Identifizierung von mit HMGA2 interagierenden Proteinen

Inhaltsverzeichnis

I Abkürzungsverzeichnis

1 Einleitung

2 Materialien
2.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien
2.2 Chemikalien
2.3 Lösungen und Puffer
2.4 Medien
2.5 Hefestämme
2.6 Bakterienstämme
2.7 DNA-Molekulargewichtsmarker
2.8 Primer
2.9 Vektoren
2.10 Kits
2.11 Enzyme
2.12 Software

3 Methoden
3.1 Kultivierung von Prokaryoten
3.1.1 Kultivierung von Prokaryoten aufAgarplatten
3.1.2 Flüssigkulturen von Prokaryoten
3.1.3 Anlegen von Glycerolstocks
3.2 Kultivierung von Eukaryoten
3.2.1 Kultivierung von Eukaryoten aufAgarplatten
3.2.2 Flüssigkulturen von Eukaryoten
3.3 Isolierung von Plasmid DNA aus Prokaryoten
3.3.1 Plasmid Midiprep mittels QIAGEN* Plasmid Midi Kit
3.3.2 Plasmid Maxiprep mittels QIAGEN* Plasmid Maxi Kit
3.3.3 Schnelle DNA-Isolierung
3.4 Isolierung von Plasmid DNA aus Eukaryoten
3.4.1 DNA-Isolierung aus S. cerevisiae mittels QIAprep* Spin Miniprep Kit
3.4.2 DNA-Isolierung aus S. cerevisiae mittels QIAGEN* Plasmid Mini Kit und Lyticase
3.5 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung
3.5.1 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung mittels Photometrie
3.5.2 Konzentrationsbestimmung mittels Agarose-Gelelektrophorese
3.6 Restriktionsverdau
3.6.1 Restriktionsverdau zum Qualitätstest von Plasmiden
3.6.2 Restriktionsverdau zur Klonierung von DNA-Fragmenten
3.7 Dephosphorylierung
3.8 Ligation
3.9 Agarose-Gelelektrophorese
3.10 Aufreinigung von DNA aus einem Agarosegel
3.10.1 Aufreinigung von DNA mittels QIAquick™ Gel Extraction Kit
3.10.2 Aufreinigung von DNA mittels QIAEX* II Gel Extraction Kit
3.11 PCR-Purification mittels QIAquick™ PCR Purification Kit
3.12 Transformation in Prokaryoten
3.12.1 Herstellung thermokompetenter Bakterien E. coli DH5a
3.12.2 Thermotransformation in Prokaryoten
3.12.3 Ermittlung der Transformationseffizienz
3.13 Transformation in Eukaryoten
3.13.1 Herstellung kompetenter Hefezellen S. cerevisiae AH109
3.13.2 PEG/LiAc-Transformation in Eukaryoten (Gietz etal., 1992)
3.13.3 Ermittlung der Transformationseffizienz
3.14 Polymerase Kettenreaktion
3.14.1 Ermittlung der optimalen Annealing-Temperatur mittels Gradienten-PCR
3.14.2 PCR zur Überprüfung der PEG/LiAc-Transformation in Eukaryoten
3.15 Sequenzierung

4 Ergebnisse
4.1 Isolierung von Plasmid DNA und Überprüfung der Vektoren
4.1.1 Photometrische Konzentrationsbestimmung isolierter Plasmid DNA
4.1.2 Restriktionsverdau zur Überprüfung der Vektoren pGBKT7 und pET-3a-HMGA2
4.2 Klonierung von HMGA2 in pGBKT7
4.2.1 Restriktionsverdau der Vektoren pET-3a-HMGA2 und pGBKT7
4.2.2 Ligation des Vektors pGBKT7 mit dem HMGA2-Insert
4.3 Transformation des Vektors pGBKT7-HMGA2 in E. coli
4.3.1 Zählung der gewachsenen Klone und Ermittlung der Transformationseffizienz
4.3.2 Restriktionsanalysen des Vektors pGBKT7-HMGA2 nach Schnellprep
4.3.3 Photometrische Konzentrationsbestimmung nach Midiprep
4.3.4 Restriktionsverdau nach Midiprep
4.4 Sequenzierung
4.5 Transformation des Vektors pGBKT7-HMGA2 in S. cerevisiae
4.5.1 Ermittlung der Transformationseffizienz
4.6 PCR-Analysen
4.6.1 Gradienten-PCR zur Ermittlung der optimalen Annealing-Temperatur verschiedener Primer
4.6.2 PCR zur Überprüfung derTransformation von pGBKT7-HMGA2 in S. cerevisiae

5 Diskussion

6 Zusammenfassung

II Literaturverzeichnis
Il.a Wissenschaftliche Artikel
ll.b Bücher
ll.c Internetquellen
ll.d Manuals und Handbooks

III Abbildungsverzeichnis

IV Tabellenverzeichnis

V Anhang
V.a DNA-Molekulargewichtsmarker
V.b Vektoren

VI Danksagung

I Abkürzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1 Einleitung

Das HMGA2-Protein gehört zur Familie der HMG-Proteine (High Mobility Group-Proteine), welche ihren Namen aufgrund der hohen Laufgeschwindigkeit in der Polyacrylamidgelelektrophorese erhalten hat (Tallini u. Dal Cin, 1999). HMG-Proteine wurden 1973 von Goodwin et al. erstmals entdeckt und beschrieben. Sie sind Chromatin-assoziierte Nicht-Histon-Proteine, die als architektonische Transkriptionsfaktoren an AT-reiche Regionen der DNA binden können (Bustin u. Reeves, 1996). HMG-Proteine können den Aufbau von Kernprotein-Strukturen, welche an der Transkription, der Replikation sowie der Chromatin-Konformation beteiligt sind, beeinflussen. Dies geschieht mit Hilfe eines komplexen Netzwerks von Protein-DNA- und Protein-Protein-Interaktionen (Ferguson et al., 2003). Aufgrund ihrer Funktion als Transkriptionsregulatoren spielen HMG-Proteine eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl von Erkrankungen, die auf Mutationen beruhen, welche die chromosomalen Regionen der entsprechenden Proteine betreffen. HMG-Proteine zeichnen sich durch einige gemeinsame chemische und physikalische Eigenschaften aus. Sie können vom Chromatin mit 0,35 M NaCl extrahiert werden, besitzen eine molekulare Masse kleiner als 30 kDa, sind löslich in 5% Perchlorsäure sowie Trichlorsäure und weisen einen hohen Anteil an geladenen Aminosäuren auf (Johns, 1982; Cleynen u. Van de Ven, 2007). Die Familie der HMG-Proteine besteht aus den drei Subfamilien A, B und N, die sich aufgrund charakteristischer, funktioneller Sequenzmotive voneinander unterscheiden (Catez et al., 2004; Flohr et al., 2003; Prymakowska-Bosak et al., 2001). Die Interaktion zwischen HMG-Proteinen und DNA bzw. Chromatin erfolgt mit Hilfe dieser Sequenzmotive. Bezeichnend für die jeweilige Bindungsdomäne ist der letzte Buchstabe der Subfamilien. Die Bindungsdomäne der HMGA-Proteine ist der so genannte AT-Hook, die HMG-Box ist die Bindungsdomäne der HMGB-Proteine und die nukleosomale Bindungsdomäne ist charakteristisch für HMGN-Proteine (Bustin, 1999).

Die HMGN-Subfamilie umfasst die Proteine HMGN1, HMGN2, HMGN3a, HMGN3b und HMGN4, wobei HMGN3a und HMGN3b alternative Splicevarianten sind. Diese Proteine werden ubiquitär exprimiert. Indem sie an die Innenseite nukleosomaler DNA binden, beeinflussen die HMGN-Proteine die Interaktion zwischen DNA und dem Histonoktamer (Bustin u. Reeves, 1996; Shick et al., 1985). HMGN-Proteine besitzen eine so genannte Chromatin-Aktivierungsdomäne, die ihnen die Fähigkeit verleiht, das Chromatin aufzulockern (Bustin, 2001; Ding et al., 1997). Diese Auflockerung des Chromatins ermöglicht es anderen Proteinen an die DNA zu gelangen und so DNA-relevante Prozesse wie Transkription, Replikation und DNA-Reparatur zu unterstützen (Birger et al., 2003; Ding et al., 1997; Trieschmann et al., 1995a, 1995b). Durch Interaktion mit den Histonen H1 und H3 können HMGN-Proteine die Chromatinstruktur verändern und dadurch die Transkription beeinflussen, ohne dabei selbst einen Bestandteil des Transkriptionskomplexes zu bilden (Alfonso et al., 1994; Bustin, 1999; Trieschmann et al., 1995a). Posttranslationale Modifikationen wie Acetylierung und Phosphorylierung können die Bindeeigenschaften von HMGN-Proteinen beeinflussen (Bergel et al., 2000; Lührs et al., 2002; Prymakowska-Bosak et al., 2001; Zhang u. Wang, 2008).

Zur HMGB-Subfamilie gehören die Proteine HMGB1, HMGB2 sowie HMGB3. Die HMGB- Proteine werden gemeinsam gekennzeichnet durch zwei, 80 bis 90 basische Aminosäuren umfassende, HMG-Box-Bindungsdomänen, die N-terminale A-Domäne und die zentral gelegene B-Domäne. Die drei α-Helices dieser HMG-Boxen sind in einer charakteristischen L-Form angeordnet (Bustin, 1999). Zudem besitzen HMGB-Proteine eine saure C-terminale Domäne, die aus 20 (HMGB2) bzw. 30 (HMGB1) aufeinander folgenden Aspartat- und Glutamatresten besteht. Die HMG-Boxen binden strukturspezifisch an die kleine Furche der DNA und können eine lokale Verbiegung der Doppelhelix erzeugen, durch die beispielsweise die Transkription beeinflusst werden kann (Dintilhac u. Bernués, 2002; Ge u. Roeder, 1994; Riedemann et al., 2003; Shykind et al., 1995). HMGB1 bindet präferentiell an bereits veränderte DNA-Konformationen, wie z.B. 4-way-junctions (Hill et al., 1999), supercoiled DNA (Stros u. Reich, 1998), kruziforme DNA (Bianchi et al., 1989) und Cisplatin geschädigte DNA (Locker et al., 1995; Meyer et al., 2004; Ohndorf et al., 1999). Außerdem interagieren HMGB-Proteine mit einzelsträngiger DNA. Sie bewirken eine Krümmung der DNA, welche eine Wiederherstellung doppelsträngiger DNA ermöglicht. Aufgrund dieser Beobachtungen wird für HMGB-Proteine eine Rolle bei Replikation, Rekombination, Transkriptionsaktivierung und -deaktivierung sowie DNA-Reparatur diskutiert (Bustin, 1999; Stros et al., 2002), welche zum Teil bereit]s bestätigt werden konnte (Ueda et al., 2004). Bindet HMGB1 z.B. an Cisplatin geschädigter DNA, blockiert es die DNA-Reparaturmechanismen (Nagatani et al., 2001). Aus diesem Grund wird Cisplatin als Chemotherapeutikum unter anderem bei einigen Brustkrebsarten eingesetzt, bei denen HMGB1 überexprimiert wird (He et al., 2000; McA'Nulty et al., 1996).

Zur Subfamilie der HMGA-Proteine zählt man die Proteine HMGAla, HMGAlb, HMGAlc und HMGA2, wobei es sich bei HMGAla, HMGAlb und HMGAlc um Splicevarianten des HMGAl-Gens handelt (Chau et al., l995). Das HMGAl-Gen ist auf dem kurzen Arm von Chromosom 6 (6p2l), HMGA2 in der chromosomalen Region l2ql4-l5 lokalisiert (Abb. l; Banks et al., l999; Reeves u. Beckerbauer, 200l).

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Abb. l: Darstellung der Lokalisation des HMGA2-Gens (rot) auf Chromosom l2 (www.genecards.org, 2008)

Die molekulare Masse von HMGA2 beträgt l2 kDa. Sowohl für HMGAl als auch für HMGA2 (HMGA2a und HMGA2b) wurden Splicevarianten entdeckt, Pseudogene hingegen sind nur von HMGAl bekannt (Chau et al., l995; Strichman-Almashanu et al., 2003). Das humane HMGAl-Gen umfasst einen Bereich von l0 kb und besteht aus acht Exons, von denen lediglich Exon fünf bis acht für das HMGAl-Protein kodieren. Dabei kodieren Exon fünf bis sieben jeweils für eine AT-Hook-Domäne, während Exon acht für eine saure C-terminale Domäne kodiert und eine l345 bp große 3' UTR enthält (Chau et al., l995; Fusco u. Fedele, 2007). Das HMGA2-Gen hingegen besteht aus fünf Exons, die alle für das HMGA2-Protein kodieren, und erstreckt sich über eine Länge von l42 kb. Die mRNA Sequenz von HMGA2 ist 4444 bp lang und kodiert für ein Protein mit 320 Aminosäuren (Hauke et al., 2002). Abbildung 2 zeigt den schematischen Aufbau von HMGA2. In der Abbildung sind die Exons blau dargestellt. Die ersten drei Exons kodieren für jeweils eine AT-Hook-Domäne (grün). Exon 4 kodiert für eine Spacer-Region und Exon 5 für eine saure C-terminale Domäne (rot). Eine l40 kb große Intron-Sequenz liegt zwischen dem dritten und vierten Exon. Das HMGA2-Gen enthält eine 2927 bp große 3' UTR (Friedmann et al., l993; Fusco u. Fedele, 2007).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 2: Darstellung des schematischen Aufbaus des HMGA2-Gens (Fusco u. Fedele, 2007)

HMGA-Proteine binden vorwiegend an die kleine Furche AT-reicher Sequenzen der DNA in B-Konformation (Disney et al., 1989; Reeves u. Nissen, 1990), können mit anderen Proteinen sowie DNA interagieren und sind an der Ausbildung von Enhanceosomenkomplexen beteiligt (Odero et al., 2005; Reeves, 2001; Thanos u. Maniatis, 1992). Die Interaktion zwischen HMGA-Proteinen und anderen Proteinen bzw. DNA wird durch posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierung, Methylierung, Acetylierung, Glycosylierung und poly(ADP)-Ribosylierung reguliert (Elton u. Reeves, 1986; Fedele et al., 2001; Reeves u. Beckerbauer, 2001; Sgarra et al., 2003; Zhang u. Wang, 2008). Zudem sind HMGA-Proteine auch in der Lage an 4-way-junction-DNA (Hill u. Reeves, 1997), nukleosomalen Kern-Partikeln (Reeves u. Nissen, 1993; Reeves u. Wolffe, 1996) und supercoiled Plasmiden (Nissen u. Reeves, 1995) zu binden. Weiterhin können sie, abhängig von der Sequenz, der Topologie, der Organisation oder der Länge des DNA-Substrats, lineare DNA strecken, entwickeln, biegen oder supercoils in die DNA einfügen (Bagga et al., 2000; Bustin u. Reeves, 1996; Chase et al., 1999). Diese Konformationsänderungen können die Bildung von Transkriptionskomplexen oder Enhanceosomenkomplexen beeinflussen, wodurch es zu einer Aktivierung oder Inhibierung der Genexpression kommen kann (John et al., 1995; Thanos u. Maniatis, 1995).

HMGA-Proteine sind vor allem bei zellulären Differenzierungsprozessen aktiv. Aus diesem Grund werden HMGA-Gene während der Embryonalentwicklung und in undifferenzierten Zellen besonders stark exprimiert. In adulten, differenzierten Zellen liegen hingegen, mit wenigen Ausnahmen, eine sehr geringe oder keine Expression vor (Chiappetta et al., 1996; Liu et al., 2000; Rogalla et al., 1996). Eine erhöhte Expression von HMGA-Proteinen steht meistens mit einer Veränderung des zellulären Wachstums und Differenzierung in Verbindung. So führt beispielsweise das Fehlen von HMGA2 zu Zwergenwuchs und ist als Pygmäenphänotyp bekannt (Zhou et al., 1995). Wird hingegen HMGA2 überexprimiert, führt dies zu einer vermehrten Bildung von Fettzellen, was einen Hinweis auf die wichtige Rolle von HMGA2 in der Adipogenese gibt (Anand u. Chada, 2000). Zudem wird eine reaktivierte Expression von HMGA-Proteinen in differenziertem Gewebe mit der Proliferation glatter Muskelzellen in den Blutgefäßen nach Gefäßverletzungen (Foster et al., 2000), der Immunantwort bei entzündlichen Reaktionen (Pellacani et al., 1999) und apoptotischen Prozessen (Diana et al., 2001) assoziiert.

Eine Überexpression von HMGA-Proteinen wird außerdem im Zusammenhang mit vielen malignen Tumoren genannt. Dazu zählen z.B. Brust-, Colon-, Magen-, Prostata-, Haut- und Lungentumoren (Fusco u. Fedele, 2007; Reeves u. Beckerbauer, 2001). Dabei korreliert die HMGAl-Überexpression mit der Malignität und der Metastasierung (Tallini u. Dal Cin, 1999). Daher werden die HMGA1-Proteine als mögliche diagnostische Marker diskutiert (Miyazawa et al., 2004; Rogalla et al., 1998; Schwanbeck, 2000). Die in Brust- (Rogalla et al., 1997) und Lungenkarzinomen (Rogalla et al., 1998) beobachtete Expression von HMGA2 hingegen korreliert mit dem Tumorgrading. Belge et al. identifizierten 2008 HMGA2 als einen weiteren möglichen molekularen Marker, mit dessen Hilfe zwischen benignen und malignen follikulären Neoplasien unterschieden werden kann. HMGA2 ist nicht nur in malignen Tumoren, sondern auch in vielen benignen mesenchymalen Tumoren, wie z.B. Lipomen, Uterusleiomyomen, chondroiden Hamartomen der Lunge und Endometriumpolypen überexprimiert (Arlotta et al., 2000; Battista et al., 1999; Kazmierczak et al., 1998a; Tallini, 2000; Van Dorpe, 2002; Wisniewski u. Schwanbeck, 2000). Benigne mesenchymale Tumoren bilden die größte Gruppe gutartiger Neoplasien beim Menschen. In benignen Tumoren finden sich außer einer erhöhten Expression auch Genfusionen und Translokationen der chromosomalen Banden von HMGAl und HMGA2. Die meisten dieser Tumoren weisen eine Vielzahl mikroskopisch sichtbarer Veränderungen auf, wobei die häufigste Veränderung die strukturelle Aberration der chromosomalen Region 12q14-15 ist. Neben den bereits genannten Tumoren weisen auch pleomorphe Adenome der Kopfspeicheldrüsen (Bullerdiek et al., 1987), Hämangiopericytome (Mandahl et al., 1993), chondromatöse Tumoren (Bridge et al., 1992), aggressive Angiomyxome (Kazmierczak et al., 1995a), diffuse Astrocytome (Jenkins et al., 1989), Osteoclastome (Noguera et al., 1989) und benigne Tumoren der Brust (Staats et al., 1996) eine Veränderung der Region 12q14-15 auf.

Die Proteomik ist eine junge Forschungsrichtung mit einer sehr viel älteren Wurzel, der Proteinanalytik (www.dgpf.org, 2008). In der Proteinanalytik werden molekulare Eigenschaften wie Aminosäuresequenz, 3-D-Struktur und biologische Aktivität verschiedener Proteine untersucht, während die Proteomik sich mit der Erforschung des Proteoms befasst. Das Proteom ist definiert als die Gesamtheit aller Proteine in einer biologischen Probe im Moment der Untersuchung und bei den dafür gültigen Bedingungen (Tyers u. Mann, 2003). Analysiert werden zumeist die Proteome homogener Zellpopulationen und biologischer Gewebe, um Antworten auf Fragen zur Regulation der natürlichen Lebensvorgänge und insbesondere zur Entstehung, Therapie und Verhinderung von Krankheiten zu bekommen (www.dgpf.org, 2008). Für das Verständnis der molekularen Grundlagen der natürlichen und krankhaften Lebensvorgänge reichen die bisherigen Ergebnisse der Genomik nicht aus. Um physiologische und pathologische biologische Prozesse verstehen zu können, müssen daher Proteine bzw. Proteome näher untersucht werden. Proteome sind im Gegensatz zu statischen Genomen in hohem Ausmaß dynamisch und können sich daher in ihrer qualitativen und quantitativen Proteinzusammensetzung aufgrund aktueller Bedingungen wie z.B. Umweltfaktoren, Temperatur, Genexpression oder Wirkstoffgabe oder zu unterschiedlichen Zeitpunkten verändern (Krycer et al., 2008; Peng u. Gygi, 2001). Diese Veränderungen betreffen die Anzahl der Proteine innerhalb des Proteoms von Zellen eines Organismus, posttranslationale Modifikationen, topologische Verteilungsmuster in unterschiedlichen Zellkompartimenten und Interaktionsmuster von Proteinen. Ein wesentliches Teilgebiet der Proteomik ist die Aufklärung von Protein-Protein-Interaktionen, die hauptsächlich von den Tertiärstrukturen der Proteine und den Wechselwirkungen ihrer Domänen abhängen. Außerdem ist die quantitative Analyse der Proteinexpression ein Teilbereich der Proteomik, welche somit Aufschluss über die Komponenten von Stoffwechselwegen und molekularen Regelkreisen gibt, die dreidimensionale Struktur von Proteinen weiteraufklärt und Einzelproteine in Proteingemischen identifizieren kann (Graves u. Haystead, 2002). So können beispielsweise aus dem Gemisch von mehr als 10000 Proteinen eines typischen Zellproteoms einzelne Proteine detektiert werden, die mit Erkrankungen in Verbindung gebracht werden. Durch Folgeuntersuchungen kann ermittelt werden, ob aus der beobachteten Korrelation ein Kausalzusammenhang offen gelegt werden kann (www.dgpf.org, 2008). Zu den Hauptanwendungen der Proteomik gehören neben der Suche nach Proteinen, deren Auftreten oder Fehlen mit Krankheiten (z.B. Tumoren, neurodegenerative Krankheiten) korreliert ist und der Aufklärung von biologischen Wirkmechanismen (z.B. die Identifizierung von Proteinen in Reaktionsketten, deren Resultate relevant für die Erforschung grundlegender Prozesse oder von Krankheitsentstehung sind) auch die Erfassung von Medikamentennebenwirkungen. Die Proteomik verwendet für diese Untersuchungen verschiedene Methoden, wie beispielsweise die 2D-Gelelektrophorese, massenspektrometrische Verfahren, chromatographische Trenntechniken, Immunopräzipitation, Protein-Microarrays und Yeast-2-Hybrid-Systeme (Aebersold u. Mann, 2003; Phizicky et al., 2003; Sgarra et al., 2008; Sydor u. Nock, 2003).

Protein-Protein Interaktionen zu analysieren ist von fundamentaler Bedeutung in der Biologie, da u.a. Vorgänge wie Zellwachstum, Apoptose und Zellzyklus von der Weitergabe von Signalen durch Proteinkomplexe reguliert werden (Graves u. Haystead, 2002). Die Funktionen vieler Proteine sind unbekannt, so dass die Detektion von Interaktionspartnern einen Hinweis auf die Funktionen geben könnte, da Proteine als Teil eines Komplexes vermutlich an denselben zellulären Prozessen beteiligt sind (Ekman et al., 2006; Phizicky et al., 2003). HMGA-Proteine sind in eine Reihe von biologischen Prozessen involviert. Dazu gehören, wie schon beschrieben, die embryonale Entwicklung, neoplastische Veränderungen und Konformationsänderungen der DNA (Fusco u. Fedele, 2007; Sgarra et al., 2004). Vor einiger Zeit wurde entdeckt, dass HMGA-Proteine die Funktion bzw. Funktionen anderer Proteine auch durch direkte Protein-Protein Interaktionen beeinflussen können. Erste Ergebnisse lieferten Hinweise auf Interaktionen zwischen HMGA-Proteinen und den drei bekannten Transkriptionsfaktoren NF-Y, SRF und PU.1 (Chin et al., 1998; Currie, 1997; Lewis et al., 2001). Weitere Untersuchungen zeigten, dass HMGA-Proteine in einem komplizierten molekularen Protein-Netzwerk eingebunden sind (Pierantoni et al., 2007; Sgarra et al., 2005). Sie modulieren durch direkte Interaktionen die Aktivität von Schlüsselelementen, welche die Zellproliferation und die Tumorentwicklung regulieren, wie z.B. p53 (Pierantoni et al., 2006), pRb (Fedele et al., 2006) und p120E4F (Cleynen u. Van de Ven, 2007; Tessari et al., 2003). Diese Untersuchungen zeigten außerdem, dass HMGA-Proteine eine PPI-Domäne bestehend aus ca. 20 AS-Resten besitzen. Sgarra et al. fanden 2008 weitere direkte Interaktionspartner von HMGA-Proteinen, die eine Beteiligung dieser am RNA-Processing und der DNA Reparatur belegen.

Ziel dieser Diplomarbeit war es, mit HMGA2 interagierende Proteine zu detektieren. Zu diesem Zweck sollten Yeast-2-Hybrid-Versuche durchgeführt werden. Yeast-2-Hybrid-Screens, erstmals 1989 von Fields und Song beschrieben, sind eine äußerst sensitive Methode, um Interaktionen zwischen Proteinen in vivo zu untersuchen. Das Prinzip dieser Methode basiert auf der Fusion eines Proteins X, dem so genannten „baiť'-Protein¹, mit der Gal4-DNA-Bindungsdomäne (Abb. 3, orange) und der Fusion eines Proteins Y, dem so genannten „prey"-Protein², mit der Gal4-Aktivatordomäne (Abb. 3, violett; Phizicky et al., 2003). Beiden Domänen ist es alleine nicht möglich, die Expression von Reportergenen auszulösen. Interagieren jedoch die beiden Fusionspartner X und Y, kommen die DNA-Bindungsdomäne und die Aktivatordomäne in räumliche Nähe, so dass die Transkription der Reportergene aktiviert werden kann (Abb. 3, Pfeil; Phizicky u. Fields, 1995). Der in dieser Arbeit verwendete Assay (Matchmaker™ Pretransformed Normalized Human Universal cDNA Library, Clontech Lab. Inc.) besitzt eine hohe Sensitivität durch die Verwendung von vier verschiedenen Reportergenen (ADE2, lacZ, HIS3, MELI) (Matchmaker™ User Manual, 2007).

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Abb. 3: Schematische Darstellung des Prinzips von Yeast-2-Hybrid-Versuchen (Phizicky et al., 2003)

Ein weiterer Vorteil dieser Methode gegenüber anderen Interaktionstests in vitro ist das zelleigene Millieu, in dem die Interaktionen untersucht werden. Demzufolge ist keine biochemische Aufreinigung nötig (Phizicky u. Fields, 1995). Als Host wird die Bäckerhefe S. cerevisiae verwendet. Diese ist inzwischen ein beliebter Modellorganismus, ebenso leicht zu kultivieren wie Bakterien und zudem gut für Transformationsversuche einzusetzen. Außerdem kann Hefe bei -80°C konserviert werden (Judd, 2001). Zellkulturen stellen ein künstliches System dar, wobei Versuche mit Hefezellen, wie bereits erwähnt, vorwiegend unter physiologischen, also natürlichen Bedingungen ablaufen. Mittels Yeast-2-Hybrid-Versuchen können die Interaktionen bekannter Proteine untersucht, vermutete Interaktionen bestätigt und Proteine - wie in diesem Fall HMGA2 - gegen eine cDNA-Library getestet werden (Van Criekinge u. Beyaert, 1999). Als Vektor für die Gal4-DNA-BD/bait Konstruktion dient pGBKT7 (Anhang, Abb. 25). Der AD Vektor pGADT7 (Anhang, Abb. 24) enthält die Gal4-AD und daran gekoppelt die cDNA Inserts (preys) aus der Library. Durch ständige Verbesserungen und Ausweitungen der Methode können heute nicht nur Protein-Protein-Interaktionen, sondern auch Protein-RNA- undxsW Protein-DNA-Interaktionen, wie auch Komplexbildungen zwischen drei Proteinen nachgewiesen werden (Brent u. Finley, 1997; Van Criekinge u. Beyaert, 1999). Ergänzend zum Prinzip der Gal4-Fusionsdomänen werden auch andere Systeme eingesetzt, wie z.B. das LexA-B42-System (Gietzefa/., 1997).

2 Materialien

2.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien

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2.3 Lösungen und Puffer

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2.4 Medien

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2.5 Hefestämme

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2.6 Bakterienstämme

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2.8 Primer

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2.9 Vektoren

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2.10 Kits

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

[...]

¹ bait: engl. der Köder

² prey: engl, die Beute, das Opfer