Auswirkungen von chemotherapeutischem Stress auf die Struktur und die Funktion des Nukleolus

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung
1.1 Anfänge der Nukleolusforschung
1.2 Nukleoläre Struktur und Proteom
1.3 Nukleoläre Funktionen: Hauptfunktion Ribosomenbiogenese
1.4 Weitere nukleoläre Funktionen: Biogenese nicht-ribosomaler Ribonukleoproteine
1.5 Ribosomenbiogenese im Kontext von Zellzyklus und Proliferation
1.6 Der Nukleolus als Stresssensor

2. Aufgabenstellung

3. Material
3.1 Zytostatika
3.2 Chemikalien
3.3 Puffer und Lösungen
3.4 Kulturmedien
3.5 Antikörper
3.6 Zelllinien
3.7 Verbrauchsmaterialien
3.8 Geräte
3.9 Software

4. Methoden
4.1 Zellkultur
4.1.1 Auftauen von Zellen
4.1.2 Kultivieren von Zellen
4.1.3 Plattieren von Zellen
4.1.4 Einfrieren von Zellen
4.2 Metabolisches Markierungsexperiment
4.2.1 In vivo Markierung
4.2.2 Isolierung der Gesamtzell-RNA
4.2.3 Agarosegelelektrophorese
4.2.4 Trocknen
4.2.5 Autoradiographie und Quantifizierung
4.3 Immunfluoreszenzmikroskopie
4.4 Western-Analyse

5. Ergebnisse
5.1 Einfluss der Zytostatika auf die rRNA-Synthese
5.1.1 Einfluss der Alkylantien auf die rRNA-Synthese
5.1.2 Busulfan
5.1.3 Nimustin
5.1.4 Cisplatin
5.1.5 Einfluss der Interkalantien auf die rRNA-Synthese
5.1.6 Mitoxantron
5.1.7 Mitomycin C
5.1.8 Einfluss der Antimetaboliten auf die rRNA-Synthese
5.1.9 Methotrexat
5.1.10 Hydroxyharnstoff
5.1.11 Einfluss der Mitose- und Topoisomerasehemmer auf die rRNA-Synthese
5.1.12 Campthotecin
5.1.13 Paclitaxel
5.1.14 Einfluss der Kinaseinhibitoren auf die rRNA-Synthese
5.1.15 Flavopiridol
5.1.16 Roscovitin
5.1.17 Einfluss der Proteasominhibitoren auf die rRNA-Synthese
5.1.18 Bortezomib
5.1.19 Einfluss der Histondeacetylaseinhibitoren auf die rRNA-Synthese
5.1.20 Einfluss der Translationsinhibitoren auf die rRNA-Synthese
5.1.21 Homoharringtonin
5.1.22 Zusammenfassung der Zytostatikatitrationen
5.2 Einfluss der Zytostatika auf die nukleoläre Struktur
5.2.1 Nukleoläre Lokalisation nach zytostatischem Stress mit Transkriptionsinhibitoren
5.2.2 Lokalisation von NPM, Pes und Fib nach Stress mit Mitoxantron
5.2.3 Lokalisation von NPM, Pes und Fib nach Stress mit Methotrexat
5.2.4 Lokalisation von NPM, Pes und Fib nach Stress mit Cisplatin
5.2.5 Nukleoläre Lokalisation nach zytostatischem Stress mit Prozessierungsinhibitoren
5.2.6 Lokalisation von NPM, Pes und Fib nach Stress mit Campthotecin
5.2.7 Lokalisation von NPM, Pes und Fib nach Behandlung mit Flavopiridol
5.2.8 Lokalisation von NPM, Pes und Fib nach Stress mit Homoharringtonin
5.2.9 NPM-Lokalisation nach Stress mit schwach/langsam oder nicht wirksamen Substanzen
5.3 Einfluss der Zytostatika auf die p53-Menge
5.3.1 p53-induzierende Zytostatika
5.3.2 Mitoxantron
5.3.3 Methotrexat
5.3.4 Cisplatin
5.3.5 Campthotecin
5.3.6 Flavopiridol
5.3.7 p53-hemmende Zytostatika 72
5.3.8 Homoharringtonin
5.3.9 Rapamycin
5.3.10 Paclitaxel
5.3.11 Zusammenfassung der IF- und WB-Analysen
5.4 Kombinationsexperimente
5.4.1 Epistasieexperiment in der p53-Antwort
5.4.2 Additive und synergistische Wirkungen der Zytostatika

6. Diskussion
6.1 Einfluss der Zytostatika auf die Ribosomenbiogenese
6.2 Nukleolärer Stress - strukturelle Folgen der Zytostatikabehandlungen
6.3 Nukleolärer Stress - funktionale Folgen der Zytostatikabehandlungen
6.4 Nukleolus und Ribosomenbiogenese als Ziel in der Chemotherapie

7. Zusammenfassung

8. Literaturverzeichnis

Anhang

Danksagung

1. Einleitung

1.1 Anfänge der Nukleolusforschung

Im Jahr 1781 konnte Felice Fontana anhand lichtmikroskopischer Analysen eine eiförmige Struktur im Zellkern beschreiben und hat damit den Nukleolus entdeckt. Mehr als 150 Jahre danach begann man zu Verstehen, welche Bedeutung der Nukleolus hat. Barbara McClintock hatte den Nukleolus 1934 mit Genaktivität in Verbindung gebracht (McClintock 1934). Nachdem man RNA im Nukleolus nachweisen konnte, wurden ribosomale Gene und Nucleolar Organising Regions als deren Loci definiert (Perry 1962, Ritossa und Spiegelmann 1965). Zur selben Zeit haben biochemische Charakterisierungen isolierter Nukleoli dazu geführt, dass man den Nukleolus als Ort der Ribosomenbiogenese definiert hat (Miller und Beatty 1969).

Heute weiß man, dass sich die Nukleoli als Subkompartimente im Nukleus an tandem-repetitiven Clustern aktiver ribosomaler Gene (rDNA) bilden. Die Cluster werden als Nucleolar Organising Regions bezeichnet und befinden sich beim Menschen an den Enden aller akozentrischen Chromosomen. In den Nucleolar Organising Regions kommt es zu einer lokalen Konzentration von Faktoren der Transkriptions- und Prozessierungsmaschinerie, was die lichtmikroskopische Darstellung des Nukleolus erlaubt.

1.2 Nukleoläre Struktur und Proteom

Der technische Fortschritt ermöglicht es, die eiförmige Struktur Fontanas heute sehr viel detaillierter zu analysieren. Nukleoli besitzen zwar keine eigene Membran, sie sind aber häufig in der Nähe oder in direktem Kontakt mit der Lamina (Bourgeois und Hubert 1988). Auch innerhalb des Nukleus sind Nukleoli nicht willkürlich verteilt. Die Position des Nukleolus hat zum Beispiel Einfluss auf die räumliche Organisation des Chromatins (Chubb et al. 2002). Größe und Anzahl der Nukleoli sind variabel. Je nach Zelltyp und Zellzyklusphase besitzt eine Säugerzelle zwischen einem und sechs Nukleoli mit schwankenden Größen zwischen 0.5µm bei ruhenden und bis zu 9µm bei proliferierenden Zellen. Trotz unterschiedlicher Größe und Form sind alle Nukleoli einheitlich strukturiert. Im Elektronenmikroskop (EM) (Abb. 1.1) lassen sich die folgenden drei kanonischen nukleolären Komponenten darstellen. Die hellere, zentral lokalisierte Struktur wird als Fibrillar Center (FC) bezeichnet. Sie ist umgeben von einer kontrastreichen, dunklen Struktur, der Dense Fibrillar Component (DFC). Beide Bestandteile sind in die Granular Component (GC) integriert, die den größten Teil des Nukleolus bildet. Obwohl alle Nukleoli strukturell gleich aufgebaut sind, herrscht dennoch ein hohes Maß an Dynamik. So können zum Beispiel einzelne Nukleoli in der Interphase fusionieren.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Generell kontrollieren zellzyklusspe-zifische Mechanismen die Ausprägung charakteristischer Nukleolusstrukturen. In der Mitose ist die Transkription der ribosomalen Gene unterdrückt (Heix et al. 1998), das Anlagern nukleolärer Faktoren wird somit verhindert und der Nukleolus aufgelöst. Die Komponenten der Transkriptionsmaschinerie bleiben dabei mit den rDNA-Genen assoziiert (Roussel et al. 1996), während die Proteine der Prozessierungsmaschinerie den Nukleolus verlassen und hauptsächlich in der Peripherie der Chromosomen akkumulieren (Gautier et al. 1992). Am Übergang von Mitose in die G1-Phase sammeln sich mehrere funktional verschiedene Prozessierungsfaktoren in ein und denselben kleinen, punktförmigen Foci, den so genannten Prenucleolar Bodies (PNBs) (Dundr et al. 2000, Hernandez-Verdun 2006). Mit zunehmender Progression im Zellzyklus wird die nukleoläre Transkription der rDNA-Cluster wieder etabliert und der charakteristische Interphasennukleolus bildet sich erneut aus. Die konzentrierten Proteine der PNBs werden dabei kontrolliert und zeitlich koordiniert in die Komponenten des Nukleolus abgegeben. Bei der Regulation von Aufnahme und Abgabe nukleolärer Proteine in die bzw. aus den PNBs scheinen stabile rRNA-Vorläufer (pre-rRNAs) eine zentrale Rolle zu spielen (Hernandez-Verdun 2006).

Der Nukleolus lässt sich nicht nur morphologisch strukturieren. Man hat begonnen sich stärker für die nukleoläre Proteinzusammensetzung zu interessieren. Seit 2005 ist es möglich das nukleoläre Proteom hoch auflösend darzustellen (Andersen et al. 2005). In dieser quantitativen Analyse humaner Nukleoli wurden 715 Proteine identifiziert. Davon können 692 reproduzierbar mit Nukleoli aufgereinigt werden. Die meisten Kandidaten des humanen nukleolären Proteoms konnten funktional charakterisiert werden (für Details siehe Abbildung 1.2) und sind mit früheren Studien aus der Hefe (Huh et al. 2003) abgeglichen und verifiziert.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Text Box: Abb. 1.2 Das nukleoläre Proteom (nach Andersen et al. 2005) Dargestellt ist eine Klassifizierung des nukleolären Proteoms in funktionale Kategorien. Die Zahlen geben an, wie viele Proteine pro Kategorie identifiziert wurden. Die insgesamt 715 Proteine lassen sich in fünf Gruppen gliedern.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Zur Analyse des nukleolären Proteoms wurden HeLa-Nukleoli isoliert, die Proteinextrakte chromatographisch aufgetrennt, verdaut, massenspekrometrisch analysiert und bioinformatisch annotiert.

Der größte Teil des nukleolären Proteoms besteht zwar aus Faktoren für die Ribosomenbiogenese. Interessant ist aber, dass sich auch Proteine zur Regulation von Zellzyklus, Replikation, DNA-Reparatur und andere zum Teil uncharakterisierte Proteine finden lassen. Heute weiß man, dass ungefähr 90% aller nukleolären Hefeproteine mit humanen Homologen auch in HeLa-Zellen nukleolär lokalisieren. Der eukaryontische Nukleolus ist strukturell wie funktional hoch konserviert. Im Folgenden soll auf einige Funktionen des nukleolären Proteoms eingegangen werden.

1.3 Nukleoläre Funktionen: Hauptfunktion Ribosomenbiogenese

Der Nukleolus stellt einen Ort aktiver Gene dar. Die Synthese und Prozessierung von rRNA ist Voraussetzung für die Biogenese von Ribosomen und Existenz des Nukleolus. Er ist also „formed by the act of building a ribosome“ (Mélèse und Xue 1995). Aus Erkenntinssen genetischer und biochemischer Analysen ist man in der Lage, den nukleolären Komponenten FC, DFC und GC definierte nukleoläre Faktoren zuzuweisen. Das ermöglicht eine grobe, räumliche Trennung der einzelnen Biogeneseschritte. Innerhalb des Nukleolus lässt sich die Ribosomenbiogenese in die vier funktionalen Prozesse rDNA-Transkription, rRNA-Modifikation, rRNA-Prozessierung und Zusammenbau des pre-90S Ribosoms untergliedern. Diese vier Prozesse laufen nicht unabhängig voneinander ab und können in vivo nicht scharf abgegrenzt werden. Das abgelesene rRNA-Transkript wird zum Beispiel co-transkriptional modifiziert und bereits während der Transkription von ribosomalen Prozessierungsfaktoren und ribosomalen Proteinen gebunden. Alle Schritte der Ribosomenbiogenese sind deshalb bereits sehr früh in einem dabei entstehenden nukleolären Multienzymkomplex, dem pre-90S Ribosom organisiert. Man sollte die Vorgänge in der Ribosomenbiogenese auch nicht als linearen Pathway betrachten. Viele der beteiligten Prozessierungsfaktoren sind hoch dynamisch und in der Lage, auf mehreren Stufen an das entstehende Ribosom zu binden und so mitunter multiple Prozessierungsschritte auszuüben. Die wichtigsten Biogeneseschritte, vom Primärtranskript bis hin zum fertigen 80S Ribosom, sind in Abbildung 1.3 dargestellt. Anders als in vivo sind die ablaufenden Prozesse schematisch und räumlich getrennt skizziert. Insbesondere die Prozessierungsschritte der rRNA vom Primärtranskript bis hin zu den reifen Formen sind vereinfacht dargestellt. Auch die co-transkriptionale Prozessierung der rRNA der kleinen ribosomalen Untereinheit (40S Ribosom) durch das Small Subunit (SSU)- homolge Processom und der Abbau fehlerhafter, polyadenylierter rRNAs durch das Exosom sind nicht wiedergegeben.

Im Folgenden werden die angesprochenen vier ribosomalen Syntheseprozesse der Einfachheit halber unabhängig voneinander beschrieben. Die Ribosomenbiogenese beginnt mit der Transkription von head-to-tail tandem-repetitiver rDNA durch die DNA-abhängige RNA-Polymerase I (Pol-I). Mit Ausnahme

der Pol-III kodierten 5S-rRNA werden alle rRNAs als polycistronisches Primärtranskript (pre-47/45S-rRNA) von der Pol-I synthetisiert (Fatica und Tollervey 2002). Die RNA-Polymerase I wird dabei durch Mechanismen ähnlich zur RNA-

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Polymerase II reguliert. Die Bindung des Promotorbereichs durch Pol-I wird indirekt über basale Transkriptionsfaktoren (TFs) vermittelt. Polymerase und basale TFs bilden zusammen mit dem Transaktivator UBF (Upstream Binding Factor) den Initiationskomplex (Ruggero und Pandolfi 2003). Vor kurzem konnte in Hefe außerdem gezeigt werden, dass aktive rDNA-Gene nukleosomale Struktur aufweisen und die Zugängigkeit des Chromatins epigenetisch durch Remodellingfaktoren reguliert wird (Jones et al. 2007). Die Transkription der rDNA findet im FC und vor allem am Übergang zum DFC statt (Hozak et al. 1994). Während der Transkription der pre-47S/45S-rRNA werden die synthetisierten Basen modifiziert (Decatur und Fournier 2003). Am häufigsten lassen sich Pseudouridinylierungen und 2’-O-methylierte Nukleoside finden. Die Modifikationen werden ortsspezifisch von kleinen nukleolären Ribonukleoproteinen (snoRNPs) eingeführt. Die snoRNPs bestehen aus kleinen nukleolären RNAs (snoRNAs), die das Primärtranskript und die intermediären Formen über komplementäre Basenpaarung binden und einem Protein das die Enzymaktivität vermittelt. Die Modifikation der Transkripte findet co-transkriptional am Übergang von FC zu DFC und im DFC statt. Der dritte Schritt ist die Prozessierung des Primärtranskripts über mehrere (unter anderem 36S- und 32S-rRNA) in die reifen rRNA-Formen 18S-, 28S- und 5.8S-rRNA. Die Prozessierung erfordert eine Schar von Prozessierungsfaktoren, die eine definierte Kaskade endo- und exonukleolytischer Schnitte durchführen. Auch sie erkennen die rRNA über snoRNA-vermittelte Komplementarität. Je nach Lokalisation lassen sich die Faktoren frühen und mittleren/späten Prozessierungsschritten zuordnen (siehe unten). Die bisher besprochenen Biogeneseschritte benötigen alle einen strukturellen Rahmen, das pre-90S Ribosom. Dazu assoziieren 80 ribosomale L- und S-Proteine (Fatica und Tollervey 2002) mit der transkribierten 47S/45S-rRNA sowie der von der RNA-Polymerase III synthetisierten 5S-rRNA. Die mRNAs für die ribosomalen Proteine sind Produkte der Pol-II. Alle drei RNA-Polymerasen sind also an der Ribosomenbiogenese beteiligt. Das pre-90S Ribosom ist keine starre Struktur. Während des gesamten Reifungsprozesses findet ein ständiges Assoziieren und Dissoziieren von ribosomalen Faktoren statt. Das hier gezeigte Anlagern ribosomaler L- und S-Proteine im GC ist ein einzelner, willkürlich herausgegriffener Schritt in der pre-90S Formation. Am Ende der nukleolären Biogeneseprozesse verlässt das pre-90S Ribosom den Nukleolus. Im Nukleoplasma finden sich weitere ribosomale Prozessierungsfaktoren (Helikasen, GTPasen, ATPasen, Exportfaktoren, etc.). Diese führen zu strukturellen Veränderungen der pre-90S Struktur (Gadal et al. 2001) und einer Spaltung von pre-90S in pre-40S und pre-60S Ribosomen. Nach weiteren Reifungsschritten werden diese CRM1-abhängig (Thomas und Kutay 2003) ins Cytoplasma exportiert und liegen dort als 40S bzw. 60S ribosomale Untereinheiten vor, um gemeinsam als 80S Ribosom Proteine zu synthetisieren. Die Vorgänge von pre-90S Ribosom bis hin zu den reifen Untereinheiten wurden 2003 ausführlich durch Tschochner und Hurt beschrieben.

Definierte Reifungsschritte korrelieren mit ribosomalen Synthesefaktoren und lassen sich definierten nukleolären Regionen zuordnen. So sind zum Beispiel im DFC lokalisierte Faktoren wie Fibrillarin (Fib), Nukleolin und die U3-snoRNA für frühe Prozessierungsschritte verantwortlich (Ochs et al. 1985, Ginistry et al. 1998, Dragon et al. 2002), während mittlere und spätere Schritte der Prozessierung im GC von Faktoren wie Nukleophosmin (NPM) oder Pescadillo1 (Pes) (Savkur und Olsen 1998, Grimm et al. 2006) übernommen werden. Die Prozessierung der rRNA und einige daran beteiligte Faktoren stehen in dieser Arbeit besonders im Vordergrund. Die bei der Ribosomenbiogenese ablaufende Kaskade der rRNA-Prozessierung ist daher zusammen mit den analysierten Prozessierungsfaktoren Fib, Pes und NPM in Abbildung 1.4 detaillierter dargestellt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1.4 Schematische Darstellung der eukaryotischen rRNA-Prozessierung.

Die Abbildung zeigt eine Kaskade von endo- und exonukleolytischen Prozessierungsschnitten. Ausgehend vom Primärtranskript, werden die reifen rRNA-Formen über mehrere Intermediate gebildet.

Die drei für diese Arbeit relevanten Prozessierungsfaktoren Fib, Pes und NPM sind, ihrem Funktionsort entsprechend, eingezeichnet.

Das co-transkriptional modifizierte 47S-Primärtranskript beinhaltet neben den Sequenzen der reifen rRNA-Formen auch so genannte Internal bzw . External Transcribed Spacer (ITS bzw. ETS) Sequenzen. Die Spacer Sequenzen werden in einer Kaskade von endo- und exonukleolytischen Spaltungen schrittweise zu den intermediären Formen 45S-, 41S-, 36S-, 32S-, 12S-rRNA prozessiert. Die reifen Formen 5.8S-, 18S- bzw. 28S-rRNA entstehen direkt als Spaltprodukte der 12S-, 36S- bzw. 32S-rRNA. Aus einer Vielzahl Prozessierungsfaktoren werden in dieser Arbeit drei (Fib, Pes, NPM) näher charakterisiert. Während Fib im GC und DFC lokalisiert und frühe rRNA-Prozessierung/Modifikation übernimmt, lokalisieren Pes und NPM im GC und führen späte Prozessierungsschritte aus. Zu beachten ist, dass die exakten Zielsequenzen der gezeigten Proteine nicht genau bekannt sind. Es ist lediglich bekannt, bei welchem Prozessierungsschritt sie wirken. Die Positionen auf den rRNA-Formen sind willkürlich eingetragen. Die einzelnen Schritte der Prozessierung und deren beteiligte Faktoren sind insbesondere bei Hefe gut verstanden und bei Dez und Tollervey 2004 beschrieben. In Hefe gibt es zwei weitgehend unabhängige, räumlich getrennte Prozessierungsmaschinerien. Während die 40S Untereinheit mit Hilfe des im DFC lokalisierten Small Subunit Processomes (SSU) reift (Dragon et al. 2002), wird die 60S Untereinheit von Large Subunit Processing/Assembly Factors im GC gebildet (Grandi et al. 2002). Beide Prozessierungsmaschinerien haben homologe Komponenten in Säugern.

Die zahlreichen, nicht-linearen und deshalb komplexen Schritte bis zum 80S Ribosom sind strikt reguliert. Das ist ein Grund für eine geringe Effizienz in der Ribosomenbiogenese. Ein Anteil von bis zu 80% (LaCava et al. 2005) der synthetisierten pre-rRNAs wird nämlich polyadenyliert (Kuai et al. 2004) und durch die Exonukleaseaktivität des Exosoms abgebaut (Allmang et al. 1999). Das Exosom ist so an der Qualitätskontrolle der Ribosomenbiogenese beteiligt. In Hefe bilden zehn exosomale „Core“-Subunits das Exosom, einen Multienzymkomplex mit Exoribonukleasefunktion. Es gibt Exosomen im Cytoplasma, im Nukleoplasma und im Nukleolus. Sie haben die Aufgabe nicht funktionsfähige RNA abzubauen. Das entsprechende Signal für den Abbau ist ein polyadenyliertes 3’-Ende der RNA. Neben mRNAs und tRNAs werden so auch rRNAs und snoRNAs degradiert. Eine wichtige Komponente des nukleolären Exosoms ist die Exonuklease Rrp6. Sie hat zwei wichtige Funktionen im Zusammenhang mit der Ribosomenbiogenese. Die 3’-Prozessierung funktionaler rRNA und den Abbau fehlerhafter rRNA, ebenfalls durch 3’->5’-Exonukleaseaktivität. Das nukleoläre Exosom benötigt zur Funktion noch einen Kofaktor, die putative RNA-Helikase Mtr4. Der Mechanismus, mit dem das Exosom die „richtige“ rRNA erkennt und entscheiden kann, ob sie prozessiert oder abgebaut werden soll, ist unbekannt. Es wird eine Art kinetisches Proofreading diskutiert. Demnach würde das Exosom ständig gezielt an einzelne rRNA- und RNP-Intermediate der Ribosomenbiogenese rekrutiert werden. Die Rekrutierung an die ribosomale Zielsequenz aktiviert die Exosomfunktion, und ist nur möglich, wenn die Ribosomenbiogenese aufgrund von fehlerhaften Komponenten verlangsamt ist. Läuft die Ribosomenbiogenese ohne zeitliche Verzögerungen, kann das Exosom nicht binden und bleibt inaktiv. Um die Spezifität der Interaktion zu gewährleisten, würden dabei sowohl die Struktur der rRNA wie auch assoziierte Proteine berücksichtigt werden müssen. Der Knockout von Rrp6 bzw. Mtr4 in Hefe führt zu einer Akkumulation polyadenylierter (Poly-A)-rRNA im Nukleolus. Interessanterweise akkumuliert die Poly-A-rRNA in scharf abgrenzbaren Domänen des Nukleolus. Das bestätigt die funktional orientierte Strukturierung des Nukleolus. Es wird vermutet, dass schadhafte rRNAs gezielt in definierten nukleolären Domänen, den „demolition sites“ akkumulieren, um die Effektivität des, ebenfalls dort lokalisierten, Exosoms zu maximieren (Houseley et al. 2006, Carneiro et al. 2007).

1.4 Weitere nukleoläre Funktionen: Biogenese nicht-ribosomaler Ribonukleoproteine

Die Ausbildung der nukleolären Strukturen ist stark von der Aktivität der rDNA-Transkription abhängig und die Ribosomenbiogenese ist die primäre Funktion des Nukleolus. Dennoch gibt es eine ganze Reihe neuerer Veröffentlichungen, die den Nukleolus an weiteren Biogenesen beteiligt sehen. Dabei handelt es sich in erster Linie um kovalente Modifikationen von RNAs und deren Einbau in Ribonukleoproteine (RNPs). Im Jahr 1995 hatten Schneiter et al. in Hefe gezeigt, dass messenger RNA (mRNA) durch den Nukleolus transportiert wird. Als anschließend die RNA-Editing -Enzyme ADAR1 und ADAR2 in HeLa-Zellen als Nukleolus-assoziiert beschrieben wurden (Desterro et al. 2003) und sich die Funktionalität von ADAR2 im Nukleolus bestätigte (Vitali et al. 2005), erkannte man, dass der Nukleolus eine Rolle beim RNA-Editing spielt. Auch der Metabolismus von transport RNAs (tRNAs) wird vom Nukleolus beeinflusst. Aus Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierungen (FISH) in Hefe weiß man, dass die RNase P-RNA, eine Komponente des pre-tRNA Prozessierungsenzyms RNase P, im Nukleolus lokalisiert (Bertrand et al. 1998). Das deutet darauf hin, dass pre-tRNAs zumindest teilweise im Nukleolus reifen oder die RNase P dort zusammengebaut wird. Weitere im Nukleolus zusammengebaute bzw. modifizierte RNPs bzw. RNAs sind das Signal Recognition Particle (Jacobsen et al. 1998, Politz et al. 2000), die RNA der Telomerase (Mitchell et al. 1999) sowie die small nuclear RNA (snRNA) der Spliceosomuntereinheit U6 (Ganot et al. 1999). Neueste Erkenntnisse sehen den Nukleolus auch am RNA-interference (RNAi) beteiligt. In Pflanzen werden nämlich endogene short interfering RNAs (siRNAs) im Nukleolus prozessiert (Pontes et al. 2006). Außerdem kann die micro RNA (miRNA) miR-206 nicht erst im Cytoplasma nachgewiesen werden, sondern kolokalisiert auch bereits im GC mit der 28S-rRNA (Politz et al. 2006).

1.5 Ribosomenbiogenese im Kontext von Zellzyklus und Proliferation

Die Ribosomenbiogenese läuft nicht unabhängig vom Zellzyklus ab. Eine wichtige Schnittstelle mit dem Zellzyklus ist die rRNA-Transkription. Um die Ribosomenzahl mit der Menge an mRNA zu koordinieren ist die Pol I-Transkription in G1 erhöht, erreicht in der S- und G2-Phase ihr Maximum und ist in der M-Phase unterdrückt (Grummt 1999). Ein Hauptregulator der Pol I-Transkription ist der Transaktivator UBF. Die Bindung von UBF an den Pol I-Promoter wird über den Phosphorylierungszustand reguliert und erhöht die Pol I-Aktivität. Die UBF-Phosphorylierung ist zellzyklusspezifisch und wird durch Serin-Threonin-Kinasen wie die Casein Kinase II (CKII), ERK oder CDK2/4 und Protein-Phosphatasen wie PP2A beeinflusst (Jantzen et al. 1990, Voit el al. 1995, Voit el al. 1999, Stefanofsky et al. 2001, Klein und Grummt 1999). Zwei weitere Regulatoren der Pol I-Transkription sind p53 und das Retinoblastoma-Tumorsuppressor-Protein Rb. Beide können die Transkription von Pol-I blockieren, indem sie die Bildung des Initiationskomplexes hemmen oder UBF direkt binden (Zhai und Comai 2000, Cavanaugh et al. 1995). Mit dem Übergang einer Zelle von der G1- in die S-Phase (Restriktionspunkt), regulieren p53 und Rb gleichzeitig den wichtigsten Zellzykluscheckpoint. Die Ribosomenbiogeneserate wird also an die gerade herrschenden zellzyklusspezifischen metabolischen Bedürfnisse der Zelle angepasst.

Eine zusätzliche Regulation der Ribosomenbiogenese erfolgt über Wachstumsfaktoren und mitogene Stimuli. Auch hier ist es das Ziel der Zelle, die energetisch hoch aufwendigen, ineffizienten Prozesse der Ribosomenbiogenese an die herrschenden Umweltbedingungen optimal anzugleichen. Erhält eine ruhende Fibroblastenzelle zum Beispiel einen mitogenen Stimulus, beginnt sie zu proliferieren. Momentan werden mehrere Pathways zur Aktivierung der Proliferation diskutiert. Gesichert scheint allerdings, dass der Wachstumsstimulus zu einer Phosphorlylierung des ribosomalen Proteins S6 führt (Thomas et al. 1979). Die Signalrezeption von Wachstumsfaktoren und mitogenen Stimuli führt zu aktivem Phosphatidylinositol-3-phosphat-(PI3K)-vermittelter Signalübertragung. PI3K aktiviert dabei unter anderem die Kinase mTOR (mammalian Target of Rapamycin). Und mTOR ist ein Aktivator der S6-Kinase S6K. Die Phosphorylierung des ribosomalen Proteins S6 durch S6K aktiviert die Translation bestimmter mRNAs über einen unbekannten Mechanismus. Es handelt sich dabei um so genannte 5’TOP mRNAs (mRNAs mit terminal oligopyrimidine tract in der 5’-nicht-translatierten Region). Deren Genprodukte wiederum sind Transaktivatoren von ribosomalen Synthese- und Translationsfaktoren (Terada et al. 1994). Durch diesen sich selbst verstärkenden Mechanismus können externe Stimuli, alleine durch kovalente Modifikation eines einzelnen ribosomalen Proteins, die Ribosomenbiogeneserate erhöhen und an die verbesserten Wachstumsbedingungen anpassen (Ruggero und Pandolfi 2003).

Die Verknüpfungen von Nukleolus und Zellzyklus wurden bisher an zwei Beispielen angesprochen. Die Ausbildung der nukleolären Struktur ist zum einen abhängig von der Zellzyklusphase. Die Struktur des Interphasenukleolus unterscheidet sich nämlich deutlich vom temporären umstrukturierten Nukleolus der M-Phase (siehe Punkt 1.2). Die Funktionalität des Nukleolus ist außerdem, wie oben am Beispiel der Ribosomenbiogenese gezeigt, zellzyklusspezifisch reguliert. Andererseits beeinflusst der Nukleolus selbst auch den Zellzyklus. Momentan werden die Interaktionen zwischen Nukleolus und Zellzyklus von einer zunehmenden Zahl von Publikationen behandelt. Häufig sind es dabei spezifisch definierbare Faktoren aus der Ribosomenbiogenese, die Einfluss auf den Zellzyklus nehmen. Der größte Erkenntnisgewinn kommt dabei wiederum aus Experimenten mit der Hefe. In der S-Phase zum Beispiel, werden einige ribosomale Synthesefaktoren für die Initiation und Elongation der DNA-Replikation benötigt (Du und Stillman 2002). Am Ende der Replikation werden die Telomere repliziert. Beim Menschen wird das von der humanen Telomerase-Reversen-Transkriptase (hTERT) übernommen. Um die reverse Transkription zellzyklusspezifisch vorzunehmen, bleibt hTERT bis zum Ende der S-Phase im Nukleolus gebunden und inaktiv (Wong et al. 2002). Als nukleolärer Bindungspartner wird Nukleolin diskutiert (Khurts et al. 2004). Die Mitose wird ebenfalls vom Nukleolus beeinflusst. Eine wichtige Rolle in der Mitose spielt zum Beispiel das Protein Cdc14. Es handelt sich um eine Phosphatase, die den Übergang von der Anaphase in die Cytokinese reguliert. Cdc14 ist während der Interphase und bis zu Beginn der Anaphase an den nukleolären Faktor Net1 gebunden und inaktiv (Visintin et al. 1999). In der Anaphase wird Net1 phosphoryliert und aktives Cdc14 frei (Azzam et al. 2004). Die aktive Form von Cdc14 reguliert die Chromosomensegregation und die Teilung des Nukleolus selbst, letztere aber nur in der Hefe (D’ Amours et al. 2004, Sullivan et al. 2004). Das Prinzip der Sequestrierung gilt auch für die Protein-Phosphatase-1g (PP1g). Sie ist während der Interphase im Nukleolus gebunden und wird als Funktionsträger bei der Chromosomenkondensation diskutiert (Vagnarelli et al. 2006). Ein weiterer ribosomaler Prozessierungsfaktor mit zellzyklusregulatorischer Funktion ist Rrp14p. Ohne Rrp14p arretieren Hefezellen in der Mitose, da eine korrekte Lokalisation des Spindelapparats verhindert wird. Rrp14p ist ein Beispiel für den Einfluss des Nukleolus auf die räumliche Organisation der Zelle (Oeffinger et al. 2007). Die sich anschließende Cytokinese ist ebenfalls von ribosomalen Faktoren reguliert. Das Depletieren des ribosomalen Prozessierungsfaktors Nop15p in Hefe führt nicht nur zu einer inhibierten Prozessierung von rRNAs der 60S Untereinheit, sondern auch zu einer blockierten Cytokinese mit großen länglichen Hefezellen, die zwar den Zellkern aber nicht den Nukleolus und das Cytoplasma getrennt haben(Oeffinger und Tollervey 2003). Zwei relativ neue Publikationen bringen den Nukleolus mit der Proteinsumoylierung in Verbindung. Die neu identifizierte Small-Ubiquitin-Like-Modifier -(SUMO)-Protease SENP5 ist vorwiegend nukleolär lokalisiert und erzeugt nach Knockdown wiederum einen deregulierten Zellzyklus als Phänotyp (Gong und Yeh 2006, Di Bacco et al. 2006). Mutiert man 60S-Synthesefaktoren in der Hefe, nimmt die Zellgröße ab (Jorgensen et al. 2002). Auch in höheren Eukaryonten führt das Depletieren von Prozessierungsfaktoren wie Bop1 oder Pes1 der 60S Komponente zur Induktion von p53, einem G1-Arrest und/oder Apoptose (Hölzel et al. 2005, Strezoska et al. 2002). Ähnliches gilt für Komponenten des SSU-Processoms (Bernstein und Baserga 2004).

Die Fülle der gezeigten Beispiele soll verdeutlichen, wie stark der Nukleolus auf zahlreiche Mechanismen der Zellzyklusregulation Einfluss nimmt. Die Zelle scheint ihre Ribosomenbiogeneserate abmessen zu können und mit dem Zellzyklus zu koordinieren. Die Möglichkeit der nukleolären Zellzykluskontrolle birgt allerdings auch Gefahren für die Zelle. Eine gestörte, in der Regel übermäßige Nukleolusfunktion ist häufig mit einer Deregulation des Zellzyklus, proliferativen Erkrankungen oder Tumoren assoziiert (siehe Teil „Diskussion“). In Tumoren ist die Proliferationsrate stark erhöht. Sie benötigen dafür eine entsprechend beschleunigte Ribosomenbiogeneserate.

1.6 Der Nukleolus als Stresssensor

Der Nukleolus konnte 2003 von Rubbi und Milner mit einem weiteren interessanten Phänomen in Verbindung gebracht werden. Sie beschreiben den Nukleolus als Stresssensor. In der Veröffentlichung ist eine ganze Reihe unterschiedlichster Stressoren (UV, Hypoxie, Hitze, Inhibitoren, NTP-Depletion und einige Zytostatika) aufgelistet, die fast alle zu einer zerstörten nukleolären Struktur und einer Induktion von p53 führen. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass die Zelle in ihrer p53-Antwort nach der Stresslokalisation differenzieren kann. Mit einem lokal begrenzten UV-Laser konnte p53 nur dann induziert werden, wenn der Nukleolus getroffen wurde. Ohne Schädigung des Nukleolus konnten auch hohe Dosen UV-Licht, das nur auf die DNA des Nukleoplasma gerichtet war, kein p53 induzieren. Ein zweites Experiment hat dieses Prinzip bestätigt. Rubbi und Milner waren in der Lage, p53 ohne jegliche Schädigung der DNA zu induzieren. Dazu wurden Antikörper gegen den nukleolären Transaktivator UBF (siehe oben) in vivo injiziert und so die Pol I-Transkription gehemmt. Neben der angesprochenen Disintegration der nukleolären Struktur und der p53-Induktion wurde ein drittes Phänomen beobachtet. Der oben angesprochene nukleoläre ribosomale Prozessierungsfaktor NPM war nach Stress häufig ins Nukleoplasma transloziert. Die NPM-Translokation ist als Marker für die Zytotoxizität einiger Reagenzien beschrieben (Chan et al. 1996).

2. Aufgabenstellung

Die Ribosomenbiogeneserate korreliert direkt mit der Proliferationsrate. Bedenkt man zusätzlich den erhöhten Bedarf an funktionalen Ribosomen in einer stark proliferierenden Zelle und den damit verbundenen energetischen Aufwand, so könnte sich die Ribosomenbiogenese als interessantes Ziel in der Chemotherapie herausstellen. Wie einleitend dargestellt, wird der Nukleolus vom Zellzyklus in seiner Struktur und Funktion beeinflusst. Gleichzeitig kann er selbst auch auf den Zellzyklus Einfluss nehmen. Wir haben gesehen, dass die Störung der nukleolären Funktion durch Mutation bzw. Depletion ribosomaler Faktoren genauso wie durch nukleolären Stress zu einer zellulären Antwort mit p53-Induktion, Zellzyklusarrest und/oder Apoptose führt. Auch zytostatischer Stress ist in der Lage p53 zu induzieren und Zellen in ihrer Proliferation zu hemmen bzw. in die Apoptose zu zwingen.

Diese interessanten Parallelen werfen die Frage auf, ob Zytostatika die Ribosomenbiogenese hemmen und so antiproliferative Wirkungen auslösen. Vorrangiges Ziel dieser Arbeit ist es deshalb die Wirkung verschiedener Zytostatika auf die Ribosomenbiogenese zu untersuchen. Dazu werden neben der rRNA-Synthese (Transkription und Prozessierung der rRNA) als Maß für die Ribosomenbiogenese auch die nukleoläre Struktur, die NPM-Lokalisation und die p53-Menge analysiert. Im einzelnen soll auf folgende Fragen eingegangen werden: (i) Lassen sich die Wirkungen auf rRNA-Transkription und rRNA-Prozessierung unterscheiden und diese gegebenenfalls einzelnen Zytostika (-klassen) zuordnen? (ii) Bei welchen Konzentrationen zeigen sich welche Wirkungen auf die rRNA-Synthese? (iii) Welche Folgen hat chemotherapeutischer Stress auf die nukleoläre Struktur und die p53-Menge in der Zelle? (iv) Wie wirken sich in Kombination eingesetzte Chemotherapeutika auf die rRNA-Synthese aus?

3. Material

3.1 Zytostatika

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Tab 3.1 Zusammenstellung gängiger Zytostatika nach D.P. Berger, R. Engelhardt (Auswahl).

Die fett gedruckten Substanzen(-klassen) wurden in dieser Diplomarbeit verwendet.

3.2 Chemikalien

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3.3 Puffer und Lösungen

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3.4 Kulturmedien

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3.5 Antikörper

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3.6 Zelllinien

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3.7 Verbrauchsmaterialien

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3.8 Geräte

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3.9 Software

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4. Methoden

4.1 Zellkultur

4.1.1 Auftauen von Zellen

Die im Stickstofftank eingefrorenen Zellaliquots (in ca. 1ml Einfriermedium) wurden möglichst rasch bei 37°C im Wasserbad aufgetaut und in 10ml vorgewärmtes Vollmedium resuspendiert und zentrifugiert (4’, 1200g). Um die Zellen anschließend zu waschen, wurde das Zellpellet zweimal in je ca. 5ml PBS resuspendiert und erneut zentrifugiert (4’, 1200g) und danach in Auftaumedium resuspendiert und in Kultur genommen.

4.1.2 Kultivieren von Zellen

Die adhärenten 2fTGH-Zellen wurden bei 37°C und 8% CO2 kultiviert. Um nicht zu dicht zu wachsen, mussten sie alle 2 bis 3 Tage gesplittet werden. Dazu wurde das Vollmedium abgenommen, die Zellen einmal mit ca. 5ml PBS gewaschen und anschließend 3’ mit Trypsin vom Plastik abverdaut. Das Trypsin wurde durch Zugabe von Vollmedium inaktiviert und 10% der Suspension in eine neue Kulturflasche überführt und gleichmäßig verteilt. Zur Vorbeugung bzw. Behandlung von Mycoplasmen-Kontaminationen wurde das Vollmedium abwechselnd mit bakteriostatisch wirksamen Antibiotika Ciprofloxacin (Handelsname Ciprobay 400) (400 mg/ml, 1:200) oder Sparfloxacin (10 mg/ml in 0.1 M NaOH gelöst, 1 zu 2000) versetzt.

4.1.3 Plattieren von Zellen

Alle Stressexperimente wurden in Mehrlochplatte (6-Loch und 12-Loch) durchgeführt. Vor dem chemotherapeutischen Stress wurde eine definierte Zellzahl (in 12-Lochplatte: 90000/Loch, in 6-Lochplatte: 230000/Loch) 24h zuvor ausplattiert. Zur Bestimmung der Zellzahl wurden 40µl der trypsinierten Zellsuspension mit 40µl Trypanblau gemischt und in einer Zählkammer nach Fuchs-Rosenthal ausgezählt. Im Mikroskop lassen sich blaue, tote Zellen von farblos erscheinenden, lebenden Zellen unterscheiden. Die Zellzahl pro 1ml Medium ergibt sich indem man die Zellzahl aus vier Großquadraten mittelt und mit dem Faktor 104 multipliziert. Daraus lässt sich das benötigte Volumen pro Ansatz ermitteln.

4.1.4 Einfrieren von Zellen

Um eine 80-90% konfluent gewachsene Kultur einzufrieren, wurde diese zunächst trypsiniert (siehe oben), die Zellsuspension anschließend zentrifugiert (4’, 1200g) und das Pellet zweimal in PBS gewaschen (siehe oben). Nach dem zweiten Waschschritt wurde das Pellet in 1ml Einfriermedium resuspendiert und in ein Einfrierröhrchen überführt. Um zu rapides Einfrieren zu vermeiden, wurden die Einfrierröhrchen mit einigen Lagen Zellstoff umwickelt, bevor sie bei -80°C eingefroren wurden.

4.2 Metabolisches Markierungsexperiment

Das Prinzip dieses Pulse-Chase -Experiments zur Messung der RNA-Synthese ist in Abbildung 4.1 dargestellt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 4.1 Schematische Darstellung der experimentellen Schritte zur Messung der rRNA-Synthese (Metabolisches Markierungsexperiment) Nachdem die Zellen in vivo zytostatisch gestresst und deren RNA markiert wurde (1), werden die Zellen lysiert, deren RNA gereinigt (2) und elektrophoretisch aufgetrennt (3). Das Gel wird anschließend getrocknet und auf eine Membran geblottet (4). Das rRNA-Muster kann anschließend autoradiographisch detektiert und quantifiziert werden (5).

4.2.1 In vivo Markierung

Zur radioaktiven Markierung der RNA wurden die 24h vorher plattierten Zellen 2h mit definierten Zytostatikakonzentrationen (in Vollmedium) behandelt und anschließend 1h mit denselben Konzentrationen (in Hungermedium) gehungert. Danach wurde die RNA, ohne zytostatischen Stress, 1h mit radioaktivem 32P (15µCi/ml in Hungermedium) markiert (Pulse). Nach weiteren 3h Inkubation (Chase) mit zytostatischem Stress (in Vollmedium) wurden die Zellen lysiert. Insgesamt wurden die Zellen also über einen Zeitraum von 6h mit Zytostatika behandelt. Alle Medien wurden vor Beginn der Markierung angesetzt, bei 4°C aufbewahrt und kurz vor Zugabe gemischt. Die Medien wurden zwischen den einzelnen Inkubationsschritten gewechselt. Alle Schritte des Markierungsexperiments wurden bei 37°C und 8% CO2 durchgeführt.

4.2.2 Isolierung der Gesamtzell-RNA

Die Reinigung der Gesamtzell-RNA wurde nach dem Protokoll des PeqLab-Gold-Total-RNA Kits durchgeführt. Zur Elution wurden 35µl DEPC-H2O verwendet. Die Menge und Reinheit der eluierten RNA wurde photometrisch überprüft.

4.2.3 Agarosegelelektrophorese

Zur Agarosegelelektrophorese wurden gleiche Volumina 2x RNA-Ladepuffer mit variablen Volumina für 1µg Gesamtzell-RNA versetzt. Die Ladevolumina wurden mit DEPC-H2O angeglichen. Die Proben wurden anschließend 12’ bei 55°C unter Schütteln denaturiert und bis zum Auftragen auf Eis gelagert. Die aufgetragenen Proben wurden 30’ bei 80V und anschließend 6h bei 110V in einem 1% Agarose-Formaldehyd-Gel mit 1x MOPS Laufpuffer aufgetrennt. Um konstante Beladung und Integrität der RNA zu überprüfen, wurde das Gel anschließend unter UV-Licht fotografiert.

4.2.4 Trocknen

Das fotografierte Gel wurde mit Saran-Folie blasenfrei beschichtet und auf einem zugeschnittenen Whatmanfilterpapier platziert. Anschließend wurde das Gel für 4h in einem Gel-Dryer mit beheiztem Deckel (80°C) und Vakuumpumpe getrocknet.

4.2.5 Autoradiographie und Quantifizierung

Nach dem Trocknen wurden die Blots in eine Expositionskassette geklebt und mit einem Autoradiographiefilm für ca. 3h bei -80°C detektiert. Anschließend wurde der Film im Cawomat 2000 IR entwickelt. Außerdem wurden die Signale quantifiziert. Dazu wurde der Blot für 5’ mit einer Image Plate beschichtet und diese anschließend via Phosphoimager ausgewertet. Die erhaltenen Signale können mit den Programmen Photoshop, Microsoft Office und AIDA verarbeitet und quantifiziert werden.

4.3 Immunfluoreszenzmikroskopie

Zur Analyse der Proteinlokalisation wurden 90000 Zellen pro Loch in einer 12-Lochplatte auf sterilisierten Glasplättchen (GS Genelinker, Programm „Str“, 120’’) für 24h bei 37°C, 8% CO2 kultiviert und anschließend für 6h mit einer definierten Konzentration Zytostatikum behandelt und fixiert. Zur Fixierung wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und für 3’ mit warmen, 4%igem PFA inkubiert. Das PFA wurde anschließend durch dreimaliges kurzes Waschen mit PBS inaktiviert und die Präparate mit 0.04% PBS-T für 7’ permeabilisiert. Danach wurden die Präparate für 45’ mit Blocklösung und anschließend mit 80µl Primärantikörpern (verdünnt in 1.5% FBS in PBS, siehe Teil „Material“) über Nacht bei 4°C in der feuchten Kammer inkubiert. Alle folgenden Schritte wurden bei Schwachlicht durchgeführt um das Ausbleichen der fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper zu vermeiden. Um die Sekundärantikörper zu binden, wurden die Präparate auf der Wippe dreimal je 3’ mit 0.04% PBS-T gewaschen und mit 80µl Sekundärantikörpern (verdünnt in 1.5% FBS in PBS, siehe Teil „Material“) für 2h dunkel in der feuchten Kammer inkubiert. Anschließend wurden die Präparate auf der Wippe erneut dreimal 3’ mit 0.04% PBS-T gewaschen und für 90’’ mit DAPI Lösung (1 mg/ml 1:10 000 in PBS) inkubiert. Die Präparate wurden erneut zweimal kurz mit PBS gewaschen und danach eingedeckelt. Dazu wurden die Glasplättchen mit einem Tropfen Mounting Medium bedeckt, auf einen Objektträger fixiert und mit Nagellack versiegelt und bei 4°C gelagert. Alle Präparate wurden mit einem Zeiss Axiovert 200M Immunfluoreszenz-Mikroskop (Objektiv 100x PH3) analysiert und mit Software von Open Lab und Microsoft ausgewertet. Je nach Kanal wurden die Präparate dabei mit folgenden Belichtungszeiten fotografiert: DAPI: 10 ms, Phasenkontrast (PhC): 10 ms, Cy3: 10-150 ms, Alexa488: 50-700 ms.

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