In den letzten Jahren kamen Hinweise auf, dass Chlorbiphenyl-Derivate von Vancomycin direkt Proteine blockieren, die an der Peptidoglycan-Synthese beteiligt sind. Einige solcher Proteine, die PBPs konnten schon in der Membranfraktion von E. coli identifiziert werden. Ziel dieser Arbeit ist es, weitere zelluläre Angriffsziele von Chlorbiphenyl-Derivaten von Vancomycin zu finden. Hierzu wurde die Methode des Activity Based Protein Profiling (ABPP) angewandt. Es wurden mehrere Sonden mit unterschiedlichem Aufbau synthetisiert und an den Proteomen der Gram-positiven Bakterien B. subtilis, Listeria welshimeri und Bacillus licheniformis sowie der Gram-negativen Bakterien Pseudomonas putida und Escherichia coli getestet.
Inhaltsverzeichnis
3 ALLGEMEINER TEIL
3.1 VANCOMYCIN
3.1.1 Entdeckung und klinische Verwendung
3.1.2 Struktur
3.1.3 Wirkmechanismus
3.1.4 Resistenzmechanismus
3.2 RESISTENZ-ÜBERWINDENDE VANCOMYCIN-DERIVATE
3.3 THEORIEN ÜBER RESISTENZÜBERWINDUNG
4 AUFGABENSTELLUNG
5 SYNTHESEPLANUNG UND SONDENDESIGN
6 ERGEBNISTEIL
6.1 SYNTHESE
6.1.1 Synthese von Sonde 1
6.1.2 Synthese von Sonde 2
6.1.3 Synthese von Sonde 3
6.1.4 Versuch der Synthese von Sonde 4
6.2 IN VITRO MARKIERUNGSEXPERIMENTE
6.2.1 Allgemeines
6.2.2 In vitro Markierung im Proteom von B. subtilis
6.2.3 In vitro Markierung im Proteom von L. welshimeri
6.2.4 In vitro Markierung im Proteom von B. licheniformis
6.2.5 In vitro Markierung im Proteom von P. putida
6.2.6 In vitro Markierung im Proteom von E. coli
7 ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT
8 AUSBLICK
9 EXPERIMENTELLER TEIL
9.1 SYNTHESE
9.1.1 Allgemeines
9.1.2 Synthese von NV-p-Bpoyl-vancomycinamid (5)
9.1.3 Synthese von NV-p-Bpoyl-C-propagylamid-vancomycinamid (Sonde 1)
9.1.4 Synthese von NV-Hexinoyl-vancomycinamid (6)
9.1.5 Synthese von Fmoc-Glycyl-4-benzophenonamid (8)
9.1.6 Synthese von N-(3-Aminopropyl)-4-benzoyl-benzamid (9)
9.1.7 Synthese von NV-Hexinoyl-C-(p-Bpoyl-1,3-diaminopropanamid)-vancomycinamid (Sonde 2)
9.1.8 Synthese von NV-(N-Hexinoyl-Phe(4-benzoyl)oyl)-vancomycinamid (Sonde 3)
9.1.9 Synthese von H2N-Phe(4-benzoyl)-propagylamid (12)
9.1.10 Versuch der Synthese von NV-Hexinoyl-C-p-Bp-amid-vancomycinamid (7)
9.1.11 Versuch der Synthese von C-(Phe(4-benzoyl)-propagylamid)amid-vancomycin (Sonde 4)
9.2 IN VITRO MARKIERUNGSEXPERIMENTE
9.2.1 Verwendete Materialien
9.2.2 Durchführung des Markierungsexperiments
Zielsetzung & Themen
Das primäre Ziel dieser Arbeit besteht darin, neue zelluläre Angriffsziele für Chlorbiphenyl-Derivate von Vancomycin durch die Anwendung der Activity-Based Protein Profiling (ABPP) Methode zu identifizieren. Dabei wird untersucht, wie spezifische Vancomycin-Sonden mit unterschiedlichem strukturellen Aufbau in verschiedenen Bakterienproteomen interagieren.
- Synthese von Vancomycin-Sonden für ABPP
- Untersuchung der Bindungsaffinität in gram-positiven und gram-negativen Bakterien
- Optimierung von Benzophenon-Crosslinkern
- Vergleich des Markierungsverhaltens in Membran- und Cytosolfraktionen
- Analyse der Spezifität mittels Hitzekontrollen und Vancomycin-Wettbewerbsexperimenten
Auszug aus dem Buch
3.1.1 ENTDECKUNG UND KLINISCHE VERWENDUNG
Vancomycin wurde erstmals 1952 durch Kornfield aus dem Organismus Amycolatopsis orientalis isoliert. Es war gegenüber den meisten gram-positiven Bakterien, einschließlich Penicillin-resistenten Staphylococci wirksam.[1] 1958 wurde es durch die FDA als Antibiotikum zugelassen und durch Eli Lilly als Hydrochlorid unter dem Handelsnamen Vancocin vermarktet.[2] Anfang der 80er Jahre nahm die Verwendung von Vancomycin drastisch zu. Grund dafür war unter anderem das immer stärkere Aufkommen vom Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA),[3] der gegenüber praktisch allen damals verfügbaren Antibiotika Resistenzen ausbildete.[4] Vancomycin wurde seitdem als das wichtigste Reserveantibiotikum gegenüber MRSA Infektionen eingesetzt.[5] 1986 tauchten erstmals Vancomycin-resistente Enterokokken (VRE)[6] und 2003 Vancomycin-resistenter Staphylococcus aureus (VRSA)[7] auf. Das Aufkommen von VRE und VRSA stellt ernsthafte Probleme für die öffentliche Gesundheit dar,[8] weshalb intensiv versucht wird, neue Antibiotika zu entwickeln.[9]
Zusammenfassung der Kapitel
3. ALLGEMEINER TEIL: Vermittelt Grundlagen über Vancomycin, dessen Wirkweise, auftretende Resistenzen und Strategien zu deren Überwindung.
4. AUFGABENSTELLUNG: Definiert die Forschungsziele, insbesondere die Identifikation neuer Angriffsziele von Vancomycin-Derivaten mittels ABPP.
5. SYNTHESEPLANUNG UND SONDENDESIGN: Beschreibt das Konzept der Sonden, inklusive Benzophenon-Crosslinker und Alkin-Tags für die Click-Chemie.
6. ERGEBNISTEIL: Dokumentiert detailliert die chemische Synthese der Sonden und die Ergebnisse der Markierungsexperimente in verschiedenen Bakterienproteomen.
7. ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT: Fasst die Herstellung der drei Sonden und die beobachteten Markierungsunterschiede in den verschiedenen Bakterien zusammen.
8. AUSBLICK: Skizziert weiterführende Schritte wie die massenspektrometrische Identifizierung der markierten Proteine und Strukturanalysen.
9. EXPERIMENTELLER TEIL: Liefert die genauen experimentellen Protokolle, verwendeten Materialien und analytischen Daten zur Synthese.
Schlüsselwörter
Vancomycin, ABPP, Activity-Based Protein Profiling, Benzophenon, Click-Chemie, Peptidoglycan, Bakterienproteom, Antibiotikaresistenz, MRSA, VRE, Synthese, Markierungsexperiment, Sonde, Massenspektrometrie, Proteinprofiling
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?
Es geht um die chemische Modifikation des Antibiotikums Vancomycin zur Identifizierung seiner zellulären Zielproteine mittels Activity-Based Protein Profiling (ABPP).
Was sind die zentralen Themenfelder?
Die zentralen Felder sind die Bioorganische Chemie, die Totalsynthese von Derivaten, sowie die biochemische Analyse der Protein-Ligand-Wechselwirkungen in verschiedenen Bakterienstämmen.
Was ist das primäre Ziel der Arbeit?
Das Ziel ist die Konstruktion und Anwendung von Vancomycin-basierten Sonden, um bakterielle Zielproteine zu markieren, die eine Rolle beim Wirkungsprozess oder bei der Resistenzüberwindung spielen.
Welche wissenschaftliche Methode wird verwendet?
Hauptsächlich wird das Activity Based Protein Profiling (ABPP) eingesetzt, ergänzt durch klassische organische Synthesemethoden und SDS-PAGE zur Visualisierung.
Was wird im Hauptteil behandelt?
Der Hauptteil umfasst die detaillierte Syntheseplanung verschiedener Sonden, deren erfolgreiche (oder versuchte) Herstellung sowie die Ergebnisse der In-vitro-Markierungstests an Membran- und Cytosolfraktionen.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Die Arbeit lässt sich durch Vancomycin, ABPP, Benzophenon-Crosslinker, Click-Chemie und Proteinmarkierung charakterisieren.
Warum war die Synthese von Sonde 4 nicht erfolgreich?
Vermutlich aufgrund sterischer Hinderung bei der Kupplung der komplexen Vorstufen am Vancomycin-Gerüst, was trotz optimierter Kupplungsprotokolle zu keinem identifizierbaren Produkt führte.
Was wurde in den Vancomycin-Verdrängungsexperimenten beobachtet?
Es konnte eine Abschwächung der Bandenintensität festgestellt werden, was beweist, dass die Sonden mit Vancomycin um die Bindestellen am Zielprotein konkurrieren.
Welchen Einfluss hatte die Proteomfraktion auf die Markierung?
Es wurden deutliche Unterschiede zwischen Cytosol- und Membranfraktionen beobachtet, wobei Membranproteine oft ein spezifischeres Markierungsmuster zeigten, was mit der bekannten Zielstruktur der PBPs korreliert.
- Citation du texte
- Igor Pochorovski (Auteur), 2008, Synthese von Vancomycinsonden für Activity-Based Protein Profiling, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/175513
