Entwicklung eines mechanistischen Modells zur Simulation der frostbedingten N2O Emission aus Böden

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

1 Einleitung

2 Stand des Wissens
2.1 N₂O
2.2 Allgemeine Grundlagen des Stickstoffkreislaufes im Boden
2.3 N₂O-Bildung während Frostereignisse
2.3.1 Einfluss auf die Bodenphysik
2.3.2 Einfluss auf die Bodenchemie
2.3.3 Einfluss auf die Bodenbiologie
2.4 Denitrifikation
2.4.1 Biologische Denitrifikation
2.4.1.1 Bakterielle Enzyme der Denitrifikation
2.4.1.2 Pilzliche Denitrifikation und Codenitrifikation
2.4.2 Chemodenitrifikation
2.4.3 Regulation der Denitrifikation
2.5 Denitrifikationsmodelle - kurzerüberblick

3 Materialien und Methoden
3.1 Materialien
3.1.1 Daten aus Literatur
3.1.2 ModelMaker©
3.2 Methoden
3.2.1 Integrationsverfahren
3.2.2 Enzymkinetik
3.2.3 15 N-Tracer-Technik

4 Modellentwicklung
4.1 Modellbeschreibung
4.2 Graphische Darstellung des Modells

5 Sensitivitätsanalyse
5.1 Temperatur
5.2 Kohlenstoffversorgung
5.3 Sauerstoffgehalt
5.4 Wassergehalt
5.5 Nitratgehalte

6 Modellvalidierung

7 Diskussion

8 Literatur

9 Abbildungsverzeichnis

10 Tabellenverzeichnis

11 Anhang

Abkürzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1 Einleitung

Böden spielen im Stoffhaushalt der Landschaften die zentrale Rolle. Sie sind die Senke für natürlich und anthropogen eingetragene Stoffe, die dort angereichert, transformiert und wieder abgegeben werden können. Die Transformationsprozesse sind hauptsächlich mikrobielle Umsetzungen und findenüberwiegend in den humusreichen Oberböden statt. So finden auch zentrale Prozesse des Stickstoffkreislaufes im Boden statt, die Stickstoff- Mineralisierung (organisch ➔ anorganisch), die Stickstoff-Immobilisierung (anorganisch ➔ organisch), die Nitrifikation und die Denitrifikation (Friedel & Leitgeb, 2003).

Die Denitrifikation und die Nitrifikation haben große globale Bedeutung bei der Bildung der gasförmigen Stickstoffverbindungen Stickstoffmonoxid (NO), Distickstoffmonoxid (N₂O) und elementarer Stickstoff (N2). Diese emittieren in die Atmosphäre und der mineralische Stickstoff wird so aus dem Boden entfernt und steht den Pflanzen nicht mehr zur Verfügung (Madigan et al., 2000). N₂O steht nach Kohlenstoffdioxid (CO₂) und Methan (CH₄) an dritter Stelle der wichtigsten Treibhausgase und besitzt darüber hinaus ein Ozon zerstörendes Potential.

Landwirtschaftlich genutzte Böden sind die größte Quelle für anthropogen verursachte N₂O- Emissionen (Ruser, 2001).

Die N₂O-Emissionsrate zeigt das ganze Jahr durchweg hohe Variationen, zwischen den Monaten aber auch von Woche zu Woche, von Tag zu Tag und sogar innerhalb eines Tages (Granli & Bockman, 1994). Von aktuell besonderem Interesse sind vor allem N₂O- Emissionen nach Frost-Tau Ereignissen. An wenigen Tagen können bisüber 70% der Gesamtjahresemission nach solchen Ereignissen emittieren (Röver, 1998). Die Ursachen hinter diesem Phänomen sind noch nicht vollständig aufgeklärt und das Wissenüber die Prozesse, die sich dahinter verbergen könnten, ist noch sehr gering (Öquist, 2007).

Seid ca. 100 Jahren existiert die Ammoniaksynthese nach Haber-Bosch und damit auch die Möglichkeit Luftstickstoff zu binden und Stickstoffdünger in großen Massen industriell zu produzieren. Neben den positiven Effekten einer Stickstoffdüngung treten auch unerwünschte Nebenwirkungen, wie die erhöhte Emission von N₂O und NO aus Böden und die Nitratbelastung von Grund- und Oberflächengewässern auf. Die N₂O-Emissionen aus nitratbelasteten Gewässern können von der gleichen Größenordnung sein wie die direkten N₂O-Flüsse aus dem Boden (Onigkeit, 2006).

Seit dem 27.02.2007 gilt die Neufassung der Düngeverordnung. In ihr werden sowohl Aussagen zum Schutz vor Nährstoffeinträgen aus landwirtschaftlichen Quellen in Gewässer gemacht, als auch auf die „Anwendung von Berechnungs- und Schätzverfahren, die auf fachspezifischen Erkenntnisse beruhen.“ (Düngeverordnung, 2007) hingewiesen.

Da Böden sehr heterogene Medien sind, lokale Umweltparameter sehr differenziert wirken können und darüber hinaus die Prozesse in ihnen in einer sehr kleinen Skalenebene ablaufen, sind Messungen gasförmiger Stickstoffverbindungen nicht ganz unproblematisch. Als hilfreiches Werkzeug werden daher verstärkt experimentell die¹⁵ N-Tracertechnik sowie theoretisch Computermodelle eingesetzt, um diese Prozesse besser nachzuvollziehen und zu erforschen.

Die vorliegende Diplomarbeit hat das Ziel ein mechanistisches Modell zu entwickeln, welches die speziell während Frost-Auftau-Phasen auf den mikrobiellen Stickstoffumsatz im Boden wirkenden Prozesse simulieren kann. Die Arbeit dient somit zum einen der Verbesserung des Prozessverständnisses unter besonderer Berücksichtigung von Frost- Auftau-Phasen sowie darüber hinaus der Weiterentwicklung bestehender Stickstoffumsatzmodelle zur Verbesserung der Prognosesicherheit bodenbürtiger Stickstoffemissionen.

2 Stand des Wissens

2.1 N2O

N₂O zählt neben CO₂, CH₄, Ozon (O₃) und Wasserdampf zu den klimarelevanten Spurengasen. Das bedeutet, dass es durch seine Absorptionsfähigkeit im Infrarot- Spektralbereich einen Einfluss auf den Wärmehaushalt der Erdatmosphäre hat. Die wärmestauende Wirkung von Spurengasen verursacht den natürlichen Treibhauseffekt. Auf der Erdoberfläche würde eine durchschnittliche Temperatur von -18°C herrschen, wenn diese Spurengase nicht in der Atmosphäre vorhanden wären. Jedoch existiert ein zusätzlicher Treibhauseffekt, der durch die Erhöhung der natürlichen Konzentrationen von klimarelevanten Spurengasen erzeugt wird (Tabelle 2.1). Er wird als anthropogener Treibhauseffekt bezeichnet, da die Konzentrationsanstiege auf menschliches Handeln zurückgeführt werden (Ernst, 1997). Nach dem IPPC Bericht von 2007 betrug die N₂O- Konzentration in der Atmosphäre im Jahr 2005 319ppm (IPCC 2007). Seit der Industrialisierung ist diese Konzentration von ursprünglich 270ppm somit um 18% gestiegen. N₂O ist trotz seiner niedrigen Konzentration zu 6% am anthropogenen Treibhauseffekt beteiligt. Das liegt daran, dass N₂O eine 200-fach höhere Absorptionsfähigkeit für infrarote Strahlung und insgesamt das 310-fache GWPb im Vergleich zu CO₂ besitzt. Außerdem hat es eine sehr lange mittlere atmosphärische Verweildauer von 114 Jahren (Tabelle 2.1).

Tabelle 2.1 Eigenschaften der Treibhausgase N₂O, CO₂ und CH₄ (IPCC 2001)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

N₂O ist aber nicht nur wegen seiner Eigenschaften als Treibhausgas klimarelevant. Es spielt auch eine Rolle bei der Zerstörung von stratosphärischem O₃.

Durch Photolyse von O₃ oder N₂O entsteht elektronisch angeregter Sauerstoff O(D¹ ). Dieser reagiert mit N₂O zu NO, welches dann mit O₃ zu NO₂ und O₂ reagiert und dadurch zum Ozonabbau in der Stratosphäre beiträgt.

Böden sind weltweit die wichtigsten Quellen für N₂O. Natürliche Quellen sind vor allem tropische Böden. Allerdings geben landwirtschaftlich genutzte Böden mehr als die Hälfte der anthropogen verursachten N₂O-Emission ab. Das bodenbürtige N₂O stammt zumüberwiegenden Anteil aus den mikrobiologischen Prozessen Nitrifikation und Denitrifikation (Sehy, 2004).

Die höchsten N₂O-Emissionsraten werden unter feuchten Bedingungen auf gedüngten oder frisch gepflügten Böden sowie in auftauenden Böden gemessen (Munch, 2007). Die Beziehung zwischen Denitrifikationsrate (Nitratreduktion) und N₂O-Emission ist nicht immer positiv linear. Im Zuge einer vollständigen Denitrifikation kann N₂O weiter zum Endprodukt N2 reduziert werden, wobei jedoch die N₂O-Reduktion und die Nitratreduktion von wirkenden Umweltparametern unterschiedlich beeinflusst werden (Tabelle 2.2).

Tabelle 2.2 Effekt von Umweltparametern auf die Denitrifikation und das N₂O/N2 - Verhältnis der Denitrifikation (nach Munch, 2007)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.2 Allgemeine Grundlagen des Stickstoffkreislaufes im Boden

Die zentralen mikrobiellen Prozesse des Stickstoffkreislaufes im Boden sind die N- Mineralisation, die N-Immobilisierung, die Nitrifikation und die Denitrifikation sind in Abbildung 2.1 dargestel]]lt.

Die Umwandlung von organisch gebundenem Stickstoff in die anorganischen Stickstoffverbindungen Ammonium (NH4+) und Nitrat (N O₃-) geschieht durch Mineralisation (Ammonifikation) und Nitrifikation. Endprodukt der Mineralisation und Substrat für die Nitrifikation ist Ammonium. NH4+ kann durch autotrophe und heterotrophe Nitrifikation zu Nitrat oxidiert werden. Bei Sauerstoffmangel wird das Nitrat oder Nitrit (NO₂-) durch Denitrifikation zu den gasförmigen Stickstoffverbindungen NO, N₂O oder N2 reduziert.

Pflanzen und Mikroorganismen können Nitrat und Ammonium aufnehmen und in Biomasse umwandeln und liefern nach dem Absterben neue stickstoffhaltige organische Substanz. Nitrat kann durch Auswaschung und die gasförmigen Stickstoffverbindungen NO, N₂O und N2 können durch Emission dem Ökosystem verloren gehen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.1 Schema der Nitrifikation und Denitrifikation als wichtige Prozesse der N- Spurengasproduktion (verändert nach Sich 1997)

Die autotrophe Nitrifikation ist ein zweistufiger Prozess, der von unterschiedlichen Bakteriengruppen durchgeführt wird: den Ammoniakoxidierern, meist aus der Gruppe der Nitrosomonas und den Nitritoxideren, meist aus der Gruppe der Nitrobacter. CO₂ dient den Mikroorganismen als Kohlenstoffquelle (Robertson & Groffmann, 2007). Ammonium bildet ein Dissoziationsgleichgewicht mit Ammoniak. Wegen der Beteiligung eines Oxonium-Ions ist dieses Gleichgewicht vom pH-Wert abhängig. Der Anteil des Ammoniaks steigt mit zunehmendem pH-Wert und steigender Temperatur (Mortimer, 1976). Der erste Schritt dieser Oxidation wird durch das membrangebundene Enzym Ammoniak-Monooxigenase (AMO) katalysiert.

NH₃ + 2H+ + O₂ + 2e ➔ AMO NH₂OH + H₂O (1)

Diese Reaktion ist nicht umkehrbar. Das gebildete Hydroxylamin (NH2OH) wird weiter zu Nitrit durch die NH2OH-Oxidoreduktase (NH2OH-OR) oxidiert.

NH₂OH + H₂O NH² OH-OR ➔ 4e + 5H+ + NO₂- (2)

Zwei der gebildeten e- gehen wieder in die vorherige Reaktion (Gleichung 1) ein. Die anderen zwei e- werden für den Elektronentransport zur Energiegewinnung genutzt. Bei der Oxidation von NH2OH zu NO₂- kann auch NO entstehen, das dann in die Atmosphäre emittieren kann. Ammoniakoxidierer scheinen bei O2-Mangel auch in der Lage zu sein NO₂- als Elektronenakzeptor nutzen zu können und durch NO₂- -Reduktion NO und weiter N₂O zu bilden. Man spricht dann von denitrifizierenden Nitrifizierern.

Nitrit wird nicht vom Boden akkumuliert sondern relativ schnell von nitritoxidierenden Bakterien oxidiert. Die Reaktion (Gleichung 3) wird durch die membrangebundene Nitrit- Oxidoreduktase (NIOR) katalysiert und ist reversibel (Robertson & Groffman, 2007) (Stange, 2000).

NO₂- + H2O NIOR N O₃- + 2H+ + 2e- (3)

Die heterotrophe Nitrifikation umgeht den Weg der Mineralisierung und wandelt den organisch gebundenen Stickstoff gleich in Nitrat um. Die Mikroorganismen der heterotrophen Nitrifikation erzielen keinen Energiegewinn bei dieser Umsetzung (Ferguson, 2007).

Die Denitrifikation ist die Reduktion von Nitrat und Nitrit zu den Gasen NO, N₂O oder N2. Sie findet unter anaeroben Bedingungen statt. Die Mikroorganismen der Denitrifikation nutzen die organische Substanz als Energiequelle (Robertson & Groffman, 2007). Lange wurde angenommen, dass nur die bakterielle Denitrifikation N₂ produzieren und somit den Stickstoffkreislauf schließen kann. In den letzten Jahren sind jedoch zwei weitere N₂ produzierende Prozesse entdeckt worden, die anaerobe Ammonium-Oxidation (Anammox) und die Codenitrifikation. Bei ersterer oxidieren spezielle Bakterien NH4 und NO₂ zu N2. Dieser Prozess findet nur unter strickt anaeroben Bedingungen statt und wurde bisher nur für aquatische Ökosysteme beschrieben (den Camp et al., 2006). Die Codenitrifikation ist aktuell nur bei Pilzen und Strahlenpilzen nachgewiesen worden. Ihre Bedeutung für den Stickstoffumsatz in Böden ist bisher jedoch nur unzureichend untersucht worden (Laughlin et al., 2002).

2.3 N2O-Bildung während Frostereignisse

Fast ein Drittel der Kontinentalfläche ist für 3 bis 9 Monate Temperaturen von unter 0°C ausgesetzt. Solche Kälteperioden kann man in die 3 Abschnitte Gefrieren, anhaltender Frost und Eisschmelze/Tauen untergliedern. Im dritten Abschnitt kommt es vermehrt zu Frost-Tau- Zyklen. Die Ausdehnung und die Dauer dieser Perioden und ebenso die Stickstofftransformationsraten variieren sowohl lokal als auch temporär zwischen den Jahren (Stres, 2007).

In vielen Untersuchungen z.B. (Röver, 1998; Flessa, 1995; Teepe, 2000; Ruser, 2001) wurde eine erhöhte N₂O-Emission bei Frost-Tau-Prozessen beschrieben.

Versuche von Müller (2002), Sehy (2004), Morkved (2006) und Öquist (2007), in denen mit dem stabilen Stickstoffisotop¹⁵ N gearbeitet wurde, identifizieren eindeutig die Denitrifikation als verursachenden Prozess dahinter.

Hypothesen zur Ursache:

1. das teilweise Gefrieren des Bodenwassers konzentriert die Substrate der Denitrifikation in der flüssige Phase auf
2. durch den Bodenfrost kommt es zu einem teilweise Absterben der mikrobiellen Biomasse, so dass leicht verwertbare C- und N-Verbindungen freigesetzt werden und sich die Verfügbarkeit im Boden erhöht
3. die Gasdiffusion wird durch Eisbildung in den Bodenporen verringert, so dass der Sauerstoffpartialdruck im Boden sinkt und gleichzeitig das N₂O nur vermindert entweichen kann
4. durch die Bildung von Eis und das Aufkonzentrieren von Ionen im Restwasser, kommt es zu einer Erniedrigung des Matrixpotentials und zu einem kapillaren Aufstieg von Wasser aus dem Unterboden
5. die N₂O-Reduktase wird bei Einsetzen denitrifikatorischer Bedingungen später von den Bakterien gebildet als die vorherigen Enzyme und/oder die Denitrifikation während Frost-Tau-Phasen wird von Pilzen dominiert, die keine N₂O-Reduktase besitzen Im nachfolgenden Absatz sollen die Prozesse, die während des Frostes im Boden ablaufen und die N₂O-Emission beeinflussen, theoretisch betrachtet werden.

2.3.1 Einfluss auf die Bodenphysik

Aufgrund seiner hohen volumetrischen Wärmekapazität hat Wasser für die thermischen Eigenschaften der Böden eine besondere Bedeutung (Bachmann (a), 2006). Niedrige Temperaturen im Boden verursachen Bewegungsvorgänge wie die Kontraktion der Bodenmatrix infolge des Temperaturrückgangs (negative Wärmeausdehnung), die Eissprengung durch Volumenzunahme des gefrierenden Bodenwassers oder die Eislinsenbildung (Eiskristalle) (Scheffer, Schachtschabel, 2002).

Auf landwirtschaftlich genutzten Böden wurdeüber den Winter eine Verringerung der Lagerungsdichte und des Eindringungswiderstandes verursacht durch gefrierendes und wieder auftauendes Wasser beobachtet. Dieser Vorgang wird für die Veränderung der Bodenstruktur während Frost-Tau-Ereignissen verantwortlich gemacht (Henry, 2007).

Wenn ein Teil des Porenwassers gefriert, wirkt das zum einen hydraulisch ähnlich wie der Entzug der gleichen Menge Wasser und zum anderen konzentrieren sich die gelösten Stoffe im Restwasser auf. Beides führt zur Erniedrigung des Matrixpotentials. So ist es möglich, dass es zum kapillaren Aufstieg von flüssigem Wasser aus dem Unterboden kommt (Abb. 2.2 und 2.3). Bei Temperaturen unterhalb von 0°C liegt Bodenwasser in flüssigem Zustand als dünner Wasserfilm auf Bodenpartikeln und Eiskristalloberflächen vor. Der Anteil an nicht gefrorenem Wasser kann sehr klein werden, geht aber bei unsüblichen Temperaturen nicht auf Null (Bachmann (b), 2006).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.2 Durch Gefrieren induzierte Umverteilung des Wassers in einem Schluff-Boden. Wassergehalt beinhaltet Eis. (aus Edwards, 1992) (A=Beginn des Vorgangs, D=Ende der Umverteilung)

Zwei wichtige Punkte, in denen die chemischen die physikalischen Bodeneigenschaften in einer Frost-Tau-Umgebung beeinflussen, sind die Gefrierpunkterniedrigung und der Gehalt an nicht gefrorenem Wasser. Sie bestimmen den Wasser- und Stofftransport im gefrorenen Boden. Dieser wirkt auf Gefügestabilität, Frosthebungsvorgänge und Schwermetalltransport ein (Marion, 1995).

2.3.2 Einfluss auf die Bodenchemie

Die Gefrierpunktstemperatur der Bodenlösung wird vor allem durch die Bindung von Wasser auf Partikeloberflächen, die spezifischen Druckverhältnisse im Kapillarwasser und den Elektrolytgehalt der Bodenlösung herabgesetzt. Deshalb ist der Gefrierpunkt von Bodenlösungen in porösen Medien in der Regel niedriger als von reinem und ungebundenem Wasser (Bachmann (a), 2006).

In verdünnten Lösungen wird die Gefrierpunktserniedrigung durch die Van´t Hoff´sche Gleichung beschrieben:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Je kleiner der Anteil an nicht gefrorenen Bodenwassers wird, desto höher wird die Konzentration der in ihm gelösten Stoffe im Restwasser. Das führt zu einem sukzessiven Herabsetzen der Gefrierpunktstemperatur (Bachmann (a), 2006). (Abb. 2.2) An der Gefrierfront, derübergangszone von nicht gefrorenem Boden zu gefrorenem Boden kommt es ebenfalls zu einer Erhöhung der Konzentration an Ionen und damit zu einer Erniedrigung des Gefrierpunktes. Auf der einen Seite dadurch, dass das Wasser in den gefrorenen Bereich abwandert und auf der anderen Seite durch den Ausschluss der Ionen aus dem sich grade bildendem Eis (Edwards & Cresser, 1992).

Zu dem Ansatz, ob sich der pH-Wert durch diese Konzentrationserhöhung und die Temperatursenkung ändert, ist bisher wenig bekannt. Der pH-Wert ist an den Dissoziationsgrad des Wassers gebunden und somit Temperaturabhängig. Je höher die Temperatur, desto größer der Grad der Dissoziation, was bedeutet, dass der pH-Wert sinkt. Bekannt ist, dass Die Denitrifikation ein Optimum bei einem pH-Wert von 7-8 hat. Das N₂O/N2-Verhältnis wird stark von niedrigeren pH-Werten, wie sie in Waldböden zu finden sind, beeinflusst, weil der letzte Reduktionsschritt sensitiver gegenüber sauren Bedingungen ist, als die vorherigen Schritte (Granli & Bockmann, 1994).

Die Konzentration von N₂O in der Bodenluft variiert von 1-1000 ppmv. Bei einer Konzentration von 10ppmv (10-⁵ bar) im Oberboden und einer Temperatur von 25°C liegt die Löslichkeit von N₂O im Bodenwasser bei 0,7μg N₂O-N l-¹. Die Dissoziation von Gasen verläuft exotherm. Das heißt die Löslichkeit von Gasen nimmt mit sinkender Temperatur zu. So ist die Löslichkeit von N₂O bei 5°C dreimal höher als bei 40°C (Granli & Bockmann, 1994).

Wie im vorherigen Abschnitt (2.1.1) dargestellt, kann es durch Frostereignisse zu einer Strukturzerstörung der organischen Bodensubstanz kommen. Dadurch werden nicht nur Ionen freigesetzt sondern auch neue Ionenaustauschplätze geschaffen an denen sich z.B. die Substrate der Denitrifikation adsorptiv binden können (Edwards & Cresser, 1992).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.3 Schematische Darstellung von Salzkonzentration und Matrixpotential in einem gefrierenden Boden (nach Bachmann)

2.3.3 Einfluss auf die Bodenbiologie

Um bei niedrigen Temperaturen zuüberleben, können Mikroorganismen ihre Zellgröße und die äußere Polysaccharidschicht (Kapsel) verringern, und ihre Phospholipid- zusammensetzung in der Zellmembran verändern. Für ihre Stoffwechselaktivität benötigen sie jedoch weiterhin flüssiges Wasser. Durch welche Parameter der Gehalt an ungefrorenem Wasser im Boden beeinflusst wird, wurde in den vorhergehenden Abschnitten erklärt. Auch in gefrorenen Böden sind Bakterien von einem dünnen Wasserfilm umhüllt, der sich mit zunehmender Frosttiefe verringert. Bei -10°C beträgt er ca. 5nm (Stres, 2007) bis 0,5nm (Rivkina et al., 2000). Bei solch kleinen Reaktionsräumen, spricht man von Mikrosites. In diesen Mikrosites konzentrieren sich Nährstoffe und Stoffwechselprodukte auf. Durch die Eishülle um die Mikrosites ist der Gasaustausch limitiert, was schnell zu einem Absenken des Sauerstoffgehalts führen kann. All diese Faktoren begünstigen die Denitrifikation (Stres, 2007).

Die N O₃--Reduktase besitz eine höhere Affinität zu Elektronen aus der oxidativen Phosphorylierung als die N₂O-Reduktase. Die N O₃--Reduktion ist energetisch vorteilhafter als die N₂O-Reduktion. N O₃- wird deshalb bevorzugter reduziert als N₂O (Stres, 2007).

Weiterhin wird die N₂O-Reduktase bei niedrigen Temperaturen gehemmt (Öquist, 2004). Das führt in den Mikrosites zu einer Erhöhung des N₂O/N2 -Verhältnisses.

Bei Frost werden zum Teil Mikroorganismen- und Pflanzenzellen zerstört. Aus den zerstörten Zellen werden Kohlenstoff, Stickstoff und andere Nährstoffe freigesetzt, die dann denüberlebenden Mikroorganismen als Substrat dienen (Sehy, 2004).

Je nach Mikroorganismenart liegt das Optimum für denitrifikatorische Aktivitäten bei 20 bis 40°C, das Maximum bei 65 bis 75°C und das Minimum bei 0 bis -15°C (Aulakh, 1992) (Müller, 2000).

2.4 Denitrifikation

2.4.1 Biologische Denitrifikation

Als Denitrifikation bezeichnet man die Gruppe von Reaktionen, die Nitrat oder Nitrit zu den gasförmigen Stickstoffverbindungen NO, N₂O und N₂ reduziert (Firestone & Davidson, 1989). Meist geschieht dies durch fakultativ anaerobe, heterotrophe und einige autotrophe Mikroorganismen (Zumft, 1997). Der größte Anteil der denitrifizierenden Mikroorganismen sind Prokaryoten, die phylogenetisch zu den Probacteria (gram-negative Bakterien) gehören (Madigan et al., 2000).

Die grundsätzlichen Vorrausetzungen für das Stattfinden von denitrifikatorischen Prozessen sind: a) das Vorhandensein von Mikroorganismen, die die metabolischen Fähigkeiten besitzen, b) die Verfügbarkeit von passenden Reduktanten, z.B. organischen Kohlenstoff, c) eine verringerte Sauerstoffverfügbarkeit und d) das Vorhandensein von Stickstoffoxiden, N O₃, NO₂, NO oder N₂O (Firestone and Davidson, 1989). Die vollständige Denitrifikation beinhaltet vier Teilreaktionen, die durch die metallhaltigen Enzyme Nitratreduktase, Nitritreduktase, Stickstoffmonoxid-Reduktase und die Distickstoffmonoxid-Reduktase katalysiert werden (Bothe et al., 2007).

Im Einzelnen laufen die Reaktionen wie folgt ab:

1. 2 N O₃- + 4 H+ + 2 e➔ 2 NO₂- + 2 H2O (Nitratreduktase)

2. 2 NO₂ + 2 H+ + 2 e➔ NO + H2O (Nitritreduktase)

3. 2 NO + 2 H+ + 2 e➔ N₂O + H2O (Stickstoffmonooxidreduktase)

4. N₂O + 2 H+ + 2 e➔ N2 + H2O (Distickstoffoxidreduktase)

Die Denitrifikation ist der einzige Prozess im Stickstoffkreislauf, bei dem N₂O und NO sowohl produziert als auch konsumiert werden (Firestone & Davidson, 1989). Bei begrenztem Angebot an O₂ können die Mikroorganismen Stickstoffoxide als Elektronenakzeptor (Oxidationsmittel) für die oxidative Phosphorylierung (Energiestoffwechsel) nutzen, da die Redox-Potentiale aller Einzelschritte der Denitrifikation positiv sind. Die aus der Oxidation von organischen und anorganischen Stoffen stammenden Reduktionsäquivalente (e-) sind je nach Enzym und Mikroorganismen unterschiedlich. Weil der Elektronentransport mit der ATP-Synthese gekoppelt ist, findet hierbei eine Energiekonservierung statt (Abb.2.4).

Da Sauerstoff ein effizienterer Elektronenakzeptor ist, werden Stickstoffoxide nur als „Notlösung“ bei O₂-Mangel genutzt. Das ist z.B. der Fall, wenn sich die Poren im Boden mit Wasser füllen. Dann wird die O₂-Diffusion im Boden stark beeinträchtigt und ab einem WFPS von ca. 60% steigt die Denitrifikation deutlich an (Robertson & Groffman, 2007). Bei unvollständiger Denitrifikation wird Stickstoff meist in Form von N₂O freigesetzt. Ursächlich hierfür ist im Wesentlichen einüberangebot an Nitrat und geeigneter Reduktanten, welche den letzten Reaktionsschritt der Denitrifikation hemmen. Solche Bedingungen findet man z.B. in Böden, Sümpfen und Gewässersedimenten. Häufig limitiert in den anaeroben Zonen die N O₃- -Verfügbarkeit die Denitrifikation im Boden. Auf Stickstoff gedüngten Flächen wirkt allerdings meist die Verfügbarkeit an Kohlenstoff limitierend (Firestone und Davidson, 1989).

2.4.1.1 Bakterielle Enzyme der Denitrifikation

Einige Spezies besitzen mehr als 40 Gene, welche die Proteine der Enzyme einer vollständigen Denitrifikation kodieren. Die Anwesenheit von N O₃- und die Abwesenheit von O₂ induzieren die Expression der Gene für die Enzyme der Denitrifikation. Die Enzyme werden alle, jedoch unterschiedlich stark durch O₂ gehemmt (Madigan et al., 2000) (Spanning, 2007).

Die Nitrat- und Stickstoffoxid-Reduktase sind in der Cytoplasmamembran lokalisiert, während sich die Nitrit- und die Distickstoffoxid-Reduktase im periplasmatischen Raum befinden. (Abb. 6) Der periplasmatische Raum ist ein Zellkompartiment zwischen der Cytoplasmamembran und äußerer Membran gram-negativer Bakterien. Er ist von gelartiger Konsistenz und enthält eine hohe Konzentration an Enzymen sowie Binde- und Transportproteinen, die in verschiedene biochemische Prozesse eingebunden sind (Madigan et al., 2000). Bei gram-positiven Bakterien befinden sich alle Enzyme in der Membran, da diese keinen periplasmatischen Raum, sondern „nur“ einen periplasmatischen Spalt besitzen. Untersuchungen haben gezeigt, dass sich denitrifizierende gram-positive Bakterien im Enzymprofil und im Elektronentransportsystem von den gram-negativen unterscheiden (Suharti, 2005). Bisher wird angenommen, dass gram-positive Bakterien nur eine untergeordnete Rolle in der Denitrifikation spielen und es gibt nur wenige Untersuchungen hierzu, auf die auch nicht näher eingegangen werden soll.

Wie in Abb. 2.5. zu sehen ist, sind die Enzyme der Denitrifikation in der Zellmembran eines Bakteriums so angeordnet, dass Zwischenprodukte an jedem einzelnen Reaktionsschritt mit der Umgebung (Boden) ausgetauscht werden können (Robertson & Groffman, 2007).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.4 Grundprinzip der

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.5 Mögliches Schema für den chemiosmotischen Kopplung Elektronentransport bei der Denitrifikation in

Pseudomonas stutzeri (Madigan, 2001)

Nitratreduktase (NAR)

Die meisten Bakterien besitzen mehr als einen der drei Typen der NAR. Es existieren eine cytoplasmatische assimilatorische (Stoffaufbau) Reduktase und 2 dissimilatorische (zur Energiegewinnung) Reduktasen. Bei den dissimilatorischen Reduktasen unterscheidet man eine membrangebundene und eine periplasmatische NAR. Es existiert auch eine eukaryotische assimilatorische NAR, z.B. bei Pilzen und Pflanzen. Alle NAR sind molybdänhaltige Enzyme, die durch O₂ gehemmt werden und alle NAR katalysieren die gleiche Reaktion: die Reduktion von N O₃- zu NO₂-. (Zumft, 1997) (Einsle, 2004) (Abb: 2.6) Der Km-Wert für die Nitratreduktion liegt bei 15μM (Betlach, 1981).

Nitritreduktase (NIR)

NO₂-Reduktase (NIR) ist das Schlüsselenzym in der Denitrifikation. Es katalysiert den ersten Schritt, der zu einem gasförmigen Zwischenprodukt führt. Die Reaktion hat eine Änderung der freien Enthalpie von G = -76,2 kJ mol-¹ (Zumft, 1997).

Es existieren 2 Klassen von NIRs. Die eine hat Kupfer und die andere Eisen (Häm) als Cofaktor. (Abb: 2.6) Beide existieren niemals zusammen in der gleichen Bakterienspezies (Bothe, 2007).

Der Km-Wert für die Nitritreduktion liegt bei 15μM (Betlach, 1981).

NO-Reduktase (NOR)

Das Enzym ist in der Membran eingelagert und besitzt zwei nicht identische Untereinheiten. Hier ist Eisen in Häm und nicht-Häm Form das Zentralatom (Abb: 2.6) (Einsle, 2004). Die Reduktion von NO zu N₂O bewirkt eine Änderung der freien Enthalpie von G = -306,3 kJ mol-¹ (Zumft, 1997).

Weil NO ab einer gewissen Konzentration giftig für die Zelle ist, muss die Aktivität der NOR mit der der NIR synchronisiert werden, um die NO-Konzentration gering zu halten.

N₂O-Reduktase (N₂OR)

Die N₂OR ist im Periplasma gram-negativer Bakterien oder in der Membran gram-positiver Bakterien lokalisiert. Damit sind nur diese zur N₂O-Reduktion und somit zu einer vollständigen Denitrifikation befähigt (Einsle & Kroneck, 2004) (Bothe, 2007) (Suharti, 2005). Die Reaktion hat eine Änderung in der freien Enthalpie von

G = -339,5 kJ mol-¹ (Bothe, 2007).

Das Enzym besitzt zwei identische Untereinheiten. In Jeder Untereinheit befinden sich zwei multinukleare Cu-Zentren, das CuZ- und das CuA-Zentrum (Abb: 2.6).

Am CuA-Zentrum findet der e--Transport statt. Das CuZ- Zentrum ist das aktive Zentrum des Enzyms, an dem die Reduktion des N₂O katalysiert wird.

Die N₂OR wird durch NO₂- (Zumft, 1997) oder N O₃- (Blackmer, 1978) oder NO₂- und N O₃- (Dendooven, 1993) (Colbourne, 1984) nicht kompetetiv gehemmt und ist pH-Wert (Zumft, 1997) und Temperatur (Öquist, 2007) sensitiv. Wenn die Bakterien ihren Stoffwechsel auf N-Oxide umstellen, wird die N₂OR als letztes ausgebildet (Bakken, 2007).über das N₂O/N2

- Verhältnis kann man die Aktivität des Enzyms bestimmen.

Der Km-Wert für die N₂O-Reduktion liegt bei 0,5μM (Betlach, 1981).

Nitratreduktase periplasmatische Nitritreduktase Cu-haltige Nitritreduktase von Nitratreduktase Alcaligenes faecalis NapA von Desulfovibrio desulfuricans Stickstoffmonooxidreduktase Distickstoffoxidreduktase von Paracoccus schematische Darstellung der NO-Reduktase in denitrificans einem gram-negativen Bakterium elektronentransferierende CuA-Seite Tetranucleare aktive CuZ-Seite

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.6 Struktur der Enzyme der Denitrifikation. (nach Einsle, 2004)

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