Positionelle Identifizierung der Krankheitsgene bei idiopathisch generalisierten Epilepsien

Inhaltsverzeichnis

ZUSAMMENFASSUNG

ABBILDUNGSVERZEICHNIS

TABELLENVERZEICHNIS

ABKÜRZUNGEN

1. EINLEITUNG
1.1 Genetik der idiopathisch generalisierten Epilepsien
1.2 Klassifikation der IGE-Syndrome
1.3 Kenntnisstand der molekulargenetischen Analysen bei IGE
1.3.1 Monogene idiopathische Epilepsien
1.3.2 Idiopathische Epilepsien mit komplexer genetischer Disposition
1.4 Kopplungsanalysen
1.5 Assoziationsanalysen
1.5.1 Genom-weite Assoziationsstudien
1.6 Sequenzanalysen von Kandidatengenen
1.7 Zielsetzung

2. MATERIAL UND METHODEN
2.1 Studienprobanden und Material
2.1.1 Patienten und Kontroll-DNA
2.1.1.1 Proben für Sequenzanalyse der Kandidatengene
2.1.1.2 Studienkollektive der Assoziationsstudie
2.1.2 Chemikalien, Enzyme und Kits
2.1.3 Verwendete Geräte
2.1.4 Verwendete Verbrauchsmaterialien
2.1.5 Verwendete Programme und Datenbanken
2.2 Methoden
2.2.1 DNA-Konzentrationsbestimmung
2.2.2 TaqMan® RNase P
2.2.3 DNA-Normalisierung
2.2.4 Polymerase Kettenreaktion
2.2.5 Agarose Gel-Elektrophorese
2.2.6 Sequenzanalysen der Kandidatengene
2.2.6.1 Auswahl der Kandidatengene
2.2.6.2 Sequenzanalyse nach Sanger
2.2.7 Pyrosequenzierung
2.2.8 GenomeLab™ SNPstream®
2.2.8 Einschätzung der Studienteststärke
2.2.9 Plausibilitätsprüfungen potentiell pathogener Sequenzvarianten
2.2.10 Statistische Methoden

3. ERGEBNISSE
3.1 Sequenzanalyse der Kalium-Kanalgene KCNJ8, KCNJ9 und KCNJ10
3.2 Sequenzanalyse des GABA-Rezeptor-Gens GABRR1
3.3 Sequenzanalyse des Na+-K+-2Cl" -Transporter-Gens SLC12A2
3.4 Sequenzanalyse des Kalzium-Kanal-Gens CACNA11
3.4.1 Kosegregationsanalyse von CACNA1Ic.920G>A (p.Arg307His)
3.4.2 Kosegregationsanalyse von CACNA1Ic.1513C>A (p.His505Asn)
3.4.3 Kosegregationsanalyse von CACNA1Ic.3077C>T (p.Pro1026Leu)
3.4.4 Kosegregationsanalyse von CACNA1Ic.3579G>C (p.Gln1193His)
3.4.5 Kosegregationsanalyse von CACNA1Ic.3698A>C (p.Gln1233Pro)
3.4.6Kosegregationsanalyse von CACNA1Ic.5285C>T (p.Pro1762Leu)
3.4.7Kosegregationsanalyse von CACNA1Ic.6118G>T(p.Asp2040Tyr)
3.4.8 Überprüfung der Variationen im Kontroll-Kollektiv
3.5 Sequenzanalyse Des Kalzium-Kanal-Gens CACNA1H
3.6 Sequenzierung von NLGN4X
3.7 Assoziationsanalysen

4. DISKUSSION
4.1 Studienstrategien
4.2 Sequenzanalyse
4.3 Assoziationsstudien
4.4 Methodische Erörterungen
4.4.1 Fehlerquellen
4.5 Zusammenfassung und Ausblick

5. LITERATURVERZEICHNIS

6. ANHANG

DANKSAGUNG

Zusammenfassung

Im Rahmen dieser Arbeit wurden für ein europäisches Projekt (EPICURE) acht Kandidatengene bezüglich der idiopathisch generalisierten Epilepsie (IGE), einer zum Teil erblichen Störung des zentralen Nervensystems (ZNS), in einem europäischen Kollektiv aus acht Ländern untersucht.

Durch Sequenzierung der Kandidatengene und Durchführung einer Kosegregationsanalyse konnte im Gen CACNA1I eine neue DNA-Variante entdeckt werden, die eventuell in der Lage ist, IGE auszulösen oder zumindest zu beeinflussen. Eine bereits bekannte, IGE-assoziierte Variante im Gen KCNJ10 mit der dbSNP-ID rs1130183 konnte zudem bestätigt und vorherige Ergebnisse repliziert werden.

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1.1: Klassifikation von idiopathisch generalisierten Epilepsien (IGE)

Abbildung 1.2: Disposition der genetisch komplexen Epilepsien als quantitatives Erbmerkmal Abbildung 2.1: Ablauf vom TaqMan®-Assay

Abbildung 2.2: Schema der Reaktionskaskade während der Sequenzierung

Abbildung 2.3: Ablauf vom SNPstream®-Assay

Abbildung 2.4: Schrittweise Plausibilitätsprüfung potentiell pathogener Sequenzvarianten

Abbildung 3.1: Stammbaum der Familie mit Variation c.920G>A

Abbildung 3.2: Stammbäume der Familien mit Variation c.1513C>A

Abbildung 3.3: Stammbaum der Familie mit Variation c.3077C>T

Abbildung 3.4: Stammbaum der Familie mit Variation c.3579G>C

Abbildung 3.5: Stammbaum der Familie mit Variation c.3698A>C

Abbildung 3.6: Stammbäume der Familien mit Variation c.5285C>T

Abbildung 3.7: Stammbaum der Familie mit Variation c.6118G>T

Abbildung 3.8: Clusterplotts vom SNPstream vom SNP rs1130183

Abbildung 4.1: Paradigma von VAPSE-basierten Studien

Abbildung 4.1: Überbli]ck über in silica Analysen

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1.1: Erkrankungsgene bei monogenen Epilepsie-Formen

Tabelle 2.1: Übersicht der untersuchten IGE-Patienten

Tabelle 2.2: Verwendte Programme und Datenbanken

Tabelle 2.3: Genomische Informationen der sequenzierten Kandidatengenen

Tabelle 3.1: Identifizierte Sequenzvariationen der Gene KCNJ9 und KCNJ10

Tabelle 3.2: Identifizierte Sequenzvariationen des Gens GABRR1

Tabelle 3.3: Identifizierte Sequenzvariationen des Gens SLC12A2

Tabelle 3.4: Identifizierte Sequenzvariationen des Gens CACNA1I

Tabelle 3.5: Ergebnisse der Kontroll- und Segregationsanalyse der CACNA1I nicht-synonyme Variationen

Tabelle 3.6: Identifizierte Sequenzvariationen des Gens CACNA1H

Tabelle 3.7: Identifizierte Sequenzvariationen des Gens NLGN4X

Tabelle 3.8: Eingeschlossene nicht-synonyme Variationen in Assoziationsstudie

Tabelle 3.9: Sequenzvariationen mit Genotypisierungsqualitätswerte

Tabelle 3.10: Assoziationsstatistiken

Tabelle 5.1: Verwendete Primer für Sanger-Sequenzierung

Tabelle 5.2: Verwendete Primer für Pyrosequenzierung CACNA1I

Tabelle 5.3: Verwendete Primer für SNPstream-Assay

Abkürzungen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1. Einleitung

1.1 Genetik der idiopathisch generalisierten Epilepsien

Epilepsien gehören mit einer Prävalenz von 3% zu den häufigsten chronischen Erkrankungen des zentralen Nervensystems (Hauser, et al., 1996). Das Krankheitsbild Epilepsie umfasst eine heterogene Gruppe von Störungen des zentralen Nervensystems (ZNS), die klinisch durch das wiederholte Auftreten von unprovozierten epileptischen Anfällen gekennzeichnet sind, denen neurophysiologisch eine paroxysmal auftretende, synchronisierte zerebrale Erregungssteigerung zugrunde liegt (ILAE, 1989). Als Anfall wird eine vorübergehende Beeinträchtigung der Hirnfunktion bezeichnet, die sich plötzlich entwickelt und spontan endet (Hauser, et al., 1996). Ein epileptischer Anfall wird durch eine synchrone Erregungssteigerung von Neuronenverbänden des ZNS ausgelöst. Anhand elektroenzephalographischer (EEG) Untersuchungen können die Erregungssteigerungen im Gehirn erfasst werden.

Bei ca. 50% aller Epilepsien sind vorwiegend genetische Faktoren als Krankheitsursache determiniert. Dies gilt besonders für die häufigen idiopathisch generalisierten Epilepsien (IGE), die ca. 30% aller Epilepsien repräsentieren (Sander, 2003). Epileptische Anfälle stellen bei IGE das einzige Erkrankungssymptom dar, wobei der Verlauf und die Symptome keine Hinweise auf eine anatomisch begrenzte Lokalisation im Gehirn geben und keine Zeichen eines lokalen Beginns zu erkennen sind. Es gibt keine Hinweise auf exogene Faktoren (Hirntrauma, perinatale Hirnschädigung, Encephalitis, Hirnmißbildung, Tumor, etc.) zur Ätiologie der IGE (ILAE, 1989).

Die IGEs werden aufgrund von Konkordanzraten (80% bei eineiigen Zwillingen und von 5-8% bei Geschwistern) als zum Großteil genetisch bedingte Krankheit betrachtet (Berkovic, et al., 1998; Ottman, 2005). Das relative Geschwisterrisiko ist 10-20x höher als das der Gesamtbevölkerung (Gardiner, 2005). Zusätzlich weisen IGE-Syndrome einen altersabhängigen Erkrankungsbeginn auf (Berkovic, et al., 1987).

Da die IGE phänotypisch eindeutig charakterisierbar und ihre Ätiologie vorwiegend genetisch determiniert ist, sind molekulargenetische Forschungsansätze aussichtsreich, bei denen die Identifizierung der verantworstlichen Gene einen bedeutenden Anteil zur Aufklärung der molekularen Mechanismen der Epileptogenese leistet.

1.2 Klassifikation der IGE-Syndrome

Gemäß der Klassifikation der Internationalen Liga gegen Epilepsie (ILAE, 1989) werden IGE-Syndrome anhand des Anfalltyps, des Manifestationsalters und des Krankheitsverlaufs klassifiziert (Abbildung 1.1). Die molekulargenetischen Analysen in dieser Arbeit befassen sich mit den drei häufigsten IGE-Syndromen: Der Absence Epilepsie des Kindesalters (CAE), der juvenilen Absence Epilepsie (JAE) und der juvenile myoklonischen Epilepsie (JME). Diese Syndrome stellen ca. 50% aller IGE dar (Duncan, 1997; Janz, 1997). Zusammen mit der Aufwach-„grand mal“-Epilepsie bilden sie sogar 80% aller IGE.

Die Absence Epilepsie des Kindesalters (chilhood absence epilepsy, CAE) manifestiert sich im Schulkindalter (3. bis 12. Lebensjahr). Bei einem Absence-Anfall (Petit mal, „kleiner Anfall“) steht ein abrupter Aufmerksamkeits- und Reaktionsverlust gegenüber der Umgebung im Vordergrund, der jedoch ohne Sturz oder Merkmale der Bewusstlosigkeit einhergeht. Es handelt sich um die mildeste Ausprägung generalisierter Anfälle. Nach dem Anfall erfolgt die unvermittelte Aufnahme der zuvor unterbrochenen Tätigkeit (Berkovic, et al., 1987). Im Krankheitsverlauf treten die Anfälle häufig mehrfach täglich (pyknoleptisch) auf (Loiseau, 1992).

Der Anfallsbild der Juvenile Absence Epilepsie (juvenile absence epilepsy, JAE) ist der CAE ähnlich. Das Manifestationsalter liegt zwischen dem 8. und 20. Lebensjahr. Während des Erkrankungsverlaufs werden sporadische, vereinzelt auftretende Absencen beobachtet. Etwa 16% der Patienten erleiden myoklonische Anfälle (Wolf und Inoue, 1984).

Die Juvenile Myoklonische Epilepsie (juvenile myoclonic epilepsy, JME) beginnt meist zwischen dem zwölften und achtzehnten Lebensjahr und ist durch bilaretale, meist wiederholt auftretende Muskelzuckungen der Schultern und Arme charakterisiert. Das Bewusstsein ist aufgrund der Kürze des Anfalls nicht beeinträchtigt. Bei 30% der Patienten beginnt die Epilepsie mit Absence-Anfällen. Schlafentzug, Photostimulation, Hyperventilation, emotionaler Stress, Alkohol und in einigen Fällen Menstruation können die Auslösung eines Anfalls begünstigen (Janz, 1985; Wolf und Goosses, 1986).

Die Aufwach-„grand mal“-Epilepsie (epilepsy with generalized grand mal on awakening, EGMA) ist durch generalisierte, tonisch-klonische Anfälle charakterisiert, die tageszeitlich gebunden sind und in den ersten Stunden nach dem Aufwachen auftreten.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1.1: Klassifikation von idiopathisch generalisierten Epilepsien (IGE)

Die verschiedenen IGE-Syndrome weisen ein charakteristisches Erkrankungsalter auf. Das Anfallsbild korreliert mit dem Entwicklungs- und Reifungsgrad des Gehirns (Berkovic, et al., 1987) und ändert sich mit fortschreitender Reifung der zerebralen Funktionssysteme. Hierbei können die Anfälle dauerhaft anhalten oder sich in andere Anfallsformen entwickeln (Wirrell, et al., 1996). Bei etwa 20% der IGE-Patienten ist das zeitlich aufeinanderfolgende Auftreten von Absencen und myoklonischen Anfällen zu beobachten. Neurobiologisch betrachtet überlappen die IGE-Subtypen.

1.3 Kenntnisstand der molekulargenetischen Analysen bei IGE

Obwohl die Ätiologie der IGE fast vollständig genetisch bestimmt wird, ist ihre molekulargenetische Architektur kaum bekannt. Bei ca. 1-2% aller IGE verursacht ein einzelner Gendefekt die Erkrankung. Bei den meisten IGE wird von einer komplexen genetischen Ätiologie ausgegangen, bei der mehrere genetische Faktoren an der Epileptogenese beteiligt sind (Gardiner, 2005; Ottman, 2005). Erst wenn die Summe der Effekte mehrerer genetischer Störungen eine gewisse Erkrankungsschwelle überschreitet, kommt es zur Manifestation einer Epilepsie (Zimprich, 2006) (Abb. 1.2).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1.2: Disposition der genetisch komplexen Epilepsien als quantitatives Erbmerkmal

1.3.1 Monogene idiopathische Epilepsien

Mittels des molekulargenetischen Verfahrens der positionellen Klonierung konnten bei mehreren autosomal dominant vererbbaren IGE-Syndromen siebzehn Epilepsie-Gene identifiziert werden (Helbig, et al., 2008) (Tabelle 1.1). Die meisten dieser Gene kodieren für neuronale Ionenkanäle. Die monogenen Epilepsien werden daher auch zu den Ionenkanal­Erkrankungen gezählt. Ionenkanäle spielen eine wichtige Rolle bei der Signaltransduktion im ZNS. Die bisher identifizierten Ionenkanalgene weisen eine starke Heterogenität auf.

Tab. 1.1 Erkrankungsgene bei monogenen Epilepsie-Formen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Legende: ADNFLE, autosomal dominante nächtliche Frontallappen-Epilepsie; ADPEAF, dominante partielle Temporallappen-Epilepsie mit auditorischer Aura; BFNC, benigne familiäre neonatale Anfälle; CAE, Absence-Epilepsie des Kindesalters; GEFS+, generalisierte Epilepsie mit Fieberkrämpfen plus; GEPD, generalisierte Epilepsie mit paroxysmaler Dyskinesie; IPE, idiopathisch partielle Epilepsie; JME, juvenile myoklonische Epilepsie.

Bislang konnten Mutationen in drei Genen der Acetylcholin-Rezeptor-Untereinheiten (CHRNA4, CHRNA2, CHRNB2) für die autosomal dominante nächtliche

Frotntallapenepilepsie (ADNFLE) nachgewiesen werden. Die klassischen Mutationen, z.B. „nicht-synonyme“ - oder „frame-shift“- Mutationen, kommen in Genabschnitten vor, welche zur Kodierung der Ionenkanalpore zuständig sind. Die generalisierte Epilepsie mit Fieberkrämpfen plus (GEFS+) wird durch Mutationen in Genen, die für spannungsabhängige Natriumkanäle (SCN1A, SCN1B, SCN2A) bzw. GABA-Reteptor-Untereinheiten (GABRG2, GABRD) kodieren, determiniert. Es wurden zwei Gene, für Kaliumkanäle kodierend (KCNQ2, KCNQ3), bei benignen familiären neonatalen Anfällen identifiziert. Als Ursache der idiopathisch partiellen Epilepsie und generalisierten Epilepsie mit paroxysmaler Dyskinesie fanden sich Mutationen in KCNA1 und KCNMA1, die ebenfalls Kaliumkanäle kodieren. Mehrere nicht-synonyme Mutationen in CACNA1H, das zuständige Gen für T-Typ Kalziumkanäle, können Absence-Epilepsie des Kindesalters auslösen. In einzelnen Familien mit autosomal dominant vererbter juveniler myoklonischer Epilepsie fanden sich Mutationen in Genen, die für Kalziumkanäle (CACNB4) bzw. eine GABA-Rezeptor-Untereinheit (GABRA1) und Protein mit einem EF-Hand Motiv (EFHC1) kodieren. Das Gen LGI1, in dem bei Patienten mit autosomal dominanter Partialepilepsie mit auditorischen Symptomen (ADPEAF) Mutationen festgestellt wurden, kodiert keinen Ionenkanal. Insgesamt ist eine ausgeprägte phänotypische und genotypische Heterogenität auffällig (Cooper, et al., 2000; Lerche, et al., 2001).

1.3.2 Idiopathische Epilepsien mit komplexer genetischer Disposition

Die molekulargenetische Aufklärung der genetisch komplexen Dispositionen der häufigen IGE-Formen befindet sich erst in der Anfangsphase. Kopplungsanalysen, Assoziationsstudien sowie Sequenzanalysen von Kandidatengenen repräsentieren drei sich ergänzende Strategien zur molekulargenetischen Analyse von IGE-Syndromen (Glazier, et al., 2002). Kopplungsstudien sind sehr erfolgreich bei der positionellen Kartierung von Mutationen mit starkem Effekt. Assoziationsstudien sind die Methode der Wahl zur Identifizierung von häufigen Genvarianten mit nur geringen Effekten, wie sie gemäß der Common Disease/Common Variant (CDCV) Hypothese erwartet werden. Ergänzend sind Sequenzanalysen von plausiblen Kandidatengenen in der Lage, bei Vorliegen einer ausgeprägten allelischen Heterogenität auch multiple, seltene Genmutationen zu erfassen, die an der Epileptogenese beteiligt sind (Common Disease/Multiple Rare Variants Hypothese).

1.4 Kopplungsanalysen

Zur positionellen Klonierung von Erkrankungsgenen werden nach der Bestimmung der chromosomalen Region der verantwortlichen Genstörung potentielle Erkrankungsgene in der Kandidatengenregion kloniert. Der Vergleich zwischen genetischen Merkmalen innerhalb der Familie erlaubt die Identifizierung eines chromosomalen Abschnittes, der gemeinsam mit der Erkrankung an betroffene, nicht aber an gesunde Nachkommen vererbt wird. Innerhalb einer solch gekoppelten Region kann dann die krankheitsverursachende Mutation durch die Sequenzanalyse von Kandidatengenen ermittelt werden.

Das Prinzip der Kopplungsanalyse basiert auf einem strukturellen Umbau der Chromosomen durch den Austausch homologer Chromosomenabschnitte während der Meiose I der Keimzellbildung. Aufgrund der linearen Anordnung der Gene auf der chromosomalen DNA werden Gruppen von Allelen, die auf demselben kurzen Chromosomenabschnitt liegen, in einem Stammbaum gemeinsam (physikalisch gekoppelt) vererbt. Je weiter zwei Loci auf einem Chromosom voneinander entfernt sind, umso größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass diese durch ein Crossing-over getrennt werden. Die Rekombinationshäufigkeit ist somit ein Maß für die positionelle Entfernung verschiedener Loci. Zur Lokalisation des Krankheitsgens durch molekulargenetische Kopplungsanalyse werden statistische Verfahren angewendet, die die Wahrscheinlichkeit einer gekoppelten Vererbung in Beziehung zu einer zufälligen Mendelschen Transmission ermitteln. Häufig werden für Kopplungsanalysen Mikrosatelliten und Einzelnukleotid-Polymorphismen (single nucleotide polymorphism, SNP) als informative Marker verwendet. Obwohl die Kopplungsstudien hypothesenfrei einen Erkrankungslocus ermitteln können, ist deren Effizienz bei Vorliegen zahlreicher Erkrankungsloci (Locus- Heterogenität) gering.

Durch Kopplungsanalysen konnten IGE-Loci auf mehreren chromosomalen Segmenten (2q36, 3q26, 5p15, 5q22, 6p12, 6p23.1, 7q14, 8p12, 8q24, 11q13, 13q31, 14q23, 15q14, 18q21, 19q13) lokalisiert werden (Sander, et al., 2000; Durner, et al., 2001; Tauer, et al., 2005). Da aber die Mehrzahl dieser Loci in relativ kleinen Familien-Kollektiven (n < 50-120) festgestellt wurden, konnten die Replikationsstudien die ermittelten Phänotyp-Genotyp- Beziehungen nicht bestätigen. Dies deutet darauf hin, dass sehr grosse Familienkollektive für diese Studien benötigt werden. Bisher konnten bei den häufigen, genetisch komplexen IGE Syndromen die IGE-Gene BRD2 EFHC1, und ME2 identifiziert werden (Turnbull, et al., 2005).

1.5 Assoziationsanalysen

Genetische Assoziationen basieren auf dem Nachweis einer statistischen Häufung einer Sequenzvariation bei Erkrankten im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen. Ein mit der Krankheit assoziiertes Allel oder Locus in der Nähe eines assoziierten Allels kann das Risiko einer Erkrankung beeinflussen. Bei letzterem Fall spricht man von einem Kopplungsungleichgewicht eines Markerallels mit dem Allel des Erkrankungsgens. Entsprechend der CDCV-Hypothese (Reich, et al., 2001), spielen bei den meisten IGE- Patienten die Kombination verschiedener, häufiger Genvarianten mit kleinen Effekten eine ausschlaggebende Rolle, welche nicht durch Kopplungsanalysen detektierbar sind. Bei zahlreichen (n > 60) Assoziationsstudien von Kandidatengenen bei Epilepsien konnten einige positive Assoziationsbefunde festgestellt werden (BRD2, CACNA1A, CACNA1H, CACNG3, CHRNA4, CX36, EFHC2, GLUR5, GABRB3, KCNJ3, KCNJ6, KCNJ10, KCNMB3, LGI4, ME2, OPRM1) (Tan, et al., 2004). Bisher konnte aber nur die Assoziation der Gene KCNJ10 (Kalium-Kanalgen) und CX36 (Gen zur Kodierung neuronaler Zellbrückenproteins Connexin- 36) mit IGE bestätigt werden (Lenzen, et al., 2005).

1.5.1 Genom-weite Assoziationsstudien

Mit modernen Hochdurchsatz-Genotypisierungsverfahren ist es möglich, eine große Anzahl (> 1 Mio. SNPs) von genetischen Varianten zu bestimmen. Einer der häufigsten Sequenzpolymorphismen sind SNPs. Im gesamten menschlichen Genom tritt ca. alle 1000 Basenpaare ein SNP auf, die Anzahl der bekannten SNPs beträgt mehrere Millionen. Bei genomweiten Assoziationsstudien werden eine große Anzahl von SNPs (ca 1.000.000), verteilt über das gesamte Genom, in einem Patienten- und Kontrollkollektiv genotypisiert und die Allelfrequenzen durch statistische Verfahren verglichen. Das Ziel dabei ist, genetische Varianten zu entdecken, die mit der betreffenden Erkrankung assoziiert sind. Eine unterschiedliche Allelfrequenz in beiden Kollektiven weist auf eine Assoziation mit dem entsprechenden Phänotyp hin. Um falsch-positive Assoziationen, z.B. durch systematische Fehler bei der Auswahl der Probanden, durch zufällige Besonderheiten in der Zusammensetzung der untersuchten Populationen oder durch Genotypisierungsfehler zu vermeiden, ist es die Regel, die Ergebnisse von genomweiten Assoziationsstudien in weiteren unabhängigen Kollektiven zu replizieren. Zwar benötigt man auch für genomweite Assoziationsstudien eine sehr große Anzahl von Probanden (mehr als 1000), da man aber keine Familienverbände untersuchen muss, gestaltet sich der Rekrutierungsaufwand deutlich einfacher als für Kopplungsanalysen. Der Vorteil solcher genomweiten Analysen ist, dass hierfür vorab keine hypothetischen Annahmen bezüglich der Pathophysiologie der Erkrankung nötig sind

1.6 Sequenzanalysen von Kandidatengenen

Komplementär zu Kopplungs- und Assoziationsstudien wird die Sequenzanalyse als ein geeignetes Verfahren zur Identifizierung von Mutationen bei Kandidatengenen verwendet. Der Vorteil der Sequenzanalysen besteht neben einer höheren Auflösung darin, dass neu entdeckte und seltene Variationen erfasst werden können. Zu diesen Variationen können neben Punktmutationen (synonyme, nicht-synonyme und sinnentstellende Mutationen) kleine Deletionen bzw. Insertionen gezählt werden. Die Erfolgsaussichten einer Sequenzanalyse sind vorrangig von der Plausibilität der Funktion und chromosomalen Position der Kandidatengene abhängig.

Die Sequenzanalysen des T-Typ-Kalzium-Kanalgens CANA1H konnten zahlreiche nicht­synonyme Variationen bei Patienten mit einer Absence-Epilepsie identifizieren, welche in Kontrollpopulationen nicht beobachtet wurden (Chen, et al., 2003; Heron, et al., 2007). T-Typ Kalziumkanäle sind an der Initiierung von oszillatorischen Aktivitäten in thalamischen Kernen beteiligt, die eine wichtige Rolle bei der Entstehung von generalisierten spike-wave Aktivitäten spielen. Die Mehrzahl der bekannten Mutationen (n > 100) wurden im SCN1A Gen nachgewiesen (Zimprich, 2006), welches einen spannungsabhägigen Natriumkanal kodiert, der in Muskeln und Nerven lokalisiert ist. Da die bereits identifizierten Epilepsie­Gene überwiegend neuronale Ionen-Kanäle kodieren, werden die Epilepsien auch als Ionenkanal-Erkrankungen aufgefasst. In der vorliegenden Studie wurden deshalb Gene von neuronalen Ionen-Kanälen für die Sequenzanalysen ausgewählt. Obwohl die bekannten Epilepsie-Gene eine große Variabilität aufweisen, konvergieren die identifizierten Mutationen in ihren funktionellen Auswirkungen. Besonders häufig finden sich Störungen in der inhibitorische Signaltransduktion (Noebels, 2003a). Mehreren Kalium- und Kalzium­Kanalgene konnten bereits als Epilepsie-Gene beim Menschen identifiziert werden (siehe Tabelle 1.1). Daher wurden in dieser Arbeit vorranig Kandidatengene ausgewählt, die Kalium- und Kalzium-Ionenkanäle kodieren.

1.7 Zielsetzung

Die Zielsetzung dieser molekulargenetischen Arbeit besteht in der Lokalisation und Identifizierung von Genmutationen, die an der Pathogenese von häufigen IGE-Syndromen beteiligt sind. Zur Erfüllung dieser Aufgabenstellung sollten Kandidatengen-Sequenzanalysen und Assoziationsstudien durchgeführt werden.

Sequenzierung der Kandidatengene

Für die Sequenzanalysen wurden acht Kandidatengene, die an der neuronalen Signaltransduktion beteiligt sind, ausgewählt und in 95 Patienten mit familiärer IGE sequenziert. Die neu identifizierten Varianten wurden mittels mutation prediction- Programmen auf ihre funktionellen Auswirkungen überprüft und ihr Vorkommen in einem ethnisch zugeordneten Kontrollkolektiv getestet. Zur Bestätigung der Sequenzvariationen wurde die Methode Pyrosequencing verwendet. In Zeitraum dieser Studienarbeiten wurden CACNA1I Sequenzvarianten mit potentiell funktionellen Veränderungen auf eine Kosegregation mit der IGE-Erkrankung in der Ausgangsfamilie überprüft. Hierdurch lässt sich das Vorliegen einer IGE-verursachenden Mutation erhärten.

Assoziationsstudien von Kandidatenvariationen

In der Replikationsassoziationsstudie wurden die durch Sequenzierung identifizierten nicht­synonyme Varianten der acht Kandidatengene überprüft. Dafür wurde eine Genotypisierung mittels GenomeLab™ SNPstream® durchgeführt.

2. Material und Methoden

2.1 Studienprobanden und Material

2.1.1 Patienten und Kontroll-DNA

2.1.1.1 Proben für Sequenzanalyse der Kandidatengene

In Rahmen des Europäischen Integrated Project EPICURE wurden 95 unverwandte kaukasische IGE-Patienten für die Sequenzanalysen ausgewählt. Die Diagnose des IGE- Syndroms erfolgte anhand standardisierter diagnostischer Kriterien (http://www.ccg.uni- koeln.de/epilepsygenetics1.html) gemäß der Klassifikation der „International League Against Epilepsy“ (ILAE, 1989). In der Tabelle 2.1 sind die Herkunft, Geschlecht und Phänotypen der 33 männlichen und 62 weiblichen IGE Patienten aufgeführt. Die Einschlusskriterien definierten, dass mindestens zwei weitere Verwandte ersten Grades an einer IGE erkrankt sind. Dieses Vorgehen begünstigt das Vorliegen von Mutationen mit ausgeprägten genetischen Effekten.

Tabelle 2.1: Übersicht der untersuchten IGE-Patienten

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Legende: JME, Juvenile Myoklonische Epilepsie; JAE, Juvenile Absence Epilepsie; CAE, Absecne Epilepsie des Kinderalters; EGTCS, generalisierte Epilepsie mit tonischen klonischen Anfällen; n, Anzahl der Proben

Das Vorliegen von neu identifizierte nicht-synonymen Varianten bei den IGE Patienten wurde in 95 gesunden kaukasische Personen kontrolliert, um das Vorliegen unbedeutender Polymorphismen zu überprüfen. Alle Kontrollen sind über 30 Jahre alt, nicht verwandt und aus Westeuropa. Die Kontroll-Probanden hatten keine Familienmitglieder mit Epilepsie oder einer anderen schweren neuropsychiatrischen Erkrankung.

2.1.1.2 Studienkollektive der Assoziationsstudie

Die identifizierten nicht-synonymen Variationen der sequenzierten Kandidatengene wurden ausgewählt und einer Assoziationsstudie unterzogen. Hierdurch sollte das Vorliegen eines epileptogen Effekts mit geringer Effektstärke getestet werden. Die Genotypisierung der Sequenzvarianten erfolgte mittels SNPstream. Das Studienkollektiv umfasste 593 IGE- Patienten, 248 Trios mit IGE-betroffenen Kindern und 722 ethnisch zugeordnete Populationskontrollen.

2.1.2 Chemikalien, Enzyme und Kits

Soweit nicht anders vermerkt, wurden die verwendeten Chemikalien von den Firmen analytik jena (Jena), Merk KGaA (Darmstadt), Beckman&Coulter GmbH (Fullerton, USA), Biotage Sweden AB (Uppsala, Schweden), ABI Deutschland GmbH (Darmstadt), Thermo Scientific (Bonn) bezogen und in Analysequalität eingesetzt.

Die zur PCR und Sequenzierung verwendeten Oligonukleotid-Primer wurden von Sigma Aldrich Chemie GmbH (München), die Primer für die Pyrosequenzierungen von Operon Biotechnologies GmbH (Köln) bezogen.

Es wurden folgende Kits verwendet:

- SNPstream® Genotyping 48-plex Reagents Kit , Beckman Coulter (Fullerton, USA)
- BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit, ABI Deutschland GmbH (Darmstadt)

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