Der Organismus Hyphomicrobium zavarzinii ZV580 ist ein gram-negatives Bakterium, welches nach wie vor großes Forschungspotential bietet, da viele Stoffwechselwege und die daran beteiligten Enzyme bis jetzt nicht vollständig aufgeklärt worden sind. Neben einer bereits bekannten NAD+-unabhängigen, hochspezifischen Formaldehyd-Dehydrogenase besitzt es zudem eine Methylamin-Dehydrogenase. Dehydrogenasen katalysieren zahlreiche Reaktionen und sind auch in der Technik vielseitig einsetzbar, wie beispielsweise in elektrochemischen Biosensoren, die aufgrund ihrer umweltschonenden Arbeitsweise zunehmend an Aufmerksamkeit gewinnen. Die Methylamin-Dehydrogenase, welche für den Organismus Hyphomicrobium zavarzinii ZV580 beschrieben wurde, ist ein lösliches Quinoprotein, das die Umwandlung von Methylamin zu Formaldehyd katalysiert. Es setzt sich aus zwei Untereinheiten zusammen und besitzt den chinoiden Co-Faktor TTQ (Tryptohan Tryptophylquinon). Möglicherweise handelt es sich bei dem Enzym um eine der seltenen α, β-Methylamin-Dehydrogenasen. Wie alle Enzyme katalysiert auch die Methylamin-Dehydrogenase bei umkehrbaren Reaktionen die Gegenreaktion, in diesem Fall die Reduktion von Formaldehyd zu Methylamin. Dies macht sie zu einem potentiellen Kandidaten als Katalysator in einem Biosensor. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Teil der kleinen Untereinheit der Methylamin-Dehydrogenase aus Hyphomicrobium zavarzinii ZV580 kloniert um dadurch einen Ansatzpunkt für weiterreichende Aufklärungen der vollständigen Sequenz und somit auch regulatorischer Elemente für eine Expression zu schaffen. Für die Klonierung wurden drei verschiedene Primer-Paare, welche aus der N-Sequenzierung der bereits isolierten kleinen Einheit der Methylamin-Dehydrogenase M58001 aus dem Organismus Thiobacillus versutus hervorgegangen sind, bei unterschiedlichen Temperaturen mit einem Matrizenstrang hybridisiert. Dabei erhielten die PCR-Produkte einen Adenosin-Überhang und konnten anschließend in einen Vektor, welcher komplementäre Thymidin-Überhänge aufwies, ligiert und in kompetente E.coli Zellen transformiert werden. Nach der Isolierung und anschließenden Sequenzierung der erhaltenen Plasmid-DNA war es möglich eine 64 Aminosäuren umfassende Sequenz zu erhalten, welche eine Homologie von 93 % zu der Sequenz bereits isolierter und kristallisierter Untereinheiten der Methylamin-Dehydrogenase zeigt.
Inhaltsverzeichnis
- Zusammenfassung
- Summary
- Inhaltsverzeichnis
- 1. Einleitung
- 1.1. Hyphomicrobium zavarzinii ZV580
- 1.2. Dehydrogenasen
- 1.2.1. Methylamin-Dehydrogenase
- 1.2.2. Anwendung
- 1.3. Zielsetzung
- 2. Material und Methoden
- 2.1. Materialien
- 2.2. Methoden
- 2.2.1. Mikrobiologische Methoden
- 2.2.2. Molekularbiologische Methoden
- 3. Ergebnisse
- 4. Diskussion
- 5. Literatur
- 6. Anhang
Zielsetzung und Themenschwerpunkte
Die Bachelorarbeit untersucht die Klonierung eines Teils der kleinen Untereinheit der Methylamin-Dehydrogenase aus dem Bakterium Hyphomicrobium zavarzinii ZV580. Ziel ist es, einen Ausgangspunkt für die Aufklärung der vollständigen Sequenz und regulatorischer Elemente für die Expression dieses Enzyms zu schaffen. Die Arbeit trägt zum Verständnis des Stoffwechsels dieses Bakteriums bei und hat mögliche Anwendungen in der Entwicklung umweltschonender Biosensoren.
- Klonierung der kleinen Untereinheit der Methylamin-Dehydrogenase
- Charakterisierung der klonierten Sequenz
- Homologievergleich mit bereits bekannten Sequenzen
- Potentielle Anwendung in Biosensoren
- Aufklärung von Stoffwechselwegen in Hyphomicrobium zavarzinii ZV580
Zusammenfassung der Kapitel
1. Einleitung: Dieses Kapitel führt in die Thematik ein und beschreibt den Organismus Hyphomicrobium zavarzinii ZV580, seine Methylamin-Dehydrogenase, deren Funktion und ihr Potential für biotechnologische Anwendungen, insbesondere in Biosensoren. Die Zielsetzung der Arbeit wird klar definiert – die Klonierung eines Teils der kleinen Untereinheit des Enzyms, um die vollständige Sequenz aufzuklären und regulatorische Elemente für die Expression zu identifizieren. Es werden die Bedeutung von Dehydrogenasen im Allgemeinen und die Besonderheiten der Methylamin-Dehydrogenase hervorgehoben, um den Kontext der Forschungsarbeit zu verdeutlichen.
2. Material und Methoden: Dieses Kapitel detailliert die verwendeten Materialien, Geräte, Chemikalien, Medien und Methoden. Es beschreibt die mikrobiologischen Methoden, wie die Kultivierung und die Herstellung chemisch kompetenter E.coli Zellen, sowie die molekularbiologischen Methoden, einschließlich PCR, DNA-Aufreinigung, Ligation, Transformation, Plasmidpräparation, Restriktionsverdau, Agarose-Gelelektrophorese und Sequenzierung. Der detaillierte methodische Ablauf stellt die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse sicher und ermöglicht eine fundierte Bewertung der Arbeit. Die Beschreibung der verwendeten Techniken zeigt ein tiefes Verständnis der zugrundeliegenden Prinzipien und die Anwendung verschiedener Methoden zur Klonierung und Charakterisierung der Sequenz.
3. Ergebnisse: In diesem Kapitel werden die Ergebnisse der durchgeführten Experimente präsentiert und detailliert dargestellt. Die Ergebnisse der PCR, die Bestimmung der Größe der PCR-Produkte mittels Agarosegel-Elektrophorese, die Konzentrationsbestimmung der DNA, die Ligation und Transformation, das Blau-Weiß-Screening, die Plasmidpräparation und der Restriktionsverdau werden erläutert. Die Sequenzanalyse der erhaltenen Plasmid-DNA wird beschrieben, wobei die erhaltene 64 Aminosäuren umfassende Sequenz und ihre Homologie zu bereits bekannten Sequenzen hervorgehoben werden. Die Ergebnisse werden durch Abbildungen und Tabellen visuell unterstützt und liefern klare Beweise für den Erfolg der Klonierung.
4. Diskussion: Das Kapitel Diskussion analysiert und interpretiert die erhaltenen Ergebnisse und setzt diese in den Kontext der bestehenden Literatur und des aktuellen Forschungsstands. Die hohe Homologie der klonierten Sequenz zu bereits bekannten Sequenzen der Methylamin-Dehydrogenase wird diskutiert und bestätigt, dass es sich mit hoher Wahrscheinlichkeit um die kleine Untereinheit des Enzyms handelt. Die Bedeutung der Ergebnisse für zukünftige Forschungsschritte wird erläutert und die möglichen Limitationen und Fehlerquellen der durchgeführten Experimente werden kritisch bewertet. Es werden Ausblicke auf zukünftige Forschungsfragen und -methoden gegeben, die auf den Ergebnissen dieser Arbeit aufbauen.
Schlüsselwörter
Hyphomicrobium zavarzinii ZV580, Methylamin-Dehydrogenase, Klonierung, PCR, Sequenzierung, Homologie, Biosensor, Quinoprotein, TTQ (Tryptophan Tryptophylquinon), α,ß-Methylamin-Dehydrogenase, Genexpression.
Häufig gestellte Fragen zur Bachelorarbeit: Klonierung eines Teils der kleinen Untereinheit der Methylamin-Dehydrogenase aus Hyphomicrobium zavarzinii ZV580
Was ist das Thema der Bachelorarbeit?
Die Bachelorarbeit befasst sich mit der Klonierung eines Teils der kleinen Untereinheit der Methylamin-Dehydrogenase aus dem Bakterium Hyphomicrobium zavarzinii ZV580. Ziel ist die Aufklärung der vollständigen Sequenz und der regulatorischen Elemente für die Expression dieses Enzyms.
Warum ist die Methylamin-Dehydrogenase wichtig?
Die Methylamin-Dehydrogenase ist ein wichtiges Enzym im Stoffwechsel von Hyphomicrobium zavarzinii ZV580. Sie hat zudem ein großes Potential für biotechnologische Anwendungen, insbesondere in der Entwicklung umweltschonender Biosensoren.
Was sind die Ziele der Arbeit?
Die Hauptziele sind die Klonierung der kleinen Untereinheit der Methylamin-Dehydrogenase, die Charakterisierung der klonierten Sequenz mittels Homologievergleich und die Erforschung der potentiellen Anwendung in Biosensoren. Letztendlich soll ein besseres Verständnis des Stoffwechsels von Hyphomicrobium zavarzinii ZV580 erreicht werden.
Welche Methoden wurden verwendet?
Die Arbeit verwendet mikrobiologische Methoden (Kultivierung, Herstellung chemisch kompetenter E.coli Zellen) und molekularbiologische Methoden (PCR, DNA-Aufreinigung, Ligation, Transformation, Plasmidpräparation, Restriktionsverdau, Agarose-Gelelektrophorese und Sequenzierung).
Welche Ergebnisse wurden erzielt?
Die Arbeit beschreibt erfolgreich die Klonierung eines Teils der kleinen Untereinheit. Die Sequenzierung ergab eine 64 Aminosäuren umfassende Sequenz mit hoher Homologie zu bekannten Sequenzen der Methylamin-Dehydrogenase. Die Ergebnisse werden durch Abbildungen und Tabellen visualisiert.
Wie werden die Ergebnisse interpretiert?
Die hohe Homologie bestätigt die erfolgreiche Klonierung der Zielsequenz. Die Diskussion beleuchtet die Bedeutung der Ergebnisse für zukünftige Forschung und bewertet kritisch mögliche Limitationen und Fehlerquellen. Ausblicke auf zukünftige Forschungsfragen werden gegeben.
Welche Schlüsselwörter beschreiben die Arbeit?
Schlüsselwörter sind: Hyphomicrobium zavarzinii ZV580, Methylamin-Dehydrogenase, Klonierung, PCR, Sequenzierung, Homologie, Biosensor, Quinoprotein, TTQ (Tryptophan Tryptophylquinon), α,β-Methylamin-Dehydrogenase, Genexpression.
Welche Kapitel beinhaltet die Arbeit?
Die Arbeit umfasst eine Einleitung, ein Kapitel zu Material und Methoden, ein Kapitel zu den Ergebnissen, eine Diskussion, Literaturverzeichnis und einen Anhang. Eine Zusammenfassung und ein Inhaltsverzeichnis sind ebenfalls enthalten.
- Quote paper
- B. Sc. Romy Bräutigam (Author), 2009, Klonierung der Kodierungssequenz der kleinen Einheit der Methylamin-Dehydrogenase aus Hyphomicrobium zavarzinii ZV 580, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/164869
