Der Organismus Hyphomicrobium zavarzinii ZV580 ist ein gram-negatives Bakterium, welches nach wie vor großes Forschungspotential bietet, da viele Stoffwechselwege und die daran beteiligten Enzyme bis jetzt nicht vollständig aufgeklärt worden sind. Neben einer bereits bekannten NAD+-unabhängigen, hochspezifischen Formaldehyd-Dehydrogenase besitzt es zudem eine Methylamin-Dehydrogenase. Dehydrogenasen katalysieren zahlreiche Reaktionen und sind auch in der Technik vielseitig einsetzbar, wie beispielsweise in elektrochemischen Biosensoren, die aufgrund ihrer umweltschonenden Arbeitsweise zunehmend an Aufmerksamkeit gewinnen. Die Methylamin-Dehydrogenase, welche für den Organismus Hyphomicrobium zavarzinii ZV580 beschrieben wurde, ist ein lösliches Quinoprotein, das die Umwandlung von Methylamin zu Formaldehyd katalysiert. Es setzt sich aus zwei Untereinheiten zusammen und besitzt den chinoiden Co-Faktor TTQ (Tryptohan Tryptophylquinon). Möglicherweise handelt es sich bei dem Enzym um eine der seltenen α, β-Methylamin-Dehydrogenasen. Wie alle Enzyme katalysiert auch die Methylamin-Dehydrogenase bei umkehrbaren Reaktionen die Gegenreaktion, in diesem Fall die Reduktion von Formaldehyd zu Methylamin. Dies macht sie zu einem potentiellen Kandidaten als Katalysator in einem Biosensor. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Teil der kleinen Untereinheit der Methylamin-Dehydrogenase aus Hyphomicrobium zavarzinii ZV580 kloniert um dadurch einen Ansatzpunkt für weiterreichende Aufklärungen der vollständigen Sequenz und somit auch regulatorischer Elemente für eine Expression zu schaffen. Für die Klonierung wurden drei verschiedene Primer-Paare, welche aus der N-Sequenzierung der bereits isolierten kleinen Einheit der Methylamin-Dehydrogenase M58001 aus dem Organismus Thiobacillus versutus hervorgegangen sind, bei unterschiedlichen Temperaturen mit einem Matrizenstrang hybridisiert. Dabei erhielten die PCR-Produkte einen Adenosin-Überhang und konnten anschließend in einen Vektor, welcher komplementäre Thymidin-Überhänge aufwies, ligiert und in kompetente E.coli Zellen transformiert werden. Nach der Isolierung und anschließenden Sequenzierung der erhaltenen Plasmid-DNA war es möglich eine 64 Aminosäuren umfassende Sequenz zu erhalten, welche eine Homologie von 93 % zu der Sequenz bereits isolierter und kristallisierter Untereinheiten der Methylamin-Dehydrogenase zeigt.
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1.1. Hyphomicrobium zavarzinii ZV580
1.2. Dehydrogenasen
1.2.1. Methylamin-Dehydrogenase
1.2.2. Anwendung
1.3. Zielsetzung
2. Material und Methoden
2.1. Materialien
2.1.1. Geräte
2.1.2. Chemikalien
2.1.3. Puffer und Lösungen
2.1.4. Medien
2.1.5. Verbrauchsmaterialien
2.1.5.1. Nukleinsäuren
2.1.5.2. Enzyme
2.1.5.3. Kits
2.1.5.4. Einmalartikel
2.1.5.5. Bakterienstämme
2.2. Methoden
2.2.1. Mikrobiologische Methoden
2.2.1.1. Kultivierung von Escherichia coli
2.2.1.2. Cryokonservierung
2.2.1.3. Herstellung chemisch kompetenter E.coli JM109
2.2.1.4. Kompetenztest der chemisch kompetenten E.coli JM109
2.2.2. Molekularbiologische Methoden
2.2.2.1. Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
2.2.2.2. Aufreinigung der DNA-Fragmente
2.2.2.3. Konzentrationsbestimmung der DNA
2.2.2.4. Ligation
2.2.2.5. Transformation
2.2.2.6. Blau-Weiß-Selektion
2.2.2.7. Plasmidpräparation
2.2.2.8. Restriktionsverdau
2.2.2.9. Agarose-Gelelektrophorese
2.2.2.10. Sequenzierung
3. Ergebnisse
3.1. Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) und Bestimmung der Größe der PCR-Produkte mittels Agarose-Gel
3.2. Konzentrationsbestimmung der DNA
3.3. Ligation und Transformation
3.4. Blau-Weiß-Screening der transformierten Klone
3.5. Plasmidpräparation und Restriktionsverdau
3.6. Sequenzanalyse
4. Diskussion
Zielsetzung & Themen
Ziel der Arbeit ist die Klonierung der Kodierungssequenz der kleinen Untereinheit der Methylamin-Dehydrogenase aus dem Organismus Hyphomicrobium zavarzinii ZV580 mittels Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR), um eine Grundlage für die rekombinante Expression und spätere Nutzung des Enzyms als Katalysator in Biosensoren zu schaffen.
- Klonierung der kleinen Untereinheit der Methylamin-Dehydrogenase
- Einsatz von PCR mit degenerierten Primern basierend auf Homologien
- Transformationsprozesse in E. coli zur Vermehrung der DNA
- Sequenzanalyse und Abgleich mit bekannten Gensequenzen
- Evaluierung der Eignung des Enzyms für Biosensor-Anwendungen
Auszug aus dem Buch
1.2.1. Methylamin-Dehydrogenase
Die Methylamin-Dehydrogenase, auch bekannt als Amin-Dehydrogenase, ist ein lösliches Quinoprotein, welches die oxidative Desaminierung von primären Aminen zu Aldehyden und Ammonium, wie zum Beispiel die Umwandlung von Methylamin zu Formaldehyd, katalysiert [13, 21]. Das Enzym besitzt den chinoiden Co-Faktor TTQ (Tryptohan Tryptophylquinon, Abb. 2), welcher in der Enzym-Matrix über eine Amin-Bindung kovalent an das Protein gebunden ist [13, 26].
Die Methylamin-Dehydrogenase ist ein hetero-Tetramer und weist in ihrer nativen Form eine α2β2-Struktur mit einer großen α - Untereinheit (40 – 48kDa) auf, welche weder organische noch anorganische Co-Faktoren besitzt, und einer kleinen β-Untereinheit (8-16 kDa), welche die prosthetische Gruppe TTQ beinhaltet [14]. Der katalytische Mechanismus kann in eine reduktive und eine oxidative Reaktion unterteilt werden [13]. Im reduktiven Teil (Abb. 3) greift Methylamin das C-6 Quinon-Kohlenstoffatom des Co-Faktors TTQ an, wobei über ein Carbinol-Intermediat eine Iminoquinon-Spezies gebildet wird. In der zweiten, oxidativen Teilreaktion werden dann zwei Elektronen auf einen Elektronenakzeptor, beispielsweise das blaue Kupferprotein Amicyanin, welches Elektronen zu löslichen periplasmatischen Cytochromen vom Typ C transportiert [15], übertragen und die Methylamin-Dehydrogenase geht wieder in ihre oxidierte Quinon-Form über [13].
Zusammenfassung der Kapitel
1. Einleitung: Beschreibt die wissenschaftliche Bedeutung von Enzymen und Hyphomicrobium zavarzinii ZV580 sowie die Zielsetzung der Klonierung der Methylamin-Dehydrogenase.
2. Material und Methoden: Detaillierte Auflistung der verwendeten Laborgeräte, Chemikalien, Medien sowie der molekularbiologischen und mikrobiologischen Arbeitsschritte.
3. Ergebnisse: Dokumentation der durchgeführten PCR-Ansätze, der Ligation, Transformation und der nachfolgenden Sequenzanalyse der Klonierungsfragmente.
4. Diskussion: Interpretation der erzielten Ergebnisse, Analyse der Klonierungseffizienz und Ausblick auf zukünftige Forschungsmöglichkeiten wie RACE-PCR.
Schlüsselwörter
Methylamin-Dehydrogenase, Hyphomicrobium zavarzinii, Klonierung, PCR, Biosensor, Quinoprotein, TTQ, Genom, DNA-Fragment, Sequenzanalyse, Transformation, Enzym, Dehydrogenase, Bakterien, Hetero-Tetramer.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?
Die Arbeit beschäftigt sich mit der molekularbiologischen Klonierung der Kodierungssequenz einer spezifischen Untereinheit der Methylamin-Dehydrogenase aus dem Bakterienstamm Hyphomicrobium zavarzinii.
Was sind die zentralen Themenfelder?
Zentrale Felder sind die Enzymologie der Dehydrogenasen, bakterielle Genetik und spezifische molekularbiologische Standardmethoden wie PCR und Klonierung.
Was ist das primäre Ziel der Arbeit?
Das primäre Ziel ist es, die Gensequenz der kleinen Untereinheit der Methylamin-Dehydrogenase zu isolieren, um als Startpunkt für eine rekombinante Expression des Enzyms zu dienen.
Welche wissenschaftliche Methode wurde verwendet?
Es wurde eine Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) basierend auf Primer-Homologie zu bekannten Sequenzen verwandt, gefolgt von einer Transformation in E. coli-Zellen und einer Sequenzanalyse.
Was wird im Hauptteil behandelt?
Der Hauptteil behandelt die detaillierte Durchführung der PCR, der Aufreinigung der DNA, der Ligation in Vektoren und des Screenings erfolgreicher Klone.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Kernbegriffe sind Methylamin-Dehydrogenase, Hyphomicrobium zavarzinii, PCR-Klonierung und Biosensorik.
Wie erfolgreich war die Klonierung laut der Sequenzanalyse?
Die Sequenzanalyse ergab, dass eines der klonierten Fragmente eine signifikante Homologie von 93 % zu den kleinen Untereinheiten bereits bekannter Methylamin-Dehydrogenasen aufweist, was den Erfolg der Isolierung stützt.
Warum spielt die Wahl der Primer eine so wichtige Rolle für das Ergebnis?
Die Arbeit zeigt, dass die Spezifität der Primer entscheidend ist, da nur das aus der N-terminalen Sequenz abgeleitete Primer-Paar zu einem Fragment führte, das die gewünschte hohe Homologie aufwies.
- Arbeit zitieren
- B. Sc. Romy Bräutigam (Autor:in), 2009, Klonierung der Kodierungssequenz der kleinen Einheit der Methylamin-Dehydrogenase aus Hyphomicrobium zavarzinii ZV 580, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/164869
