähig, infektiöse Virionen zu bilden [61, 63]. Nur wenige Kopien stellen intakte, Replikations-kompetente Viren her und werden in die Subtypen PERV-A, PERV-B und PERV-C eingeteilt[64]. Die Anzahl der Kopien sowie die Freisetzung von Virus-Partikeln kann sowohl zwischen verschiedenen Schweinerassen, als auch bei einzelnen Tieren innerhalb einer Rasse variieren [65, 66]. Zudem ist die Expressionsstärke von PERV-mRNA in verschiedenen Geweben eines Schweins unterschiedlich. So konnte in Nierengewebe die höchste und im Pankreasgewebe die geringste Expression an PERV-mRNA detektiert werden. [67, 68]. Da die meisten Proviren defekt sind und nur wenige intakte Loki existieren, ist die Anwesenheit von PERV- DNA bzw. PERV-mRNA kein sicheres Indiz für die Bildung von intakten infektiösen Partikeln. PERV-A und PERV-B sind im Genom aller Schweine vorhanden und können neben porzinen Zellen auch humane Zellen [69-72] sowie Säugetierzellen anderer Spezies invitro infizieren [73-76]. Sie werden deshalb als polytrop bezeichnet. Bei PERV-C handelt es sich dagegen um ein ecotropes Virus, das nicht ubiquitär ist und nur Zellen des Schweins infizieren kann [64]. Umfangreiche Studien zeigen, dass die in vitro mit PERVs infizierten Zellen und Zelllinien in der Lage sind, intakte infektiöse Viruspartikel zu bilden und freizusetzen [69, 76]. Die einzelnen PERV-Subtypen enthalten hochhomologe gag - und pol -Gene, unterscheiden sich aber deutlich in ihren env -Sequenzen[77], was zu unterschiedlichen Rezeptor- Spezifitäten und Wirts-Tropismen führt. Für PERV-A konnten bislang zwei humane Rezeptoren (HuPAR1 und HuPAR2, human PERV-A receptor) identifiziert und kloniert werden[78]. Der genaue Aufbau und die Funktion sind weitgehend unbekannt und werden zurzeit noch erforscht [79, 80]. Auch die LTRs, die mit ihren starken Promotor-Bereichen, die Transkriptionsaktivität von PERV steuern, zeigen in ihrer Sequenz viele Variationen auf. So wurden vor kurzem 69 verschiedene Kopien von LTR-Elementen identifiziert[81].

Bei PERV-A und PERV-C besteht aufgrund der hohen Sequenzhomologie die Möglichkeit einer Rekombination. So wurde nach einer Infektion von humanen 293 Nierenzellen mit Überständen von porzinen peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), die erste PERV- A/C-Rekombinante identifiziert. Diese besitzt die Genabschnitte LTR, gag, pol und Teile von env des PERV-C-Subtyps, aber auch einen Bereich von env inklusive der receptor binding domain (RBD) des PERV-A-Subtyps. Somit ist es der Rekombinante möglich, sich in humanen Zellen zu replizieren [71, 74, 82]. Weitere Studien zeigten eine Titererhöhung nach wiederholten Passagen auf humane Zellen, was mit einer gesteigerten Promotoraktivität durch sequentielle Multimerisierung der Bindestelle des Transkriptionsfaktors NF-Y der U3- Region der LTR zu erklären ist [83-85]. Die gesteigerte Replikationsrate der PERV-A/C- Rekombinante kann mit einer Zunahme der Pathogenität korrelieren, wie es im Fall von anderen Retroviren, z. Bsp. HIV, FeLV und MuLV beschrieben wurde [86-91]. Zudem wurde PERV-A/C in vitro und de novo als Provirus in Milzzellen von Miniaturschweinen von Münchener Miniaturschweinen, aber nicht in den Keimzellen, gefunden [82, 92-94]. Da PERV-A/Cs in der Lage sind, humane Zellen zu infizieren und eine gesteigerte Replikationsrate aufweisen, stellen sie ein zusätzliches Risiko für die Xenotransplantation dar[95]. Um die Gefahr einer potentiellen Infektion mit PERV-A/C bei einer Organ- oder Gewebetransplantation zu umgehen, sollten Schweine ausgewählt werden, die in ihrer Keimbahn keine PERV-C-Proviren tragen, um eine Rekombination von PERV-A und PERV- C zu vermeiden.

Porzine endogene Retroviren zeigen in ihrem natürlichen Wirt, dem Schwein, keine pathogene Symptomatik. Jedoch besteht die Gefahr, dass es bei einer Transspezies- übertragung von PERVs zu Immundefizienzen und aufgrund der Integration der Proviren in das zelluläre Genom, zu einer erhöhten Tumorbildung im Rezipienten führt. Diese Annahme liegt darin begründet, dass PERV große Ähnlichkeiten zu anderen bekannten γ-Retroviren, wie dem gibbon ape leukemia virus (GALV)[69], dem endogenen Koala Retrovirus (KoRV) [96]sowie dem felinen und murinen Retroviren (FeLV, MuLV) aufweist, von denen bekannt ist, dass sie Immundefizienzen hervorrufen und die Tumorbildung induzieren[97]. Des Weiteren könnten PERVs mit humanen endogenen Retroviren (HERVs) rekombinieren, da einige HERVs Sequenzhomologien mit den Schweineviren aufweisen.

Zur verbesserten Akzeptanz des porzinen Organs im humanen Rezipienten sollen in Zukunft transgene Schweine verwendet werden (1.1.3.2). Dabei führt die Entfernung der Gal-α-1,3- gal-Epitope auf der Oberfläche von porzinen Zellen durch den doppelten Gen-Knockout der α-1,3-Galaktosyltransferase[27]zu verminderten Abstoßungsreaktionen des Empfängers, aber auch zu einem erhöhtem Risiko einer PERV-Übertragung. Dies lässt sich damit erklären, dass die von der porzinen Zellmembran abgeschnürten PERV-Partikel auf ihrer Hüllmembran ebenfalls keine Gal-α-1,3-gal-Epitope aufweisen und somit die Bindung und Neutralisation durch die sonst xenoreaktiven Antikörper ausbleibt. Zusätzlich verringert die Expression von humanen Komplement-regulierenden Proteinen auf der Oberfläche der porzinen Zellen, und damit auch auf der Hüllmembran der PERVs, die Komplementaktivierung des humanen Rezipienten. Auf diese Weise würde ein wichtiger Bestandteil des menschlichen Immunsystems, der nachweislich in der Lage ist, γ-Retroviren zu inaktivieren, ausfallen [98, 99].

Zur genauen Beurteilung der pathogenen Eigenschaften der porzinen endogenen Retroviren wäre ein Tiermodell förderlich. Umfangreiche Infektionsstudien mit nicht-humanen Primaten und vielen Kleintieren [73, 76, 100-105] sowie erste experimentelle Xenotransplantationen mit nicht-human Primaten [114] zeigten bis jetzt keine in vivo Übertragung von PERV. Bei gentechnisch veränderter Mäusen, die den PERV-A-Rezeptor-2 (HuPAR-2) auf ihren Zelloberflächen exprimieren[109], ist jedoch eine Infektion mit PERV möglich. So konnte in den Tieren nach Applikation von infektiösen PERV Überständen, virale DNA und RNA nachgewiesen werden. Mit Hilfe dieser Mäuse wäre es möglich, das pathogene Potential von PERV besser einzuschätzen sowie potentielle Therapeutika und präventive Maßnahmen zu untersuchen.

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Abbildung 1.4: Rasterelektronische Aufnahme von porzinen endogenen Retroviren (PERVs)

PERV-Partikel bei der Abknospung („budding“) von humanen embryonalen Nierenzellen (293) in Falschfarbendarstellung [Dr. M. Özel, Robert Koch-Institut, Berlin]

Um die Übertragung von porzinen endogenen Retroviren bei einer Xenotransplantation schon im Vorfeld einzuschränken, sind Erfolg versprechende Strategien entwickelt worden. So gelang die Induktion von neutralisierenden Antikörpern gegen das transmembrane Hüllprotein von PERV [110][111], so dass eine Impfung gegen das Virus denkbar ist. Da das Provirus mit über 100 Kopien an verschiedenen Loci des porzinen Genoms lokalisiert ist, gestaltet sich der Einsatz des klassischen Gen- Knockout- Verfahrens als äußerst schwierig. So bietet sich zum Schutz einer Übertragung die Möglichkeit der RNA-Interferenz (RNAi) an, mit der man schon auf Molekularebene die Replikation der PERVs blockieren kann. Karlas et al. konnten zeigen, dass sich mit Hilfe dieser Methode, die Virus-Expression in humanen PERV-B-infizierten Zellen um bis zu 90 % hemmen lässt[112]. Ferner wurde die PERV- Expression in porzinen primären Fibroblasten um bis zu 94,8 % und in porzinen Nierenzellen (PK15) um bis zu 73,5 % inhibiert[113]. Kürzlich ist es gelungen, transgene Schweine zu generieren, die eine PERV-spezifische small hairpin RNA (shRNA) exprimieren. In den entnommenen Organen dieser Tiere konnte eine um bis zu 94 % reduzierte PERV- Expression nachgewiesen werden[114]. Sollte es trotz aller Sicherheitsvorkehrungen zu einer Übertragung der porzinen endogenen Retroviren auf den Menschen kommen, könnten die bei der HIV-Therapie eingesetzten Reverse Transkriptase- und Protease-Hemmer verwendet werden. So gelang es mittels eines Nukleosidanalogon AZT, die PERV- Replikation in vitro zu hemmen [115][116].

1.3 RNA-Interferenz

Eine vielversprechende Methode zur Reduzierung der Replikation von porzinen endogenen Retroviren in infizierten Zellen, Geweben und Organen stellt die RNA-Interferenz (RNAi) dar, mit deren Hilfe das Risiko einer PERV-Übertragung bei der Xenotransplantation deutlich reduziert werden könnte. Die RNA-Interferenz beschreibt einen durch kurze doppelsträngige RNA-Moleküle ausgelösten hoch konservierten Mechanismus, der zur Sequenz-spezifischen Degradierung der mRNA und damit zur post-transkriptionellen Stilllegung von Genen führt. Erstmals Ende der 90er Jahre wurde die RNAi, die vermutlich einen der ältesten Abwehrstrategien gegen virale Infektionen darstellt, aber von der Zelle auch als Instrument für Genregulationen genutzt wird, in den Fadenwürmern C. elegans beobachtet[117]. Inzwischen wurde der Mechanismus der RNA-Interferenz durch umfangreiche Studien an C. elegans und Drosophila melanogaster teilweise aufgeklärt.

In der ersten Phase werden doppelsträngige RNA-Moleküle endogenen (z. Bsp. micro RNA, miRNA) oder exogenen (z. Bsp. virale RNA) Ursprungs durch das Schlüsselenzym Dicer RNase III zytoplasmatisch in kleine 21 bp bis 23 bp kurze RNA-Fragmente (small interfering RNA, siRNA) gespalten, welche an den 3‘-Enden einen 2 nt-Überhang besitzen (Abb. 1.5). Eine anschließende Phosphorylierung der 5’-Enden des siRNA-Duplex führt zur Bindung an den im Zytoplasma vorkommenden Nukleasekomplex RISC (RNA induced silencing complex), der die Sequenz-spezifische Erkennung und Degradation der Ziel-mRNA unterstützt. Durch die in der zweiten Phase unter ATP-Verbrauch stattfindenden Entwindung der doppelsträngigen siRNA wird der RISC aktiviert und mit Hilfe des antisense-Strangs (as) der siRNA über komplementäre Basenpaarung an die korrespondierende mRNA-Sequenz herangeführt. Dieser schneidet die zelluläre mRNA an definierter Stelle innerhalb der siRNA- Bindungsstelle oder blockiert sie, um eine Translation des mRNA-Abschnittes zu unter- binden. Anschließend wird die geschnittene und nun ungeschützte mRNA mittels zellulärer RNasen komplett degradiert und somit die Bildung des Proteins verhindert.

Der Einsatz doppelsträngiger RNA mit einer Länge von 38 bp bis 1662 bp induziert bei Säugern, im Gegensatz zu einfachen Organismen, eine unspezifische Hemmung aller Genprodukte. Deswegen ist der Einsatz von dsRNAs mit dieser Länge für die Inhibition von spezifischen Genen in Säugern ungeeignet. Als Ersatz können synthetisch hergestellte siRNAs dienen, die genauso wie die Dicer-Spaltprodukte meist 21 nt kurz sind und einen Überhang am 3‘-Ende aufweisen. Sie sind aufgrund ihrer geringen Größe leicht zu transfizieren und lösen in den Zellen keine unerwünschte Interferonantwort aus. Ein entscheidender Nachteil besteht aber in der Wirksamkeitsdauer in der die Proteinsynthese gehemmt wird. Nach vier bis fünf Tagen fällt die Konzentration der siRNAs durch Abbau oder Zellteilung und der einhergehenden Ausverdünnung in den Zellen rapide ab, so dass keine spezifische Blockierung der entsprechenden Gene mehr nachgewiesen werden kann. Ein weiterer Nachteil stellen die hohen Kosten für die Synthese dieser Polynukleotide dar. Abhilfe verschaffen sog. small hairpin RNAs (shRNAs), die eine Proteinsynthese eines spezifischen Gens dauerhaft hemmen können. Sense- und Antisense-Strang dieser shRNA sind direkt über eine kurze unspezifische Nukleotidsequenz (Loop) miteinander verbunden und bilden eine Haarnadelstruktur aus, die den Einbau in den RISC ermöglicht. Die codierende DNA-Sequenz steht unter der Kontrolle eines Polymerase III-Promotors und ist stabil im Genom der jeweiligen Zielzellen integriert.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1.5: Schematische Darstellung des RNAi-Mechanismus

Die dsRNA wird unter ATP-Verbrauch mittels der Dicer RNase III in 21 nt bis 23 nt kleine siRNAs prozessiert. Das siRNAs-Duplex wird entwunden und aktiviert den RISC, der die mRNA anschließend Sequenz-spezifisch spaltet. Die mRNA-Fragmente werden daraufhin von RNasen komplett degradiert.

[McManus et al., 2002]

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